پژوهش‌های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)

باکتری شکارچی هالوباکتریووراکس جدا شده از دریای مازندران و بررسی توانایی کنترل برخی باکتری‌های گرم منفی بیماریزا

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 عضو هیات علمی دانشگاه مازندران

2 گروه میکروبیولوژی، دانشگاه مازندران

3 دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

چکیده

دلوویبریو و ارگانیسم‌های مشابه (BALOs)، گروهی از باکتری‌های شکارچی رده دلتا پروتئوباکتر هستند که برخی باکتری‌های گرم منفی را شکار می‌کنند. در این مطالعه، ویژگی‌های زیستی جدایه‌ای از BALOs دریایی و کاربرد آن در حذف باکتری‌های بیماریزا مورد بررسی قرار گرفت. باکتری شکارچی MMHZ1 به کمک روش آگار دو لایه از آب‌های ساحلی دریای مازندران جداسازی شد. از باکتری پروتئوس جدا شده از روده ماهی به عنوان طعمه استفاده شد. جدایه MMHZ1 بسیار پرتحرک و باکتریولیتیک بوده و توانایی تشکیل پلاک بر سطح محیط کشت آگار دو لایه را داشت. مطالعه تعیین توالی ژن 16S rRNA نشان داد که جدایه MMHZ1 دارای 62/99 درصد هومولوژی با هالوباکتریووراکس لیتورالیس (Halobacteriovorax litoralis) بود. همچنین خصوصیات زیستی جدایه نشان داد که pH، غلظت نمک و دمای بهینه رشد جدایه، به ترتیب 2/7، 24/0 درصد و 25 درجه سانتی‌گراد بود. نتایج نشان داد که جدایه تنها در حضور طعمه زنده رشد و فعالیت داشت در حالیکه توانایی استفاده از طعمه باکتریایی کشته شده با اتوکلاو را نداشت. همچنین بررسی طیف طعمه شامل برخی باکتری‌های گرم منفی بیماریزا نشان داد که MMHZ1 توانایی لیز 23/69 درصد از 13 طعمه مورد آزمایش را داشت. نتایج مطالعه حاضر، امکان استفاده از BALOs به منظور کنترل زیستی باکتری‌های بیماریزا را نشان داد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

A predator Halobacteriovorax isolated from the Caspian Sea and the investigation of its ability to control some gram negative pathogenic bacteria

نویسندگان [English]

  • Mojtaba Mohseni 1
  • Nazlar Mohammadhosseinzadeh 2
  • Abdolsamad Keramat 3

1 University of Mazandaran

2 Department of Microbiology, University of Mazandaran

3 Sari University of Agricultural Sciences and Natural Resources

چکیده [English]

Bdellovibrio and like organisms (BALOs) are a group of predatory bacteria of the delta-proteobacteria class, that prey on some gram negative bacteria. In this study, the biological characteristics of a marine BALOs isolate and its application in the elimination of pathogenic bacteria were investigated. A predator bacterium MMHZ1 was isolated from the coastal waters of the Caspian Sea using a double layer agar technique. Proteus that was isolated from the intestines of a fish was used as prey. The isolate was highly motile and bacteriolytic, and had the ablility to form plaque on the double layer agar medium. The 16S rRNA sequencing analysis revealed that the MMHZ1 isolate was similar to Halobacteriovorax litoralis with 99.62% homology. Biological characterizations revealed that optimum pH, salt concentration and growth temperature of isolate were 7.2, 0.24% and 25 °C, respectively. The results demonstrated that the isolate was grown only in the presence of live prey, however could not utilize the autoclaved dead bacteria as host. In addition, the study of prey range utilization including some gram negative pathogenic bacteria showed that MMHZ1 lysed 69.23% of the 13 prey tested. The result of this study demonstrated the applicability of using BALOs to biological control of pathogenic bacteria.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Predatory bacteria
  • Halobacteriovorax
  • Caspian Sea
  • biological control

باکتری شکارچی هالوباکتریووراکس جدا شده از دریای مازندران و بررسی توانایی کنترل برخی باکتری‌های گرم منفی بیماریزا

مجتبی محسنی1*، نازلار محمدحسین­زاده1 و عبدالصمد کرامت2

1 بابلسر، دانشگاه مازندران، گروه میکروبیولوژی

2 ساری، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، گروه شیلات

تاریخ دریافت: 16/10/96              تاریخ پذیرش: 10/4/97

چکیده

دلوویبریو و ارگانیسم‌های مشابه (BALOs)، گروهی از باکتری‌های شکارچی رده دلتا پروتئوباکتر هستند که برخی باکتری‌های گرم منفی را شکار می‌کنند. در این مطالعه، ویژگی­های زیستی جدایه­ای از BALOs دریایی و کاربرد آن در حذف باکتری‌های بیماریزا مورد بررسی قرار گرفت. باکتری شکارچی MMHZ1 به کمک روش آگار دو لایه از آب‌های ساحلی دریای مازندران جداسازی شد. از باکتری پروتئوس جدا شده از روده ماهی به عنوان طعمه استفاده شد. جدایه MMHZ1 بسیار پرتحرک و باکتریولیتیک بوده و توانایی تشکیل پلاک بر سطح محیط کشت آگار دو لایه را داشت. مطالعه تعیین توالی ژن 16S rRNAنشان داد که جدایه MMHZ1 دارای 62/99 درصد هومولوژی با هالوباکتریووراکس لیتورالیس (Halobacteriovorax litoralis) بود. همچنین خصوصیات زیستی جدایه نشان داد که pH، غلظت نمک و دمای بهینه رشد جدایه، به ترتیب 2/7، 24/0 درصد و 25 درجه سانتی‌گراد بود. نتایج نشان داد که جدایه تنها در حضور طعمه زنده رشد و فعالیت داشت در حالیکه توانایی استفاده از طعمه باکتریایی کشته شده با اتوکلاو را نداشت. همچنین بررسی طیف طعمه شامل برخی باکتری­های گرم منفی بیماریزا نشان داد که MMHZ1 توانایی لیز 42/71 درصد از 14 طعمه مورد آزمایش را داشت. نتایج مطالعه حاضر، امکان استفاده از BALOs به منظور کنترل زیستی باکتری­های بیماریزا را نشان داد.

واژه‌های کلیدی: باکتری‌های شکارچی، هالوباکتریووراکس، دریای مازندران، کنترل زیستی

* نویسنده مسئول، تلفن: 01135302497، پست الکترونیکی: M.Mohseni@umz.ac.ir

مقدمه

 

شکارگری میان حیوانات به طور گسترده مطالعه شده است اما در دنیای میکروارگانیسم­ها به خوبی بررسی نشده است (11، 30). شکار نقش مهمی در حفظ تعادل جمعیت ارگانیسم‌ها و شبکه غذایی در محیط زیست بر عهده دارد (25، 36). کنترل جوامع باکتریایی توسط شکار از چندین دهه پیش شناخته شده است. با این حال بزرگترین پیشرفت در کشف انواع شکارچی و نقش آن‌ها، با کشف باکتری دلوویبریو و ارگانیسم‌های مشابه یا BALOs (Bdellovibrio and Like Organisms) طی حدود 50 سال گذشته اتفاق افتاده است (31). دلوویبریو و ارگانیسم‌های مشابه شامل جنس‌های دلوویبریو (Bdellovibrio)، باکتریووراکس (Bacteriovorax) و پردی‌باکتر (Peredibacter)، گروهی از باکتری‌های شکارچی اجباری از رده دلتا پروتئوباکترها هستند. این باکتری­ها برای کسب غذا و تولید مثل، شکار خود را از میان باکتری‌های گرم منفی انتخاب می‌کنند (33). این شکارچیان اجباری، دارای چرخه زندگی منحصر به فرد شامل دو مرحله متمایز فاز حمله خارج سلولی و فاز رشد درون پری­پلاسمی هستند. در فاز حمله خارج سلولی، باکتری­های BALOs به شدت متحرک هستند که موجب تسهیل در شکارگری می­شوند. در فاز رشد درون پری‌پلاسمی، باکتری‌های شکارچی، دیواره سلولی باکتری طعمه را سوراخ می­کنند. سپس با استقرار در فضای پری‌پلاسمی، رشد کرده و تکثیر می‌یابند. در این مرحله از تهاجم، باکتری طعمه تغییر شکل داده و به حالت کروی در می‌آید که تحت عنوان دلوپلاست نامیده می‌شود. سرانجام با لیز باکتری طعمه، شکارچی‌‌های جدید رها می­شوند (26). باکتری­های شکارچی BALOs، به باکتری‌های گرم منفی حمله می‌کنند اما همه باکتری‌های گرم منفی به شکارچی‌ها حساس نیستند. همچنین در میان باکتری‌های حساس، همه آن‌ها با بازده یکسانی شکار نمی‌شوند (27). در میان باکتری‌های شکارچی BALOs، اغلب مطالعات روی دلوویبریو باکتریووروس انجام گرفته است. این باکتری گرم منفی، هوازی، متحرک با یک تاژه غلاف‌دار قطبی، با اندازه سلولی کوچک به ابعاد 5/0-2/0 در 5/2-5/0 میکرومتر می‌باشد (6 و 31). باکتری شکارچی دلوویبریو باکتریووروس به‌طور گسترده در طبیعت وجود دارد و ممکن است از منابع مختلف نظیر خاک، ریزوسفر گیاهان، آب تازه، محیط‌های دریایی و یا از روده حیوانات جدا شود (17). این باکتری شکارچی اجباری بوده و تنها متکی به تغذیه از ماکرومولکول‌های داخل سلولی باکتری­های طعمه گرم منفی جهت رشد و تولید مثل خود می­باشند. با این ‌وجود برخی سویه‌های دلوویبریو می­توانند در غیاب باکتری طعمه رشد کنند. این سویه­ها در محیط کشت غنی‌ از مواد آلی رشد کرده و به سویه‌های مستقل از طعمه معروف هستند (10).

باکتری­های شکارچی BALOs، تنوع فیلوژنی بالایی دارند و به علت ویژگی‌های متمایزی که میان BALOs ساکن خاک و آب شیرین و نیز BALOs‌ ساکن دریا (آب شور) وجود دارد، طبقه‌بندی آن‌ها در سال‌های اخیر در حال تغییر می­باشد. دو گروه ساکن خاک و دریا بر اساس تفاوت در ویژگی‌هایی از قبیل مول درصد گوانین و سیتوزین، تحمل نمک و نیز طیف طعمه در دو گروه فیلوژنی مختلف توزیع شده‌اند (3). بنابراین، BALOs دریایی از جنس دلوویبریو جدا شدند و به باکتریووراکس تغییر نام یافتند. همچنین در سیستم نامگذاری جدید، BALOs دریایی از باکتریووراکس به هالوباکتریووراکس تغییر نام یافت (15، 24).

دلوویبریو، پروکاریوت منحصر به فردی است که می‌تواند باکتری‌های گرم منفی را از بین ببرد بنابراین می­تواند به عنوان عامل ضد باکتریایی جدید در نظر گرفته شود. اگرچه تحقیقات روی باکتری‌های شکارچی هنوز هم نسبتا محدود است و عمدتا روی سویه‌های دلوویبریو باکتریووروس متمرکز شده است. اما مطالعات گسترده­ای روی کاربرد باکتری­های شکارچی BALOs در کنترل زیستی باکتری‌های بیماریزا در پزشکی، کشاورزی، دامپروری، صنعت آبزی‌پروری، صنایع غذایی، تصفیه آب و فاضلاب، کنترل و کاهش بیوفیلم‌ها انجام شده است. اتربوری و همکاران در سال 2011 نشان داد مصرف خوراکی BALOs در جوجه‌هایی با روده‏های عفونی شده توسط سالمونلا انتریکا، موجب کاهش تعداد باکتری در سکوم شده و التهاب روده ناشی از عفونت، به‏ طور قابل‏توجهی کاهش یافت (2). همچنین بویلئو و همکارانش در سال 2011 توانایی دلوویبریو باکتریووروس 109j را به عنوان جایگزین غیرشیمیایی برای درمان بیماری ملتحمه عفونی گاو تعیین کردند. نتایج این مطالعه نشان داد که تیمار اپی‌تلیال‌ ملتحمه چشم گاو با سوسپانسیون دلوویبریو باکتریووروس در مدت 12 ساعت، چسبندگی موراکسلا به سلول‌های اپی‌تلیال را تا 6 برابر کاهش داد (4). در پژوهش دیگر چو و همکاران در سال 2010 نشان دادند که دلوویبریومی‌تواند باکتری بیماریزا ائروموناس هیدروفیلا و نیز سویه‌ای از اشریشیا کلی را در ماهی‌ها متلاشی کند اما قادر به لیز باکتری‌های گرم مثبت مانند باسیلوس سوبتی‌لیس و استافیلوکوکوس اورئوس نیست. نتایج نشان داد که نرخ مرگ و میر ماهیان در آب‌های واجد دلوویبریو، کمتر از آب‌های فاقد دلوویبریو بود (7).

در پژوهش حاضر برای اولین بار باکتری شکارچی BALOs دریایی از آب دریای مازندران در سواحل بابلسر جداسازی شد. همچنین علاوه بر مطالعه برخی ویژگی­های زیستی، توانایی شکارگری جدایه علیه برخی باکتری­های گرم منفی بیماریزا، بررسی شد.

مواد و روشها

جمع‌آوری نمونه: برای جداسازی باکتری BALOs (دلوویبریو و ارگانیسم­های مشابه)، نمونه‌­های آب از سواحل دریای مازندران با مختصات جغرافیایی 36°43ˈ02.5ʺN  و 52°41ˈ13.7ʺE جمع آوری شد (23). نمونه‌ها در دمای 4 درجه سانتی‌گراد و در ظروف استریل درب‌دار به آزمایشگاه منتقل شد و بلافاصله برای غنی­سازی و جداسازی سویه‌های BALOs کشت داده شد.

غنی سازی باکتری­های شکارچی BALOs در نمونه آب دریا: برای افزایش تعداد BALOs، به نمونه­های جمع­آوری شده آب دریا مقدار 1/0 درصد عصاره مخمر افزوده شد. ارلن­ها در گرمخانه شیکردار با دمای 25 درجه سانتی­گراد و 200 دور بر دقیقه به مدت 24 تا 48 ساعت نگهداری شد. افزایش تعداد BALOs با مشاهده باکتری­های شدیدا متحرک به کمک میکروسکوپ تباینی (Optica, Italy) بررسی گردید (1).

آماده‌سازی طعمه: برای جداسازی اولیه BALOs از باکتری پروتئوس جداسازی شده از روده ماهی سفید دریای مازندران به عنوان طعمه استفاده شد. برای جداسازی باکتری طعمه، روده ماهی شسته شده با سرم فیزیولوژی استریل، در هاون چینی هموژن شد. سپس نمونه با محلول سالین استریل (9/0 درصد نمک کلرید سدیم) رقیق شد و در سطح محیط کشت تیوسولفات سیترات بایل سالت ساکاروز آگار تلقیح شد. پلیت‌ها در دمای 25 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 ساعت گرمخانه‌گذاری شد. برای شناسایی باکتری طعمه از روش­های متداول بررسی صفات مرفولوژی و آزمون­های بیوشیمیایی استفاده شد. پس از شناسایی، باکتری طعمه به محیط کشت لوریا برتانی براث (LB broth) تلقیح شد و در دمای 25 درجه سانتی‌گراد به مدت 18 ساعت گرمخانه‌گذاری شد. سپس محیط رشد به مدت 10 دقیقه در rpm 6000 سانتریفوژ گردید و رسوب سلولی پروتئوس با بافر هپس 25 میلی مولار شسته شد. غلظت باکتری شسته شده به مقدار CFU/ml 109 تنظیم گردید. طعمه آماده شده برای جداسازی BALOs در محیط کشت آگار دو لایه استفاده شد (24).

جداسازی باکتری شکارچی BALOs : به منظور جداسازی BALOs از نمونه غنی شده، محیط کشت آگاردار دو لایه تهیه شد (1، 12). ابتدا محیط کشت نوترین براث سالین (Nutrient broth saline) شامل 5 گرم پپتون، 5 گرم کازئین هیدرولیز شده، 3 گرم عصاره گوشت و 1 گرم عصاره مخمر در یک لیتر محلول نمکی تهیه شد. محلول نمکی (گرم بر لیتر) شامل 24 گرم کلرید سدیم، 7/0 گرم کلرید پتاسیم و 7/3 گرم سولفات منیزیم 7 آبه بود. سپس با افزودن آب مقطر به محیط کشت به نسبت 1به 10، محیط کشت نوترین براث سالین رقیق شده (Diluted nutrient broth saline) آماده شد. محیط کشت دو لایه با افزودن 6/0 درصد آگار برای لایه بالا و 8/0 درصد آگار برای لایه پایین به محیط کشت نوترین براث سالین رقیق شده تهیه شد. pH محیط کشت در 2/0±2/7 تنظیم شد و در دمای 121 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه اتوکلاو گردید. پس از خنک شدن دمای محیط­های کشت به حدود 50 درجه سانتی­گراد، حجم 6 میلی‌لیتر کلرید کلسیم 5/0 مولار و حجم 33/3 میلی‌لیتر کلرید منیزیم 6 آبه 6/0 مولار استریل شده با فیلتر سرسرنگی 2/0 میکرومتر به محیط­های کشت اضافه شد. لایه آگار پایین در پلیت استریل ریخته شد. برای لایه بالا در محیط کشت دو لایه، ابتدا رقت‌های 1-10 تا 6-10 از نمونه­های غنی شده تهیه شد. سپس حجم 400 میکرولیتر از رقت­های مختلف نمونه غنی شده و حجم 100 میکرولیتر باکتری طعمه به 5/4 میلی­لیتر محیط کشت نوترین سالین رقیق شده حاوی 6/0 درصد آگار استریل در دمای 50 درجه سانتی­گراد افزوده شد. لایه بالا بلافاصله بر سطح لایه پایین سفت شده در پلیت ریخته شد. پس از سفت شدن لایه آگار بالا، پلیت‌ها به مدت 7 روز در دمای 25 درجه سانتی‌گراد گرمخانه‌گذاری شدند. پلاک­های ظاهر شده پس از 48 تا 72 ساعت در سطح محیط کشت آگار دو لایه، به عنوان پلاک BALOs جمع آوری شدند و تا انجام مطالعات بعدی در دمای 4 درجه سانتی­گراد نگهداری شدند (12).

آماده‌سازی BALOs فاز حمله: برای آماده‌سازی BALOs فاز حمله، پلاک تشکیل شده روی محیط رشد آگار دو لایه انتخاب شد و به 50 میلی‌لیتر محیط کشت نوترین براث سالین رقیق شده حاوی 5/0 میلی‌لیتر طعمه پروتئوس منتقل شد. ارلن به مدت 24 ساعت و با دور rpm200 در دمای 25 درجه سانتی‌گراد گرمخانه‌گذاری گردید. سپس جهت حذف باکتری‌های طعمه، محتویات محیط رشد بالا با دور g5000 و به مدت 20 دقیقه سانتریفوژ گردید. برای حذف باکتری‌های طعمه باقی‌مانده، مایع رویی دو بار توسط فیلتر سر سرنگی 45/0 میکرومتر صاف شد. برای جمع آوری BALOs ، مایع صاف شده مجددا با دور g27000 به مدت 20 دقیقه سانتریفوژ شد. سپس رسوب سلولی BALOs جمع آوری شده با یک میلی‌لیتر بافر هپس مخلوط شد. جدایه باکتریایی BALOs ، تا انجام مراحل بعدی آزمایش، در گلیسرول 85 درصد و دمای 85- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد (12، 16).

تعیین فعالیت لیتیکی باکتری‌ شکارچی BALOs : به منظور تعیین فعالیت لیتیکی جدایه شکارچی علیه باکتری طعمه پروتئوس، از باکتری جدا شده فاز حمله استفاده شد. حجم یک میلی­لیتر لیزات حاوی جدایه شکارچی به 10 میلی­لیتر باکتری طعمه پروتئوس شسته شده در بافر هپس، تلقیح شد و در گرمخانه شیکردار با دمای 25 درجه سانتی­گراد و 200 دور در دقیقه قرار داده شد. برای پایش فعالیت لیتیکی جدایه شکارچی، جذب نوری سوسپانسیون در فواصل زمانی 12 ساعت و در طول موج 600 نانومتر سنجیده شد. فعالیت لیتیکی جدایه شکارچی BALOs با کاهش جذب نوری سوسپانسیون بررسی شد (12، 24).

استخراج نوکلئیک اسید، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ژن 16S rRNA و رسم درخت فیلوژنی: شناسایی جدایه BALO بر اساس تعیین توالی ژن16S rRNA و شناسایی مولکولی جدایه انجام شد. برای استخراج نوکلئیک اسید ژنومی BALO در فاز حمله از روش استاندارد بید بیتر استفاده شد (22). در این روش با استفاده از دترجنت هگزادسیل‌تری‌متیل‌آمونیوم بروماید (CTAB) دیواره سلولی باکتری‌ها متلاشی شد. سپس از محلول فنل:کلروفرم:ایزوآمیل‌الکل (به نسبت 1:24:25) برای حذف پروتئین‌ها و قندها استفاده شد. همچنین از محلول 30 درصد پلی‌اتیلن‌گلیکول به منظور رسوب نوکلئیک اسید استفاده گردید. در نهایت برای حذف سایر ناخالصی‌ها از اتانول خالص و سرد استفاده شد. نوکلئیک اسید استخراج شده در 40 میکرولیتر آب مقطر استریل ریخته شد و تا انجام آزمایش بعدی در دمای 20- درجه سانتی­گراد نگهداری شد. کیفیت DNA استخراج شده، با استفاده از الکتروفورز ژل آگاروز 8/0درصد رنگ‌آمیزی شده با اتیدیوم‌ بروماید مورد بررسی قرار گرفت.

برای تکثیر ژن 16S rRNAاز واکنش زنجیره‌ای پلیمراز به کمک پرایمرهای اختصاصی دلوویبریو استفاده شد (5، 13، 19). مشخصات الیگونوکلئوتید پرایمرهای اختصاصی دلوویبریو در جدول 1 نشان داده شده است. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز برای‌ تکثیر ژن 16S rRNA مطابق برنامه زیر انجام شد. دمای واسرشت اولیه 95 درجه سانتی‌گراد و به مدت 3 دقیقه بود. سپس 35 چرخه شامل یک دقیقه دمای 94 درجه سانتی‌گراد، 45 ثانیه دمای 57 درجه سانتی‌گراد و یک دقیقه دمای 72 درجه سانتی‌گراد انجام شد. برای تکمیل سنتز DNA، دمای واکنش به مدت 10 دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد نگه داشته شد. درستی انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ژن‌ 16S rRNA، با الکتروفورز ژل آگاروز 8/0 درصد رنگ آمیزی شده با اتیدیوم برماید تأیید شد.

برای تعین توالی ژن‌ 16S rRNA، محصول واکنش زنجیره‌ای پلیمراز به کمک کیت تخلیص GeneJetPCR (Thermo Scientific, Lithuania) خالص‌سازی گردید. سپس توالی ژن توسط شرکت ماکروژن (Macrogen) کره جنوبی تعیین شد. نتایج توالی نوکلئوتیدها مجددا به کمک نرم‌افزار Chromas Lite (2.01) بررسی شد. میزان تشابه توالی نوکلئوتیدهای ژن 16S rRNAجدایه BALO به کمک BLAST با توالی‌های ثبت شده در پایگاه اطلاعاتی ژنومی GenBank و EzTaxon-e مورد مقایسه قرار گرفت. تحلیل فیلوژنی جدایه BALO  با باکتری‌های نزدیک به آن به کمک نرم‌افزار ClustalX (نسخه 2) صورت پذیرفت. درخت فیلوژنی توالی ژن 16S rRNAجدایه با توالی حاصل از جستجو در پایگاه اطلاعاتی GenBank و EzTaxon-e به کمک نرم‌افزار MEGA5 و با الگوریتم Maximum likelihood و Neighbour joining، رسم گردید. بررسی اعتبار شاخه با الگوریتم bootstrap analysis و با 1000 بار نمونه‌گیری انجام شد (14).

 

جدول1- مشخصات پرایمرهای اختصاصی دلوویبریو برای واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ژن 16S rRNA(F، پرایمر رفت؛ R، پرایمر برگشت).

پرایمر

توالی (5′→3′)

درصد

GC

دمای اتصال پرایمر (درجه سانتی‌گراد)

محصول PCR (جفت نوکلئوتید)

63F

CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC

4/52

57

حدود 800

842R

CGA TCA CTG AAG GGG TCA

6/52

 


شماره دستیابی ژنی توالی 16S rRNA جدایه BALO در بانک اطلاعاتی: توالی ژن 16S rRNA باکتری شکارچی BALO جداشده در این پژوهش به بانک ژنی NCBI ارسال شد و به شماره دستیابی ژنی MG740791 ثبت شد.

بررسی طیف طعمه‌ای جدایه BALO : توانایی شکارگری BALOs، بر اساس توانایی آن‌ها در ایجاد هاله لیتیک شفاف روی کشت چمنی طعمه‌ها، در آگار دو لایه سنجیده شد. تعداد 14 سویه باکتریایی تهیه شده از بانک­های میکروبی معتبر و نیز موجود در آزمایشگاه تحقیقاتی میکروبیولوژی محیطی و تنوع زیستی دانشگاه مازندران به عنوان طعمه استفاده شد. باکتری­های طعمه شامل پروتئوس MMHZ21، اشریشیا کلی، سراشیا مارسسنس، ریزوبیوم ملیلوتی، انتروباکتر آئروژنز، سیتروباکتر فروندی، سودوموناس آئروژینوزا، سالمونلا تیفی، شیگلا سونئی، شیگلا فلکسنری، کلبسیلا پنومونیه، شوانلا ME1، ویبریو MM1 بود. سویه‌های باکتریایی طعمه در محیط کشت مایع LB به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی­گراد گرمخانه گذاری شد. سپس حجم 400 میکرولیتر BALOs فاز حمله در محیط کشت نوترین براث سالین رقیق شده به همراه حجم 100 میکرولیتر باکتری طعمه شسته شده با بافر هپس (CFU/ml 108) با 5/4 میلی‌لیتر محیط کشت لایه بالا آگاردار مذاب مخلوط گردید و روی لایه آگار پایین آماده شده افزوده شد. پلیت­های‌ محیط کشت آگاردار دو لایه در دمای 25 درجه سانتی‌گراد و به مدت حداکثر 10 روز گرمخانه‌گذاری شد و ظاهر شدن پلاک به طور روزانه بررسی شد. همچنین از کشت باکتری طعمه بدون BALO و نیز کشت BALO بدون طعمه، به عنوان کنترل منفی استفاده شد. حساسیت باکتری طعمه نسبت به شکارگری BALO با ظاهر شدن پلاک‌های شفاف روی پلیت‌های آگار دو لایه ارزیابی شد. تمام آزمایش­ها با سه بار تکرار انجام شد (18، 24).

تاثیر غلطت نمک بر رشد BALOs : برای بررسی تاثیر شوری بر رشد جدایه و توانایی تشکیل پلاک، محیط کشت آگار دو لایه غلظت‌های مختلف نمک شامل 0، 1/0، 24/0، 5/0، 4/2، 0/3 و 5/6 درصد کلرید سدیم تهیه شد. پلیت­ها به مدت 7 روز در دمای 25 درجه سانتی­گراد گرمخانه گذاری شد و تاثیر شوری بر فعالیت جدایه با تشکیل و یا عدم تشکیل پلاک ارزیابی شد. همچنین برای بررسی کمی تاثیر شوری بر رشد جدایه، کاهش تعداد طعمه سنجیده شد. غلظت­های مختلف کلرید سدیم ذکر شده به محیط کشت نوترین براث سالین رقیق شده با 4/7 pH، افزوده شد. سپس حجم یک میلی‌لیتر جدایه فاز حمله BALO و یک میلی‌لیتر طعمه پروتئوس جدا شده از دریا به محیط کشت اضافه گردید. ارلن­ها در دمای 25 درجه سانتی‌گراد و با دور rpm 250 به مدت 12 ساعت گرمخانه‌گذاری شد. برای ارزیابی تاثیر نمک بر رشد جدایه BALO، کاهش تعداد باکتری طعمه به روش اندازه گیری جذب نوری محیط رشد در طول موج 600 نانومتر سنجیده شد (18).

تاثیر وضعیت حیات باکتری طعمه بر فعالیت جدایه BALO : برای بررسی رشد و فعالیت جدایه BALO در حضور طعمه غیرزنده، باکتری پروتئوس در انتهای مرحله رشد لگاریتمی در دمای 121 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه اتوکلاو گردید. سپس حجم 400 میکرولیتر کشت تازه BALO فاز حمله و نیز 100 میکرولیتر باکتری طعمه پروتئوس زنده و یا کشته شده با حرارت اتوکلاو به طور مجزا به محیط کشت آگار دو لایه تلقیح شد. پلیت­ها به مدت 10-7 روز در گرمخانه 25 درجه سانتی­گراد نگهداری شدند و تشکیل پلاک بررسی شد (18).

سنجش تراکم تعداد BALO در آب دریا: برای اندازه گیری تراکم سلولی BALO در نمونه آب دریای مازندران، از روش سنجش پلاک در سطح آگار استفاده شد. نمونه آب ساحلی جمع‌آوری شده، بلافاصله به آزمایشگاه منتقل شد و از رقت‌های مختلف به روش کشت آگار دو لایه حاوی طعمه باکتریایی مناسب، کشت داده شد. پلاک­های ایجاد شده پس از 3 الی 7 روز گرمخانه گذاری شمارش شد. هر پلاک تشکیل شده نشانه آلودگی باکتری طعمه توسط یک باکتری شکارچی BALO است. تعداد باکتری شکارچی BALO در نمونه آب دریا بر حسب PFU/mL سنجیده شد (34).

نتایج

جداسازی و شناسایی باکتری طعمه به کمک مشخصات مرفولوژی و فیزیولوژی: برای شناسایی جدایه‌، علاوه بر واکنش گرم، آزمون‌های بیوشیمیایی مطابق جداول شناسایی کتاب سیتماتیک باکتریولوژی برگی شامل احیای نیترات، اکسایش- تخمیر گلوکز (OF)، اکسیداز، اندول، حرکت، سولفید هیدروژن، سیترات وکاتالاز انجام شد. نتایج بررسی مشخصات مرفولوژی و فیزیولوژی در جدول 2، نشان داد که جدایه طعمه MMHZ21 متعلق به جنس پروتئوس بود.

جداسازی و بررسی فعالیت لیتیکی باکتری شکارچی BALO : برای افزایش تعداد باکتری‌های شکارچی دریایی،   نمونه‌های   جمع آوری   شده  از  آب  دریای

مازندران در حضور عصاره مخمر غنی سازی شد.

 

جدول 2- ویژگی­های مرفولوژی و فیزیولوژی جدایه‌ طعمه

جدایه طعمه

مرفولوژی کلنی و سلولی

 

آزمون‌های بیوشیمیایی

رنگ کلنی

حاشیه کلنی

شکل کلنی

شکل باکتری

واکنش گرم

 

احیای نیترات

OF

اکسیداز

اندول

حرکت

H2S

سیترات

کاتالاز

MMHZ21

زرد

صاف

نرم و براق

میله‌ای کوتاه

گرم منفی

 

+

+

-

+

+

+

+

+

 

 

برای جداسازی باکتری شکارچی BALO، محیط رشد همراه با طعمه در محیط کشت آگار دو لایه رشد داده شد. برای تامین طعمه از باکتری پروتئوس که قبلا از روده ماهی صید شده دریای مازندران جداسازی شده بود، استفاده شد. اولین پلاک­ها که نشانه حضور باکتری شکارچی BALO است پس از 5 روز گرمخانه گذاری در 25 درجه سانتی گراد ظاهر شد. پلاک اولیه به صورت دایره شفاف با قطر کمتر از 5/0 میلی متر بود. با ادامه گرمخانه گذاری قطر پلاک­ها افزایش یافت به طوری که پس از روز هفتم تا دهم گرمخانه گذاری، قطر پلاک­ها به حداکثر 5 میلی­متر افزایش یافت (شکل 1). برای تخلیص و جداسازی باکتری شکارچی، یک پلاک با قطر 5 میلی­متر از سطح آگار دو لایه جدا شد و به محیط کشت نوترین براث سالین رقیق شده منتقل گردید. پس از 12 ساعت گرمخانه گذاری، لیزات حاوی باکتری شکارچی شناور تهیه شد. برای مشاهده باکتری شکارچی، لیزات به کمک میکروسکوپ تباینی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج مشاهدات میکروسکوپی حضور سلول­های بسیار کوچک و شدیدا متحرک شکارچی در حضور باکتری میله­ای شکل طعمه (پروتئوس) را تایید کرد. باکتری شکارچی BALO دریازی با نام جدایه MMHZ1 نامگذاری شد. بررسی مرفولوژی پلاک‌های متعلق به جدایه MMHZ1 در سطح محیط کشت آگار دو لایه نشان داد پلاک­های اولیه به صورت مدور، با حاشیه صاف، بسیار شفاف، ریز و سوزنی با قطر یک میلی‌متر در روز سوم گرمخانه‌گذاری ظاهر شدند. اندازه پلاک‌ها با گذشت زمان گسترش یافت به طوری که در روز هفتم گرمخانه‌گذاری به قطر پنج میلی‌متر رسید (شکل 1).

همچنین فعالیت لیتیکی باکتری شکارچی در سوسپانسیون حاوی باکتری طعمه پروتئوس بررسی شد. نتایج نشان داد جدایه BALOs دریایی، توانایی حمله و لیز طعمه را در محیط مایع داشت. سنجش جذب نوری در طول موج 600 نانومتر نشان داد کاهش جذب نوری سوسپانسیون پس از تلقیح لیزات آغاز شد و پس از 24 ساعت از 843/0 به 369/0 کاهش یافت. با ادامه گرمخانه گذاری، کاهش جذب نوری ادامه یافت به طوری که پس از 66 ساعت به 283/0 رسید (شکل 2).

شناسایی مولکولی و رسم درخت فیلوژنی جدایه MMHZ1 : برای شناسایی مولکولی جدایه، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ژن 16S rRNA به کمک پرایمرهای اختصاصی دلوویبریو انجام شد. نتایج بررسی الکتروفورز ژل آگاروز در شکل 3 نشان می­دهد محصول واکنش زنجیره­ای پلیمراز مربوط به بخشی از ژن 16S rRNA جدایه MMHZ1 با اندازه حدود 800 جفت باز بدست آمد. پس از تعیین توالی نوکلوتیدها، با انجام BLAST و مقایسه اطلاعات موجود در بانک ژنی EzTaxon و NCBI، درصد هومولوژی جدایه MMHZ1 با سایر باکتری‌ها در بانک اطلاعاتی ژنی به دست آمد.

 

الف)

ب)

     

شکل 1- پلاک تشکیل شده توسط باکتری شکارچی MMHZ1 جدا شده از آب دریای مازندران در سطح محیط کشت آگار دولایه پس از 5 روز گرمخانه گذاری (الف) و ادغام پلاک­ها با گسترش اندازه آنها پس از 7 روز گرمخانه گذاری (ب). پلاک­های فراوان به صورت دوایر کوچک و شفاف در تصاویر مشاهده می­شود (نوک پیکان).


شکل 2- فعالیت لیتیکی جدایه MMHZ1 علیه طعمه باکتریایی پروتئوس در دمای 25 درجه سانتی­گراد از طریق سنجش کاهش جذب نوری طعمه پروتئوس (▲) و جدایه شکارچی همراه با طعمه پروتئوس (n) در طول موج 600 نانومتر.

 

نتایج آنالیز تطبیقی توالی جدایه با اطلاعاتی که قبلا وجود داشت، نشان داد که جدایه MMHZ1، دارای 62/99 درصد هومولوژی با هالوباکتریووراکس لیتورالیس (Halobacteriovorax litoralis) بود. برای رسم درخت فیلوژنی، توالی ژن 16S rRNA باکتری‌های مشابه و جدایه MMHZ1 به کمک نرم‌افزار ClustalX، هم‌ردیف‌سازی شد و درخت فیلوژنی آن به روش Neighbor joining و به کمک نرم‌افزار Mega5 رسم شد. موقعیت فیلوژنی جدایه با سایر باکتری‌ها در شکل 4 نشان داده شده است.

 

 

750 جفت باز

2     1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 3. الکتروفورز ژن 16S rRNA جدایه شکارچی MMHZ1 به کمک پرایمرهای اختصاصی دلوویبریو (ردیف 2) با استفاده از ژل آگاروز رنگ شده با اتیدیوم برماید و خط کش ژنی یک کیلو جفت باز (ردیف 1).

طیف طعمه‌ای جدایه و تاثیر غلظت نمک بر رشد MMHZ1 : توانایی شکارگری جدایه‌ MMHZ1 روی 14 باکتری گرم منفی به عنوان طعمه به روش بررسی لیز سلولی روی محیط کشت آگار دو لایه مطالعه شد. توانایی جدایه در استفاده از طعمه­های مختلف باکتریایی با تشکیل پلاک هاله لیتیک به دو صورت شفاف و یا مات گزارش شد. نتایج جدول 3 نشان داد که جدایه MMHZ1 توانایی شکار اغلب طعمه­های باکتریایی را داشت به طوری که 42/71 درصد از طعمه­ها، لیز شده بودند. همچنین از میان 10 طعمه باکتریایی لیز شده، تعداد 6 پلیت واجد پلاک شفاف بودند و نیز پلاک­های 4 پلیت دیگر به صورت مات ظاهر شدند. نتایج نشان داد که جدایه MMHZ1 توانایی شکار هر دو سویه اشریشیا کلی را داشت اما تنها پلاک­های تشکیل شده در پلیت حاوی سویه اشریشیا کلی دریایی، به صورت شفاف بود.

 

شکل 4- دندروگرام توالی ژن 16S rRNAباکتری شکارچی دریایی MMHZ1 که به جنس هالوباکتریووراکس قرابت نشان داد. اعداد ذکر شده در محل انشعاب نشانگر درصد نمونه‌گیری bootstrap از 1000 نمونه است.

 Halobacteriovorax sp. MMHZ1 (MG740791)

 Halobacteriovorax litoralis (AF084859)

 Bacteriovorax sp. NF2 (EF092442)

 Halobacteriovorax marinus (NR102485)

 Bdellovibrio starrii (AF084852)

 Bacteriovorax stolpii (AJ288899)

 Bacteriovorax stolpii AY094131

 Bdellovibrio exovorus (NR102876)

 Bdellovibrio bacteriovorus (AF148939)

 Bdellovibrio bacteriovorus (NR027553)

 Bdellovibrio bacteriovorus (AF263832)

 Bdellovibrio bacteriovorus (EU884925)

 Desulfovibrio gracilis (NR118835)

 Desulfovibrio desulfuricans (DQ450463)

 Desulfuromusa kysingii (NR029275)

 Myxococcus xanthus (NR043945)

 Bacillus megaterium (KJ721207)

100

100

77

100

100

100

99

64

97

50

100

82

63

54

0.02

 

همچنین تاثیر شوری بر رشد و فعالیت شکارگری جدایه MMHZ1 در حضور غلظت­های صفر تا 5/6 درصد نمک کلرید سدیم بررسی شد. نتایج نشان می­دهد جدایه شکارچی توانست باکتری طعمه پروتئوس را در حضور 1/0 تا 0/3 درصد کلرید سدیم متلاشی کند (جدول 4). اما توانایی رشد و تشکیل پلاک توسط MMHZ1 در غیاب نمک و نیز در حضور غلظت 5/6 درصد نمک کلرید سدیم و بیشتر از آن، مشاهده نشد. همچنین نتایج تاثیر شوری بر رشد و فعالیت جدایه به کمک سنجش کاهش جذب نوری محیط رشد نوترین براث سالین رقیق شده در شکل 5 نشان می­دهد بهترین فعالیت شکارگری MMHZ1 در حضور 24/0 درصد کلرید سدیم مشاهده شد. کمترین کاهش جذب نوری محیط رشد در حضور 0/3 درصد کلرید سدیم مشاهده شد.

 

جدول 3- طیف طعمه‌ای جدایه شکارچی MMHZ1 روی 14 طعمه باکتریایی از طریق لیز سلولی و تشکیل پلاک. (+) شکار طعمه و (-) عدم شکار طعمه.

طعمه

منبع

لیز طعمه

شفافیت پلاک

پروتئوس MMHZ21

روده ماهی/ آزمایشگاه میکروبیولوژی

+

شفاف

اشریشیا کلی

PTCC 1533

+

مات

اشریشیا کلی

نمونه دریا/ آزمایشگاه میکروبیولوژی

+

شفاف

سراشیا مارسسنس

PTCC 1621

+

مات

ریزوبیوم ملیلوتی

PTCC 1684

+

شفاف

انتروباکتر آئروژنز

PTCC 1221

-

-

سیتروباکتر فروندی

ATCC 43864

-

-

سودوموناس آئروجینوزا

PTCC 1074

+

مات

سالمونلا تیفی

PTCC 1609

+

شفاف

شیگلا سونئی

ATCC 9290

+

شفاف

شیگلا فلکسنری

ATCC 12022

-

-

کلبسیلا پنومونیه

PTCC 1290

+

شفاف

شوانلا ME1

محسنی و اکرامی (21)

+

مات

ویبریو MM1

محسنی و معقول (23)

-

-

 

جدول 4- توانایی تشکیل پلاک توسط جدایه MMHZ1 روی محیط کشت آگار دو لایه در حضور غلظت‌های مختلف نمک کلرید سدیم.

غلظت NaCl (درصد)

0/0

1/0

5/0

4/2

0/3

5/6

تشکیل پلاک

-

+

+

+

+

-

                                                                                                                   


تاثیر وضعیت حیات باکتری طعمه بر رشد جدایه شکارچی : تاثیر طعمه زنده و یا طعمه کشته شده با حرارت اتوکلاو بر رشد و فعالیت جدایه شکارچی MMHZ1 به طور جداگانه در محیط کشت آگار دو لایه بررسی شد. نتایج بررسی ایجاد پلاک در محیط رشد پس از 10-7 روز گرمخانه گذاری نشان داد جدایه MMHZ1 تنها در حضور باکتری طعمه زنده رشد کرد و با لیز باکتری طعمه، پلاک ظاهر شد. اما با استفاده از باکتری طعمه کشته شده با حرارت، هیچ پلاکی ظاهر نشد.

سنجش تعداد باکتری­های شکارچی BALOs در آب دریای مازندران: تعداد باکتری­های شکارچی در آب دریا به روش سنجش پلاک ایجاد شده در سطح محیط کشت آگار دو لایه و حاوی طعمه پروتئوس، شمارش شد. برای شمارش پلاک، غلظت­های مختلف نمونه آب تا غلظت 4-10 تهیه شد و به محیط کشت آگار دو لایه تلقیح شد. نتایج نشان داد پس از 7 روز گرمخانه گذاری، هیچ پلاکی در نمونه­های آب رقیق شده، تشکیل نشد. تنها با تلقیح نمونه آب دریا رقیق نشده، پلاک ظاهر شد. نتایج نشان داد اولین پلاک‌ها به تعداد دو عدد و به قطر 5/0 میلی‌متر در روز سوم گرمخانه‌گذاری ظاهر شد. با افزایش زمان گرمخانه گذاری علاوه بر گسترش اندازه قطر پلاک­های اولیه، تعداد پلاک‌ها نیز افزایش یافت. به طوری که پس از هفت روز گرمخانه گذاری تعداد نهایی پلاک­ها به PFU/mL 350 رسید. شمارش تعداد پلاک­ها تا روز دهم گرمخانه گذاری ادامه یافت اما علیرغم افزایش قطر پلاک­ها، تغییری در تعداد پلاک­ها رخ نداد.

 

 

شکل 5- تاثیر غلظت نمک بر رشد و فعالیت جدایه MMHZ1 از طریق کاهش تعداد باکتری طعمه پروتئوس در غلظت‌های مختلف نمک کلرید سدیم پس از 12 ساعت رشد در دمای 25 درجه سانتی‌گراد و 4/7 pH. محیط کشت نوترین براث سالین رقیق شده بدون حضور جدایه شکارچی (■) و با حضور جدایه شکارچی (■).


بحث

دلوویبریو و ارگانیسم‌های مشابه (BALOs)، باکتری‌های شکارچی کوچک هستند که به فضای پری‌پلاسمی سایر باکتری‌های گرم منفی حمله می‌کنند و با متلاشی کردن آن­ها موجب از بین رفتن باکتری طعمه می‌شوند. این مرحله داخل سلولی از چرخه زندگی، شرایطی را برای باکتری شکارچی فراهم می‌کند تا بدون هیچ رقابتی از محتویات سلولی باکتری طعمه تغذیه کند. فعالیت شکارگری و لیتیک آن‌ها موجب می­شود تا جمعیت باکتری‌های بیماریزا را به سرعت کاهش دهد. فعالیت طعمه خواری دلوویبریوها، سبب شده است که به عنوان ابزار اکولوژیکی جهت برنامه‌های کاربردی کاهش یا تعدیل جمعیت باکتریایی بیماریزا در نظر گرفته شوند. تعیین توالی کامل ژنوم دلوویبریو باکتریووروس HD100 با اندازه 8/3 میلیون جفت باز، فرصت ارزیابی پتانسیل درمانی این باکتری‌های شکارچی را فراهم کرده است و نشان می‌دهد که علیرغم وابستگی انگل گونه دلوویبریوها به میزبان خود، تعداد زیادی از ژن‌های خود را همانند سایر باکتری‌های انگلی از دست نداده‌اند. رابطه دلوویبریو با سایر باکتری‌ها، بیشتر برای تغذیه است. در اغلب موارد سلول میزبان را در طی ۱۵ دقیقه می‌کشد و رابطه انگلی طولانی مدتی را با میزبان ایجاد نمی‌کند. دریای مازندران دارای تنوع زیستی گسترده‌ای از میکروارگانیسم‌ها می‌باشد (21، 23). لذا در این پژوهش جدایه باکتریایی MMHZ1 با فعالیت شکارگری و توانایی از بین بردن باکتری‌های گرم منفی به عنوان طعمه، به روش آگار دو لایه از آب دریای مازندران جداسازی شد. نتایج پژوهش حاضر نشان داد که جدایه شدیدا متحرک MMHZ1 دارای توانایی متلاشی کردن باکتری‌های طعمه و تشکیل پلاک بود. از آنجا که جمعیت باکتری­های شکارچی در نمونه­های طبیعی پایین است، لذا از روش غنی‌سازی اولیه نمونه آب شور استفاده شد. نتایج نشان داد که غنی‌سازی نمونه آب با افزودن 1/0 درصد عصاره مخمر، موجب افزایش تعداد باکتری­های شکارچی و تسهیل در جداسازی MMHZ1 شد. در پژوهش­های مشابه از روش غنی‌سازی برای افزایش تعداد BALOs استفاده شد و باکتری طعمه مستقیما به محیط رشد نمونه حاوی باکتری شکارچی افزوده شد (20، 34). اما در تحقیق حاضر از روش غنی‌سازی معرفی شده توسط آمات و همکاران (1989) استفاده شد (1). در این روش باکتری‌های بومی همان زیستگاه افزایش می­یابند. به این ترتیب با افزایش تعداد طعمه در 24 ساعت اول غنی سازی، طعمه کافی برای باکتری­های شکارچی فراهم می­شود که به دنبال آن جمعیت باکتری­های شکارچی پس از دو الی پنج روز افزایش می­یابد.

در این پژوهش پلاک‌های حاصل از فعالیت باکتری شکارچی، پس از 5-3 روز گرمخانه‌گذاری در سطح محیط کشت آگار دو لایه مشاهده شد. اولین پلاک‌ها در روز سوم گرمخانه‌گذاری با قطر اولیه کمتر از 5/0 میلی‌متر ظاهر شد و اندازه قطر پلاک‌ها با گذشت زمان گسترش یافت به طوری که در روز هفتم گرمخانه‌گذاری به حداکثر 5 میلی‌متر رسید. اگرچه باکتریوفاژها نیز توانایی تشکیل پلاک را دارند اما پلاک‌های فاژی پس از 24 ساعت ظاهر می­شوند و قطر آنها با ادامه گرمخانه گذاری افزایش نمی­یابد. همچنین با کشت لیزات صاف شده پلاک­ها (به کمک فیلتر 22/0 میکرومتر) در محیط کشت آگار دو لایه، هیچ پلاک جدیدی ایجاد نشد. این نتایج نشان می­دهد که پلاک‌های ظاهر شده، از نوع فاژی نبوده بلکه متعلق به باکتری­های شکارچی BALOs می‌باشند. در مطالعه حاضر از روش کشت آگار دو لایه به عنوان روش کارآمد برای جداسازی BALOsاستفاده شد. همچنین انتخاب طعمه، ترجیحا از باکتری‌های گرم منفی نیز یکی از عوامل تعیین کننده جهت جداسازی موفقیت‌آمیز سویه­های BALOs می‌باشد. اختلاف اندازه سلولی و سرعت حرکت باکتری­ها موجب تمایز آسان BALOs از طعمه در روش مطالعه میکروسکوپی می‌شود. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که باکتری شکارچی جدا شده از آب دریای مازندران، توانایی از بین بردن باکتری طعمه پروتئوس را داشت. نتایج سنجش جذب نوری محیط رشد در طول موج 600 نانومتر، کاهش 0/3 جذب نوری پس از12 ساعت را نشان داد. به طوری که در کمتر از 72 ساعت، جذب نوری محیط رشد از 0/843 به 0/283 کاهش یافت.

توانایی جدایه شکارچی MMHZ1 در حمله به طیف طعمه­ای مختلف شامل باکتری‌های گرم منفی بیماریزا نیز ارزیابی شد. ارزیابی طیف طعمه، یک آزمایش بحث‌ برانگیز است چرا که نتایج ممکن است تحت تاثیر روش مورد استفاده برای رشد میزبان، درجه گرمخانه گذاری و غیره قرار گیرد (35). اما در شرایط آزمایش استاندارد و یکنواخت، روش مفیدی است. نتایج پژوهش حاضر نشان داد که جدایه MMHZ1 توانایی از بین بردن 7 عضو از 10 عضو خانواده انتروباکتریاسه آزمایش شده را داشت در حالیکه توانایی شکار انتروباکتر آئروژنز، سیتروباکتر فروندی و شیگلا فلکسنری را نداشت. مطالعات لی و همکاران (2011) نیز نشان داد که باکتری­های شکارچی BALOs، دارای شکار ترجیحی هستند (18). این نتایج نشان می­دهد اگرچه BALOs به باکتری­های گرم منفی حمله می­کنند اما تمام طعمه­ها به باکتری­های شکارچی حساس نیستند. بنابراین سویه­های BALOs دارای طیف طعمه­ای خاص می­باشند. همچنین آزمایش طیف طعمه اطلاعات زیادی در ارتباط با اندازه پلاک، مورفولوژی و میزان کدورت یا شفافیت پلاک‌ها بیان می‌کند. هنگامی که سویه­های BALOs با طیف طعمه­ای مشابه آزمایش شوند، الگوی شکل و اندازه پلاک‌ها می‌تواند متفاوت باشد. این نتایج زمانی می‌تواند مفید باشد که جدایه‌ها برای اولین بار و از نمونه‌های تازه، جدا شوند. زیرا بعد از کشت­های مکرر، تفاوت در مورفولوژی پلاک‌ها کم می‌شود (1).در مطالعه حاضر نیز برخی پلاک‌ها شفاف و برخی دیگر مات بودند. این ویژگی زمانی بارز بود که باکتری‌های اشریشیا کلی، سراشیا مارسسنس، سودوموناس آئروجینوزا و شوانلا ME1 به عنوان طعمه مورد استفاده قرار گرفت و پلاک­های مات ایجاد شد. البته تاکنون دلیلی متقن برای ایجاد پلاک­های مات و یا شفاف گزارش نشده است. همچنین این نتایج نشان داد که جدایهMMHZ1 ، توانایی حمله به 42/71 درصد از طعمه­های باکتریایی استفاده شده را داشت. این جدایه تمایل زیاد به شکار پروتئوس دریایی را نشان داد. این نتایج دلالت بر ماهیت محیط زیست طبیعی جدایه MMHZ1 دارد و نوع دریایی بودن آن را تایید می­کند. با توجه به توانایی شکار لیتیکی باکتری‌های اعضای خانواده انتروباکتریاسه توسط جدایه MMHZ1، نتایج مطالعات دیگر مبنی بر امکان استفاده از این جدایه به عنوان پروبیوتیک جهت تثبیت فلور طبیعی روده را تقویت می­کند (17، 28).

از ویژگی­های باکتری­های دریازی، تحمل شوری است. در مطالعه حاضر نیز رشد و فعالیت شکارگری جدایه MMHZ1 در حضور نمک کلرید سدیم بررسی شد. نتایج نشان داد جدایه شکارچی توانایی رشد و فعالیت در حضور 1/0 تا 0/3 درصد نمک را داشت در حالیکه در محیط کشت فاقد نمک (صفر درصد) هیچگونه رشد و فعالیتی مشاهده نشد. این نتایج تایید می­کند که جدایه MMHZ1 از باکتری­های دریازی بوده و در خانواده باکتریووراسه طبقه بندی می­شود. در حالیکه BALOs ساکن خاک و آب شیرین متعلق به خانواده دلوویبریوناسه می­باشند (3). همچنین آمات و تورلا (1989) سویه­های BALOs را از نظر تحمل شوری به دو گروه تقسیم کردند. این باکتری­های شکارچی شامل گروه دریایی با تحمل شوری کم (یک درصد نمک) و گروه ساکن حوضچه­های نمکی با درجه شوری بالا (15 درصد) بودند (1). نتایج تحقیق حاضر نشان می­دهد با توجه به رشد و فعالیت جدایه MMHZ1 در حضور 3 درصد نمک کلرید سدیم، این جدایه در گروه دریایی با تحمل شوری متوسط قرار می­گیرد. همچنین نتایج شناسایی مولکولی به کمک آنالیز توالی ژن 16S rRNA اختصاصی دلوویبریو نیز نشان داد جدایه MMHZ1 با 62/99 درصد همولوژی، با باکتریووراکس لیتورالیس (Bacteriovorax litoralis) شباهت دارد. باکتری شکارچی باکتریووراکس لیتورالیس نیزساکن دریا بوده و شوری دوست می­باشد.

تاثیر طعمه زنده و یا طعمه کشته شده بر رشد و فعالیت BALOs توسط ساتن و بِسانت در 1994 بررسی شد. این نتایج نشان داد که BALOs تنها در حضور طعمه زنده توانست رشد کند (32). البته نتایج تحقیق حاضر نیز دلالت بر رشد و فعالیت جدایه شکارچی MMHZ1 در حضور طعمه زنده پروتئوس در محیط کشت آگار دو لایه داشت. اگر چه کروترز و همکاران (1972) رشد BALOs در حضور طعمه اتوکلاو شده (8) و یا هِسپِل (1978) رشد BALOs به کمک طعمه اشریشیا کلی که حرارت ملایم دیده بود، را گزارش کردند (9).

مطالعات متعددی در خصوص تراکم باکتری­های شکارچی BALOs در محیط­های طبیعی دریایی انجام شده است. در مطالعه حاضر نیز تراکم BALOs آب دریای مازندران در سواحل بابلسر سنجیده شد. این نتایج نشان می­دهد هر میلی لیتر آب دریا حاوی PFU 350 باکتری شکارچی BALOs با توانایی شکار پروتئوس بود. این نتیجه متفاوت از نتایج سنجش تعداد BALOs در هر میلی­لیتر آب دریای مدیترانه در سواحل اسرائیل به تعداد PFU 50 -40 (29) و یا در هر میلی­لیتر آب دریای سواحل هاوایی به تعداد PFU 194/0- 121/0 (34) بود. غلظت بالای مواد آلی در آب سواحل دریای مازندران ممکن است موجب افزایش تعداد BALOs در مقایسه با جمعیت پایین این باکتری­های شکارچی در آب دریای مدیترانه و یا آب ساحل هاوایی باشد. غلظت بالای ترکیبات آلی آب موجب افزایش جمعیت باکتریایی طعمه می‌شود که به نوبه خود موجب رشد و افزایش تراکم BALOs شده و موجب تفاوت در نتایج می‌شود.

نتیجه گیری

در مطالعه حاضر برای نخستین بار در کشور، باکتری بومی MMHZ1 متعلق به جنس هالوباکتریووراکس از آب‌ ساحلی دریای مازندران جداسازی شد. این جدایه علاوه بر متلاشی کردن طعمه پروتئوس جدا شده از دریا، توانایی شکار لیتیکی طیف وسیعی از باکتری‌های گرم منفی بیماریزا را نیز نشان داد. همچنین جدایه شکارچی MMHZ1 ساکن محیط زیست دریا، توانایی تحمل شوری نسبتا بالا را داشت. نتایج تحقیق حاضر نشان داد جدایه MMHZ1 با توانایی شکار باکتری‌های گرم منفی، این پتانسیل را دارد که به عنوان عامل ضد باکتریایی زنده، جهت رفع مشکلات حاصل از باکتری­های بیماریزا گرم منفی در بخش‌های پزشکی، کشاورزی، دامپروری و آبزی‌پروری استفاده شود. بنابراین استفاده از این باکتری شکارچی به عنوان عامل کنترل زیستی باکتری‌های بیماریزا نیاز به مطالعه بیشتر دارد.

1. Amat, A. Sanchez, and F. Torrella. (1989). “Isolation and Characterization of Marine and Salt Pond Halophylic Bdellovibrios.” Canadian Journal of Microbiology 35(8): 771–78.
2. Atterbury, R. J., Hobley, L., Till, R., Lambert, C., Capeness, M. J., Lerner, T. R., ... & Sockett, R. E. (2011). Effects of orally administered Bdellovibrio bacteriovorus on the well-being and Salmonella colonization of young chicks. Applied and Environmental Microbiology, 77(16), 5794-5803.
3. Baer, M. L., Ravel, J., Chun, J., Hill, R. T., & Williams, H. N. (2000). A proposal for the reclassification of Bdellovibrio stolpii and Bdellovibrio starrii into a new genus, Bacteriovorax gen. nov. as Bacteriovorax stolpii comb. nov. and Bacteriovorax starrii comb. nov., respectively. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 50(1), 219-224.‏
4. Boileau, M. J., Clinkenbeard, K. D., & Iandolo, J. J. (2011). Assessment of Bdellovibrio bacteriovorus 109J killing of Moraxella bovis in an in vitro model of infectious bovine keratoconjunctivitis. Canadian Journal of Veterinary Research, 75(4), 285-291.
5. Cai, J., Zhao, J., Wang, Z., Zou, D., & Sun, L.  (2008). “lyses of vibrios by Bdellovibrio-and-like organisms (BALOs) isolated from marine environment.” Journal of Food Safety 28(2): 220–35.
6. Chatterjee, A. (2009). Bdellovibrio bacteriovorus: life cycle and potential as a predatory renaissance. Adv. Bio. Tech, 8, 27-29.
7. Chu, W. H., & Zhu, W. (2010). Isolation of Bdellovibrio as biological therapeutic agents used for the treatment of Aeromonas hydrophila infection in fish. Zoonoses and Public Health, 57(4), 258-264.‏
8. Crothers, S. F., Fackrell, H. B., Huang, J. C. C., & Robinson, J. (1972). Relationship between Bdellovibrio bacteriovorus 6-5-S and autoclaved host bacteria. Canadian Journal of Microbiology, 18(12), 1941-1948.‏
9. Hespell, R. B. (1978). Intraperiplasmic growth of Bdellovibrio bacteriovorus on heat-treated Escherichia coli. Journal of Bacteriology, 133(3), 1156-1162.‏
10. Hobley, L., Lerner, T. R., Williams, L. E., Lambert, C., Till, R., Milner, D. S., ... & Harris, M. A. (2012). Genome analysis of a simultaneously predatory and prey-independent, novel Bdellovibrio bacteriovorus from the River Tiber, supports in silico predictions of both ancient and recent lateral gene transfer from diverse bacteria. BMC genomics, 13(1), 670.‏
11. Jurkevitch, E. (2007). Predatory Prokaryotes: Biology. Ecology and Evolution. Springer Verlag: Berlin Heidelberg New York
12. Jurkevitch, E. (2012). “Isolation and Classification of Bdellovibrio and Like Organisms.” In Current Protocols in Microbiology, Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc.
13. Jurkevitch, E., Minz, D., Ramati, B., & Barel, G. (2000). Prey range characterization, ribotyping, and diversity of soil and rhizosphere Bdellovibrio spp. isolated on phytopathogenic bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 66(6), 2365-2371.
14. Kim, O.S., Cho, Y.J., Lee, K., Yoon, S.H., Kim, M., Na, H., et al., (2012). Introducing EzTaxon: a prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 62: 716-721
15. Koval, S. F., Williams, H. N., & Stine, O. C. (2015). Reclassification of Bacteriovorax marinus as Halobacteriovorax marinus gen. nov., comb. nov. and Bacteriovorax litoralis as Halobacteriovorax litoralis comb. nov.; description of Halobacteriovoraceae fam. nov. in the class Deltaproteobacteria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 65(2), 593-597.‏
16. Lambert, C., & Sockett, R. E. (2008). Laboratory maintenance of Bdellovibrio. Current Protocols in Microbiology, 7B-2.‏ Wiley Interscience (www.interscience.wiley.com)
17. Lebba, V., Santangelo, F., Totino, V., Nicoletti, M., Gagliardi, A., De Biase, R. V., ... & Schippa, S. (2013). Higher prevalence and abundance of Bdellovibrio bacteriovorus in the human gut of healthy subjects. PLoS One, 8(4), e61608.‏
18. Li, H., Liu, C., Chen, L., Zhang, X., & Cai, J. (2011). Biological characterization of two marine Bdellovibrio-and-like organisms isolated from Daya bay of Shenzhen, China and their application in the elimination of Vibrio parahaemolyticus in oyster. International Journal of Food Microbiology, 151(1), 36-43.‏
19. Lu, F., & Cai, J. (2010). The protective effect of Bdellovibrio and like organisms (BALO) on tilapia fish fillets against Salmonella enterica ssp. enterica serovar Typhimurium. Letters in Applied Microbiology, 51(6), 625-631.‏
20. Miyamoto, S., & Kuroda, K. (1975). Lethal effect of fresh sea water on Vibrio parahaemolyticus and isolation of Bdellovibrio parasitic against the organism. Microbiology and Immunology, 19(4), 309-317.‏
21. Mohseni, M., & Ekrami, S. M. (2017). Electricity production in two-chamber microbial fuel cells using exoelectrogenic Shewanella sp. isolated from sediments of the Caspian Sea. Journal of Cellular and Molecular Researches, 30(2), 198-211. [In Persian]
22. Mohseni, M., Khosravi, F., Mohadjerani, M. and Chaichi, M.J., 2014. Biosorption of lead and copper by heavy metal resistance bacterium using Fourier Transform Infrared Spectrophotometer (FT IR). Medical Laboratory Journal. 8(3): 30-39 [In Persian].
23. Mohseni, M., & Maghool, S.S. (2016). Toxicity assay of heavy metals Pb, Cd and Cu by luminescent bacterium isolated from the Caspian Sea. Journal of Cellular and Molecular Researches, 28(4), 588-598. [In Persian]
24. Oyedara, O. O., Luna‐Santillana, D., de Jesus, E., Olguin Rodriguez, O., Guo, X., Mendoza Villa, M. A., ... & Rodriguez Perez, M. A. (2016). Isolation of Bdellovibrio sp. from soil samples in Mexico and their potential applications in control of pathogens. Microbiology Open, 5(6), 992-1002.‏
25. Pernthaler, Jakob. (2005). “Predation on Prokaryotes in the Water Column and Its Ecological Implications.” Nature Reviews Microbiology 3(7): 537–46.
26. Rendulic, S. (2004). “A Predator Unmasked: Life Cycle of Bdellovibrio Bacteriovorus from a Genomic Perspective.” Science 303(5658): 689–92.
27. Rogosky, A. M., Moak, P. L., & Emmert, E. A. (2006). Differential predation by Bdellovibrio bacteriovorus 109J. Current Microbiology, 52(2), 81-85.‏
28. Schwudke, D., Strauch, E., Krueger, M., & Appel, B. (2001). Taxonomic studies of predatory Bdellovibrios based on 16S rRNA analysis, ribotyping and the hit locus and characterization of isolates from the gut of animals. Systematic and Applied Microbiology, 24(3), 385-394.‏
29. Shilo, M. (1966). Predatory bacteria. Science Journal, 2, 33-37.
30. Sinclair, A. R. E., Mduma, S., & Brashares, J. S. (2003). Patterns of predation in a diverse predator–prey system. Nature, 425(6955), 288-290.‏
31. Stolp, H., & Starr, M. P. (1963). Bdellovibrio bacteriovorus gen. et sp. n., a predatory, ectoparasitic, and bacteriolytic microorganism. Antonie Van Leeuwenhoek, 29(1), 217-248.‏
32. Sutton, D. C., & Besant, P. J. (1994). Ecology and characteristics of Bdellovibrios from three tropical marine habitats. Marine Biology, 119(2), 313-320.‏
33. Snyder, A. R., Williams, H. N., Baer, M. L., Walker, K. E., & Stine, O. C. (2002). 16S rDNA sequence analysis of environmental Bdellovibrio-and-like organisms (BALO) reveals extensive diversity. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 52(6), 2089-2094.‏
34. Taylor, V. I., Baumann, P., Reichelt, J. L., & Allen, R. D. (1974). Isolation, enumeration, and host range of marine Bdellovibrios. Archives of Microbiology, 98(1), 101-114.‏
35. Torrella, F., Guerrero, R., & Seidler, R. J. (1978). Further taxonomic characterization of the genus Bdellovibrio. Canadian Journal of Microbiology, 24(11), 1387-1394.‏
36. Yair, S., Yaacov, D., Susan, K., & Jurkevitch, E. (2009). Small eats big: ecology and diversity of Bdellovibrio and like organisms, and their dynamics in predator-prey interactions. In Sustainable Agriculture (pp. 275-284). Springer Netherlands.‏
پژوهش‌های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)
دوره 31، شماره 3
مهر 1397
صفحه 370-385
  • تاریخ دریافت: 16 دی 1396
  • تاریخ بازنگری: 25 فروردین 1397
  • تاریخ پذیرش: 10 تیر 1397