نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشیار بیوشیمی، گروه پزشکی، دانشکده پزشکی، واحد قم، دانشگاه آزاد اسلامی، قم، ایران

2 دانشیار پژوهشکده چرخه سوخت، پژوهشگاه علوم و فنون هسته ای، سازمان انرژی اتمی

3 استادیار گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد گرمسار، گرمسار، ایران

4 دکتری بیوشیمی، دانشگاه پیام نور، واحد تهران شرق، تهران، ایران

5 دانشجوی ارشد بیولوژی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه حکیم سبزواری، سبزوار، ایران

چکیده

نعناع با نام علمی Mentha Spicata یکی از گیاهان بومی ایران با اثرات درمانی بسیار است. در این تحقیق، تاثیر اسانس نعنا بر روی پارامترهای دخیل در آسیب اکسیداتیو و بیان ژن التهابی COX-2 بافت ریه در مدل تجربی التهابی CLP در رت مورد مطالعه قرار گرفته است. رت ها به پنج گروه کنترل منفی (Laparatomy)، CLP و گروه های تیمار با اسانس نعنا (mg/kg bw 100 و 50) و داروی ایندومتاسین تقسیم شدند. سپس، 24 ساعت پس از جراحی، سطح فاکتورهایی نظیرLP ،GSH ، GST،FRAP ، MPO، PGE2 و بیان ژن COX-2 در پلاسما و بافت ریه اندازه گیری شد. نتایج این تحقیق نشان می دهد که سپسیس موجب کاهش FRAP و GSH و افزایش میزان LP ، MPO، PGE2 و بیان ژن COX-2 می‌گردد، ولی بر روی آنزیم GST اثری ندارد. تیمار حیوانات با اسانس نعنا به اندازه ایندومتاسین، در تعدیل سطح این پارامتر ها موثر بوده است، بطوریکه سبب افزایش میزان FRAP و GSH و کاهش میزان LP ، MPO، PGE2 و بیان ژن COX-2 می‌گردد. همچنین مطالعات پاتولوژی نشان می دهد که سپسیس منجر به ایجاد آسیب هایی در بافت ریه شده که این آسیب ها در اثر تیمار با اسانس نعنا کاهش یافته اند. نتیجه گیری: سپسیس موجب آسیب اکسیداتیو بافت ریه شده و استفاده از اسانس نعنا با تاثیر بر روی پارامترهای استرس اکسیداتیو و آنتی اکسیدانی می‌تواند در جلوگیری و بهبود این آسیب ها موثر باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The effects of Mentha Spicata on oxidative stress and COX-2 gene expression in prevention of sepsis

نویسندگان [English]

  • Abolfazl Dadkhah 1
  • Faezeh Fatemi 2
  • Mohammad Reza Mohammadi Malayeri 3
  • Azadeh Rasooli 4
  • Mohammad Hassan Karvin Ashtiani 5

1 Department of Medicine, Faculty of Medicine, Qom Branch, Islamic Azad University, Qom, Iran

2 Materials and Nuclear Fuel Research School, Nuclear Science and Technology Research Institute, Tehran, I.R. of Iran

3 Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Garmsar Branch, Islamic Azad University, Garmsar-Iran

4 Department of Biochemistry, Faculty of Sciences, Payame-e-Noor University, Tehran, Iran

5 Department of biology, Faculty of Sciences, Hakim sabzevari University, Sabzevar, Iran

چکیده [English]

Mentha Spicata is an Iranian native plant with therapeutic effects. In this study, the effects of M. Spicata essential oils were investigated through considering oxidative injury parameters as well as expression of COX-2 inflammatory gene in lung tissue of experimental cecal ligation and puncture (CLP) rat model. Rats were divided into 5 groups: negative control (lapratomy), CLP, treatment groups with M. Spicata E.O (50 and 100 mg/kg b.w) and indomethacin. Then, 24h after CLP induction, LP, GSH, GST, FRAP, MPO, PGE2 and COX-2 expression were measured in plasma and lung tissues. The data indicated that the sepsis induction reduced GSH, FRAP and increased LP, MPO, PGE2 and COX-2 levels but didn`t affected GST activity. Treatments of rats with E.Os as well as indomethacin were been effective in increasing the GSH, FRAP and decreasing the LP, MPO, PGE2 and COX-2 levels. Histopathological examinations indicated that sepsis caused lung tissue damage which was decreased by E.O treatments. In conclusion, sepsis causes oxidative lung tissue damage and use of M. Spicata can prevent injuries through modulation the oxidative stress/antioxidant parameters.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Mentha Spicata essential oils
  • CLP
  • Antioxidant system balance
  • Anti- inflammatory
  • Sepsis

تاثیر اسانس نعنا بر روی استرس اکسیداتیو و بیان ژن COX-2 در پیشگیری از سپسیس

ابوالفضل دادخواه1*، فائزه فاطمی2، محمدرضا محمدی ملایری3، آزاده رسولی4 و محمد حسن کاروین آشتیانی5

1 ایران، قم، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد قم، دانشکده پزشکی، گروه پزشکی

2 ایران،پژوهشگاه علوم و فنون هسته ای، پژوهشکده مواد و سوخت هسته ای

3 ایران، گرمسار، دانشگاهآزاداسلامی،واحدگرمسار، دانشکدهدامپزشکی،گروهپاتوبیولوژی

4 ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، واحد تهران شرق، گروه بیوشیمی

5 ایران، سبزوار، دانشگاه حکیم سبزواری، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 22/7/96                تاریخ پذیرش: 10/4/97

چکیده

نعناع با نام علمی  Mentha Spicataیکی از گیاهان بومی ایران با اثرات درمانی بسیار است. در این تحقیق، تاثیر اسانس نعنا بر روی پارامترهای دخیل در آسیب اکسیداتیو و بیان ژن التهابی COX-2 بافت ریه در مدل تجربی التهابی CLP در رت مورد مطالعه قرار گرفته است. رت ها به پنج گروه کنترل منفی (Laparatomy)، CLP  و گروه های تیمار بااسانس نعنا (mg/kg bw 100 و 50) و داروی ایندومتاسین تقسیم شدند. سپس، 24 ساعتپس از جراحی، سطح فاکتورهایینظیرLP ،GSH ، GST،FRAP ، MPO، PGE2 و بیان ژن COX-2  در پلاسما و بافت ریه اندازه گیری شد. نتایج این تحقیق نشان می دهد که سپسیس موجب کاهش FRAPو GSH و افزایش میزان LP ، MPO، PGE2 و بیان ژن COX-2  می­گردد، ولی بر روی آنزیم GST اثری ندارد. تیمار حیوانات با اسانس نعنا به اندازه ایندومتاسین، در تعدیل سطح این پارامتر ها موثر بوده است، بطوریکه سبب افزایش میزان FRAP و GSH و کاهش میزانLP ، MPO، PGE2 و بیان ژن COX-2 می­گردد. همچنین مطالعات پاتولوژی نشان می دهد که سپسیس منجر به ایجاد آسیب هایی در بافت ریه شده که این آسیب ها در اثر تیمار با اسانس نعنا کاهش یافته اند. نتیجه گیری: سپسیس موجب آسیب اکسیداتیو بافت ریه شده و استفاده از اسانس نعنا با تاثیر بر روی پارامترهای استرس اکسیداتیو و آنتی اکسیدانی می­تواند در جلوگیری و بهبود این آسیب ها موثر باشد.

واژه های کلیدی: اسانس نعنا،CLP ، استرس اکسیداتیو، ضد التهاب، سپسیس

* نویسنده مسئول، تلفن: 09122490620 ، پست الکترونیکی: dadkhah_bio@yahoo.com

مقدمه

 

امروزه مصرف گیاهان دارویی با هدف دستیابی به داروهای کم خطر و با حداقل عوارض جانبی، روز به روز در حال افزایش است و این به دلیل به اثبات رسیدن اثر بخشی بسیاری از این مواد در مجامع علمی و مقبولیت آن در اکثر جوامع بشری است (47). گیاه نعنا (Mentha Spicata)، یکی از این گیاهان دارویی می باشد که در طب سنتی ایران برای درمان معده درد و اختلالات روده استفاده می شود (27، 28). همچنین، در طب سنتی غالباً از دمکرده برگ های آن به عنوان مدر (19)، تسریع کننده عمل هضم، رفع آسم، اسپاسم، درد معده، سردرد، سرماخوردگی و سرفه و همچنین به صورت استعمال خارجی برای درمان زخم ها و غدد متورم (49) و نیز برای درمان برونشیت، نفخ شکم، بی اشتهایی، کولیت و اختلالات روده ای مانند تهوع، سوء هاضمه و اسهال (29) و به عنوان آنتی اکسیدان (35)، ضدقارچ (49)، ضد باکتری (41، 42) و ضد انقباض و تشنج (19) استفاده می شود.

سپسیس یا عفونت خون، بیماری بالینی تهدید کننده ای است که هرساله 27 میلیون نفر در سراسر جهان را درگیر می کند. بروز سپسیس هنوز هم در حال افزایش است، به طوریکه در 10-30% از بخش های مراقبت های ویژه (ICU) رخ می دهد (39، 34، 33). شوک سپتیک (مرحله شدید سپسیس) با مرگ و میر بالای 40% همراه می باشد (37). پاسخ ایمنی پس از سپسیس، منجر به پاسخ شدید التهابی و در نهایت اختلال و شوک ارگان ها می شود. التهاب فرایندی است که توسط عوامل مختلف بیولوژیکی شروع گردیده و نه تنها مستقیماً با فعال‌سازی سیستم ایمنی بلکه با واسطه سیکلواکسیژناز ـ 2 (COX-2) نیز در ایجاد بیماری دخالت می کند (45، 32). علاوه بر نقش فاکتورهای التهابی در پاتوژنز بیماری سپسیس، COX-2 و محصول آن PGE-2 مسئول بیشتر عوارض ناشی از سپسیس می باشند. در جراحت و سپسیس، پروستاگلاندین های تولید شده توسط COX-2 از ماکروفاژها آزاد شده و نقش بسیار مهمی را در پاسخ ایمنی ایفا می کنند (32). سپسیس تقریبا به طور مستقیم یا غیر مستقیم عملکرد تمام انواع سلول های ایمنی را مختل می کند (24، 25). شدت و مدت زمان مرحله پاسخ ایمنی سبب افزایش عفونت های بیمارستانی و مرگ و میر ناشی از آن می گردد (24، 25، 6). علاوه بر این، یکی دیگر از عوارض و مشکلات ناشی از سپسیس به هم خوردن تعادل سیستم استرس اکسیداتیو بدن است (7). استرس اکسیداتیو زمانی ایجاد می‍شود که تعادل بین تشکیل گونه های اکسید کننده و حذف آنها توسط ترکیبات آنتی اکسیدان در اثر تولید زیاد رادیکال های آزاد اکسیژن
ROS (Reactive Oxygen Species) و یا تضعیف سیستم دفاع آنتی اکسیدانی مختل شود  (22). این فرآیند ها در سپسیس منجر به آسیب اکسیداتیو بسیاری از بافت های بدن از جمله قلب، کلیه، کبد و ریه و از کارافتادن بافت ها و در نهایت مرگ می گردد (50). به همین دلیل، با توجه به نقش مهم و اصلی استرس اکسیداتیو در عوارض ناشی از سپسیس، استفاده از آنتی اکسیدانها و عناصر طبیعی در کاهش این عوارض، مورد توجه می باشد (50).

با توجه به نرخ بالای مرگ و میر مرتبط با سپسیس و به منظور دستیابی به داروهای کم خطر، برای اولین بار در این مطالعه اثر اسانس نعنا به عنوان یک گیاه بومی ایرانی در درمان بیماری ریوی ناشی از سپسیس مورد بررسی قرار گرفته است. بنابراین هدف از این مطالعه، ارزیابی اثر محافظتی اسانس نعنا بر آسیب ریه ناشی از سپسیس در روش CLP در موش های صحرایی  با در نظر گرفتن پارامترهای ضروری استرس اکسیداتیو/آنتی اکسیدان و بیان ژن COX-2 می باشد.

مواد و روشها

تهیهاسانسنعنا: اسانس نعنا از شرکت باریج اسانس تهیه گردیده (Batch No. 3138-031-93/8(707051); Sample Serial No.:BE930347) و به روش
(GC-MS) Gas Chromatography – Mass Spectroscopy آنالیز گردید (17-15).

آنالیز اسانس نعنا با استفاده از GC-MS : تجزیه اسانس با دستگاه GC-MS مربوط به بخش تحقیقات گیاهان دارویی در موسسه تحقیقات جنگل‌ها و مراتع انجام شد و شناسایی ترکیبات توسط متخصصین مربوطه در موسسه انجام گردید. در این روش، اسانس نعنا به‌وسیله دستگاه کروماتوگرافی گازی (GC Trace Thermo Finnigan) مجهز به آشکارساز یونی شعله‌ای، جداسازی شد. آنالیز نمونه‌ها بر اساس نرم‌افزار Euro Chrom 2000 از شرکت KNAUER توسط روش نرمالیزه کردن سطح و با استفاده از ستون سیلیکای مذاب TR-5 m)µ025/0 ضخامت فیلم، mm 25/0×m30) و دتکتور اسپکترومترجرمی
Thermo Trace DSQ (Dual Stage Quadrupole)، برنامه دمایی ºC280ـ50 در میزان C/min 100، دمای انژکتوری
ºC270، دمای آشکارساز ºC230 و گاز حامل هلیم (%99/99) انجام گرفت.

دستگاه GC/MS شامل گروماتوگراف گازی
GC Trace Thermo Finnigan مجهز به اتوسمپلر
 3000 Thermo AS بوده و ستون مورداستفاده نیز همانند ستون GC با شرایط فوق‌الذکر می‌باشد. اجزاء و ترکیبات اسانس­ها توسط مقایسه طیف‌سنجی جرمی با استانداردهای موجود شناسایی شدند. شناسایی ترکیبات مجهول با مقایسه شاخص‌های بازداری آن‌ها با ترکیبات استاندارد تأیید گردیدند.

تیمار حیوانات و نمونه گیری: در این تحقیق، از 130 سر رت نر بالغ با وزن متوسط 100 گرم استفاده گردید که از مرکز نگهداری حیوانات آزمایشگاهی از انستیتوپاستور ایران خریداری شدند. غذای حیوانات از کارخانجات فرآورده های غذایی تهران تهیه شده که به صورت Pellet با فرمول استاندارد بود. حیوانات بالغ نیز دسترسی آزاد به غذا و آب آشامیدنی از طریق بطری داشتند. حیوانات به 5 گروه تقسیم شدند: 1- گروه کنترل منفی: که حیوانات حلال  اسانس نعنا (DMSO) به مدت 2 هفته به صورت خوراکی مصرف کرده و سپس در روز پانزدهم جراحی لاپاراتومی انجام گردید. 2- گروه CLP: که همانند گروه کنترل منفی تیمار شدند و سپس در روز پانزدهم جراحی CLP انجام گردید. 3 و 4- گروه های تیمار: که اسانس نعنا در دز های 50 و 100 mg/kg bw به صورت خوراکی، روزانه به مدت دو هفته دریافت کردندو سپس در روز پانزدهم جراحی CLP انجام گردید. 5- گروه کنترل مثبت: که با داروی ضد التهابی ایندومتاسین (2 mg/kg bw)، به مدت دو هفته تیمار شده و سپس در روز پانزدهم جراحی CLP انجام گردید.

جراحی CLP : در روشCLP ، پس از بیهوش کردن رت‌ها، در دیواره شکمی آنها به اندازه 2 سانتی متر برش ایجاد گردید. سپس، سکوم خارج شده و بخش سکوم تا زیر دریچه ایلئوسکال بخیه زده شده و در سکوم آنها 2 سوراخ توسط نیدل G20 ایجاد گردید. بعد از این مرحله، روده به داخل محفظه شکمی برگردانده شده و پوست و صفاق بخیه زده شد. رت ها 24 ساعت پس از جراحی CLP بیهوش شدند و از قلب آنها خونگیری شد. در مرحله بعدی، حیوانات کشته شده و بافت ریه آنها به منظور بررسی های هیستوپاتولوژیکی و بیوشیمی جدا گردید.

اندازه گیری سطح فاکتور های دخیل در استرس اکسیداتیو در بافت ریه و پلاسما

تهیه هموژن بافت ریه: برای تهیه هموژن 20% (W/V) از بافت ریه، 4/0 گرم از بافت در یک استوانه مدرج مناسب قرار داده شد و روی آن PBS سرد (3/7=pH) تا حجم 2 میلی لیتر ریخته شد. سپس، مخلوط فوق داخل لوله مخصوص دستگاه هموژنایزر ریخته شده و محتویات لوله با حدود 5 تا 7 بار بالا و پایین کردن هموژن گردید.

اندازه گیری سطح MDA در هموژن بافت ریه: اساس اندازه‌گیری MDA این است که TBA با MDA ترکیب شده و محصول نارنجی رنگی ایجاد می‌کند که در 535 نانومتر جذب دارد. غلظت MDA با اندازه گیری میزان جذب توسط دستگاه اسپکتروفتومتر و از روی ضریب خاموشی آن (L/cm.mmol105×56/1) محاسبه گردید (52).

اندازه گیری سطح گلوتاتیون احیا در هموژن بافت ریه: GSH با استفاده از معرف Ellman’s و براساس روش Seldak و Limdsay (1968) اندازه‌گیری شد (43). در این روش میزان جذب کمپلکس گلوتاتیون با CDNB در طول موج 412 نانومتر اندازه گیری شده و بر اساس منحنی استاندارد میزان آن محاسبه گردید (43).

اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم میلوپراکسیداز MPO در بافت ریه: فعالیت MPO با کمی تغییر مطابق روش Hillegas و همکاران انجام شد (23). در این روش تغییر جذب ناشی از مصرف H2O2 توسط آنزیم میلوپراکسیداز در طول موج 460 نانومتر اندازه گیری شد (23).

اندازه گیری فعالیت آنزیم گلوتاتیون s ترانسفراز GST در هموژن بافت ریه: فعالیت این آنزیم با استفاده از سوبسترای CDNB و تغییر جذب آن در طول موج 360 نانومتر اندازه گیری شد (10).

اندازه گیری ظرفیت آنتی اکسیدانی توتال پلاسما: ظرفیت آنتی اکسیدانی توتال پلاسما توسط تست FRAP و با استفاده از سوبسترای TPTZ در طول موج 593 نانومتر اندازه گیری شد (9).

اندازه گیری غلظت پروستاگلاندین E2 (PGE2) در پلاسما: غلظت PGE2 بر اساس روش ELISA و با استفاده از کیت (Assay Desighs Co ;U.S.A) ELISA اندازه گیری شد.

بررسی بیان ژن COX-2 در سطح mRNA در بافت ریه

استخراج RNA و ساخت cDNA : به منظور استخراج RNA از کیت استخراج RNA (BioBasic Inc, Canada) استفاده شد. سپس، به منظور حذف DNA از RNA استخراج شده، از آنزیم DNase شرکت
Thermo Scientific استفاده شد. به منظور یکسان بودن غلظت RNA مصرفی در ساخت cDNA، غلظت RNA موجود در نمونه­های تیمار شده با DNase، توسط دستگاه نانودراپ NanoDrop 2000)) خوانده شد. در نهایت، میزان معینی از RNA برای ساخت تمامی cDNAها استفاده گردید. برای ساخت cDNA از RNA استخراج شده، از کیت شرکت تاکارا (Takara bio Inc, Japan) استفاده گردید.

انجام واکنش PCR : به منظور تأیید انجام مراحل قبل، واکنش PCR برای ژن مورد نظر انجام شد، میزان و غلظت مواد مورداستفاده برای حجم 25 میکرو لیتری و برنامه چرخه حرارتی واکنش PCR در جدول های 1 و 2، ذکر شده است. سپس محصول حاصل بر روی ژل آگارز 5/2% بارگذاری گردید. به منظور انجام واکنش PCR و
Real time PCR، از پرایمرهای اختصاصی ژن COX-2 و GAPDH استفاده شد.

جدول 1- میزان و غلظت مواد مورداستفاده جهت تهیه مخلوط واکنش برای PCR به حجم نهایی  µl 25.

غلظت

ماده مصرفی

   μl5/2

10X بافر

 μl75/0

MgCl2 (50Mm each)

 μl5/0

dNTP (10mM each)

 μl 1

Forward primer (10µM each)

μl 1

Reverse perimer (10µM each)

μl 3/0

Taq DNA polymerase (5u/µl)

 ­ng 50

Template DNA

μl 25 to

Nuclease-free water

 μl 25

Total volume

 

جدول 2- برنامه حرارتی PCR مورداستفاده

تعداد سیکل

مدت‌زمان

درجه حرارت

عمل انجام شده در این مرحله

مرحله

1

5 دقیقه

95 درجه سانتی‌گراد

Initial denaturation

مرحله اول

35

20 ثانیه

95 درجه سانتی‌گراد

Denaturation

مرحله دوم

20 ثانیه

60 درجه سانتی‌گراد

Annealing

20 ثانیه

72 درجه سانتی‌گراد

Extention

1

5 دقیقه

72 درجه سانتی‌گراد

Final Extention

مرحله سوم

جدول 3- توالی پرایمرهای مورد استفاده

primers

Sequence (5'      3')

Tm

Product Length

 

COX2 forward

 

ACCTCTGCGATGCTCTTC

50.3 ºC

 

188 bp

 

COX2 reverse

 

AGGAATCTCGGCGTAGTAC

51.1 ºC

 

GAPDH forward

 

TGCCAGCCTCGTCTCATAG

53.2 ºC

 

197 bp

 

GAPDH reverse

 

ACTGTGCCGTTGAACTTGC

51.1 ºC

 


بدین منظور، پرایمر مورد نظر با استفاده از اطلاعات موجود در بانک ژن NCBI طراحی شده و پس از اطمینان حاصل پیدا کردن، پرایمرهای مورد نظر سنتز شدند. جدول 3 مشخصات پرایمرهای مورد استفاده را نشان می دهد.

انجام واکنشReal time PCR: واکنش Real time PCR با استفاده از پرایمر اختصاصی و کیت مخصوص QuantiNova SYBR Green PCR Kit انجام پذیرفت. این کیت حاوی تمام مواد لازم برای انجام واکنش PCR (آنزیم Taq، بافر همراه باMgCl2  و dNTPs) و رنگ سایبرگرین می باشد که به عنوان مستر میکس مورد استفاده قرار می‍گیرد. هر واکنش­ Real time PCR (حجم نهایی10 میکرولیتر) حاوی μl 5 مسترمیکس،μl 4/0 پرایمرهای Forward و Reverse­ (جدول 1)، μl 5/0 cDNA، و
μl9/3 آب عاری از Nuclease می­باشد. پس از مخلوط کردن مواد مذکور، به منظور اطمینان از صحت انجام واکنش، نمونه­های حاوی ژن مورد آزمایش (COX-2) و نمونه حاوی ژن کنترل داخلی )­(GAPDH در پلیت­ها به صورت سه تایی ریخته شد. همچنین، برای اطمینان حاصل کردن از عدم آلودگی و خطاهای حاصل از آن، برای هر ژن سه کنترل منفی در نظر گرفته شد که میزان الگوی مورد نظر (cDNA­) با آب مقطر جایگزین گردید. در نهایت، از چرخه حرارتی ذکر شده در جدول 4 استفاده شده و به منظور محاسبه میزان تغییرات بیان ژن COX-2 از روش
CT DD استفاده گردید.

بررسی هیستوپاتولوژی بافت ریه: نمونه های بافتی ریه پس از جدا سازی در محلول بافر فرمالین10 درصد تثبت گردید و در ادامه، به روش متداول از آنها قالب های پارافینی تهیه گردید و با دستگاه میکروتوم به ضخامت 4 میکرون برش داده شد. نهایتاً برش های بافتی با هماتوکسیلین و ائوزین رنگ آمیزی شده و با میکروسکوپ نوری مورد ارزیابی هیستوپاتولوژی قرار گرفتند.

جدول 4 - چرخه حرارتی واکنش Real-Time PCR

تعداد سیکل

        زمان

         دما 

   مرحله

1

́ 2

oC 95

1

 

 

 

 

40

²15

oC 95

2

 

²20

oC 60

 

 

²20

oC 72

 

1

²15

oC 95-57

3

 

همچنین، برای ارزیابی میزان تأثیر تیمارها، آسیب های بافتی به روش زیر مورد تحلیل کمی قرار گرفتند. نمونه های هیستوپاتولوژی از لحاظ شاخص های پرخونی، ادم التهابی بافت های بینابینی و شدت ارتشاح نوتروفیل در بافت های بینابینی ریه مورد ارزیابی قرار گرفته و به روش زیر امتیاز دهی شدند. شاخص شدت آسیب بافتی و میانگین تعداد نوتروفیل های نفوذ یافته و حاشیه نشین شده، از طریق شمارش تعداد سلول های التهابی چند هسته‍ای (پلی مورفونوکلیر) (نوتروفیل) در ده فیلد (میدان) میکروسکوپیک و محاسبه میانگین آنها برآورد گردید.  شاخص هیستولوژیکی بر اساس شدت آسیب بافتی از 0 تا 4 درجه بندی شد، بدین صورت که عدد (درجه) صفر نشانگر تعداد 0 تا 9 نوتروفیل، عدد (درجه) 1 نشان دهنده تعداد10 تا 19 نوتروفیل، عدد (درجه) 2 نشانه تعداد 20 تا 29 نوتروفیل، عدد (درجه) 3 نشان دهنده تعداد 30 تا 39 نوتروفیل و نهایتاً عدد (درجه) 4 نشانگر40 تا 49 نوتروفیل نفوذ یافته یا حاشیه نشین شده در هر میدان میکروسکوپیک بود. برای امتیاز دهی به شاخص پرخونی و ادم بافت بینابینی مقیاس درجه بندی نیمه کمی مورد استفاده قرار گرفت، به طوری که عدد (درجه) صفر برای توصیف حالت طبیعی بودن تغییر بافتی)؛ 1+: برای تغییرات بافتی خفیف؛ 2 +: برای تغییرات بافتی ملایم (متوسط) و 3+ برای تغییرات شدید و  4+ برای تغییرات خیلی شدید مورد استفاده قرار گرفت.

آنالیز آماری: تفاوت های بین داده ها با استفاده از نرم افزار SPSS و تست ANOVA تعیین گردید. با استفاده از این نرم افزار P- value داده ها، محاسبه گردید و P<0.05 به عنوان تفاوت معنی دار در نظر گرفته شد.

نتایج

بررسی آنالیز اسانس نعنا بر اساس کروماتوگرافی گازی-طیف سنجی جرمی (GC-MS): طبق جدول 5، 21 نوع ترکیب در اسانس نعنا شناسایی گردید که در بین آنها بیشترین مقدار را کاروون (%43/61)، لیمونن (%77/27) و ایزو دی هیدرو کاروون (%47/3) دارا می باشند (جدول 5).

تاثیر اسانس نعنا بر روی فاکتورهای استرس اکسیداتیو بافت ریه: همانطور که در جدول 6 نشان داده شده است، سطح MDA به عنوان محصول لیپید پراکسیداسیون در بافت ریه رتهای مبتلا به سپسیس (گروه CLP) افزایش می‍یابد .(P<0.05) تیمار رتهای سپتیکی با اسانس نعنا در دو دز mg/kg b.w50 و 100 باعث کاهش معنی دار سطح پراکسیداسیون لیپیدها گردید که این کاهش در گروه تیمار شده با داروی ضد التهابی ایندومتاسین نیز دیده شد (P<0.05). سطح گلوتاتیون و FRAP به ترتیب در ریه و پلاسمای رتهای مبتلا به سپسیس (گروه CLP) نسبت به گروه کنترل کاهش یافت .(P<0.05) تیمار رتهای سپتیکی با اسانس نعنا با هر دو دز باعث افزایش معنی دار میزان گلوتاتیون گردید که این افزایش در گروه تیمار شده با ایندومتاسین نیز دیده شد (P<0.05). در فعالیت آنزیم GST در بافت ریه در گروه های CLP و گروه های تیمار تغییری مشاهده نگردید (P>0.05) (جدول 6).

جدول 5- ترکیبات شیمیایی اسانس نعنا

No.

Compound

RI

%

1

α-Pinene

9677/920

87/0

2

β-Pinene

9892/956

81/0

3

Sabinene

2258/953

51/0

4

Myrcene

5914/965

33/0

5

Limonene

226/1003

77/27

6

Limonene oxide

171/1088

1/0

7

Iso-dihydro carvone

891/1139

47/3

8

Carveol

306/1168

4/0

9

Pulegone

224/1173

81/0

10

Carvone

525/1188

43/61

11

Carvone oxide

624/1204

11/0

12

Iso pulegone acetate

306/1239

12/0

13

Trans carvyl acetate

243/1246

04/0

14

Carvyl acetate

474/1266

72/0

15

Bourbunene

861/1287

43/0

16

Iso Caryophyllene

217/1304

06/0

17

Caryophyllene (Isomer)

663/1315

42/1

18

Farnesene

94/1334

12/0

19

Caryophyllene (Isomer)

566/1341

14/0

20

Germacrene

048/1362

03/0

21

Caryophyllene epoxide

038/1442

31/0

 

Total

 

100

 

جدول 6- تأثیر اسانس نعنا بر روی فاکتورهای استرس اکسیداتیو بافت کبد

گروه ها

MDA

GSH

FRAP

GST

LAP

52/8 ± 65/0

63/3 ± 36/0

407 ± 76/21

92 ± 65/4

CLP

41/14 ± 93/0*

2 ± 18/0*

257 ± 98/10*

33/95 ± 41/4

E.O 50

66/9 ± 89/0**

33/3 ± 36/0**

387 ± 3/9**

2/98 ± 77/5

E.O 100

55/9 ± 84/0**

52/3 ± 27/0**

379 ± 86/12**

127 ± 93/5

Indomethacin

68/9 ± 35/0**

5/3 ± 24/0**

280 ± 2/18

92 ± 04/5

علامت * نشان دهنده نتیجه حاصل از آنالیز آماری گروه CLP بوده که با گروه LAP معنی دار استP<0.05) ). علامت ** نشان دهنده نتیجه حاصل از آنالیز آماری گروه های مختلف تیمار بوده که با گروه CLP معنی دار هستندP<0.05) ).


تاثیر اسانس نعنا بر روی فعالیت میلو پراکسیداز بافت ریه: آنزیم میلوپراکسیداز در بافت ریه رت های سپتیکی (گروه CLP) نسبت به گروه کنترل (لاپاراتومی) در 24 ساعت پس از القاء سپسیس افزایش معنی داری پیدا کرد (P<0.05). تیمار رت ها با اسانس نعنا در دو دز
mg/kg b.w50 و 100 و نیز داروی ایندومتاسین باعث کاهش سطح آنزیم میلوپراکسیداز در بافت ریه رت های مبتلا به سپسیس گردید (P<0.05) (نمودار 1).

 

 

نمودار 1- تأثیر اسانس نعنا بر میزان فعالیت آنزیم میلو پراکسیداز در بافت ریه

علامت * نشان دهنده نتیجه حاصل از آنالیز آماری گروه CLP بوده که با گروه LAP معنی دار استP<0.05) ). علامت ** نشان دهنده نتیجه حاصل از آنالیز آماری گروه های مختلف تیمار بوده که با گروه CLP معنی دار هستندP<0.05) ).

 


تاثیر اسانس نعنا بر روی غلظت پروستاگلاندین E2 (PGE2) در پلاسما: بر اساس نمودار 2، میزان پروستاگلاندین  E2 در پلاسمای رت های سپتیکی (گروه CLP)- 24 ساعت بعد از القاء سپسیس- نسبت به گروه کنترل (لاپاراتومی) افزایش معنی داری داشت (P<0.05). اسانس نعنا در دو دز mg/kg b.w50 و 100 باعث کاهش سطح پلاسمایی پروستاگلاندین  E224 ساعت بعد از القاء سپسیس گردید (P<0.05) که این کاهش در گروه تیمار شده با داروی ایندومتاسین (گروه کنترل مثبت) نیز دیده شد (P<0.05) (نمودار 2).

 

 

نمودار 2- تاثیر اسانس نعنا بر روی غلظت پروستاگلاندین E2 در پلاسما

علامت * نشان دهنده نتیجه حاصل از آنالیز آماری گروه CLP بوده که با گروه LAP معنی دار استP<0.05) ). علامت ** نشان دهنده نتیجه حاصل از آنالیز آماری گروه های مختلف تیمار بوده که با گروه CLP معنی دار هستندP<0.05) ).


تاثیر اسانس نعنا بر روی بیان ژن COX-2 : همانطور که در نمودار 3 نشان داده شده است، ژن COX-2 در بافت ریه رت های سپتیکی (گروه CLP)- 24 ساعت بعد از القاء سپسیس- نسبت به گروه کنترل (لاپاراتومی) افزایش معنی داری (از 05/0± 0 به 04/0± 19/0) داشت (P<0.05). اسانس نعنا در دو دز mg/kg b.w50 و 100 باعث کاهش سطح ژن COX-2 24 ساعت بعد از القاء سپسیس در بافت ریه گردید (P<0.05). کاهش سطح ژن COX-2 از 04/0± 19/0 در گروه CLP به 02/0± 05/0 در گروه تیمار شده با داروی ایندومتاسین (گروه کنترل مثبت) نیز دیده شد (P<0.05)  (نمودار 3).  

 

 

علامت * نشان دهنده نتیجه حاصل از آنالیز آماری گروه CLP بوده که با گروه LAP معنی دار استP<0.05) ). علامت ** نشان دهنده نتیجه حاصل از آنالیز آماری گروه های مختلف تیمار بوده که با گروه CLP معنی دار هستندP<0.05) ).

 

 

نمودار 3- تاثیر اسانس نعنا بر روی بیان ژن COX-2


نتایج هیستوپاتولوژی بافت ریه: مطالعه هیستوپاتولوژیک بافت ریه نشان داد که در گروه کنترل (لاپاراتومی) خفیف ترین ضایعات بصورت پرخونی، ارتشاح نوتروفیل ها در بافت بینابینی و ادم التهابی بافت بینابینی رخ داده است (شکل 1، A). بیشترین آسیب بافت ریه در گروه رت های مبتلا به سپسیس (گروه (CLP مشاهده می گردد. در این گروه، بافت ریه در ببررسی ظاهری (ماکروسکوپیک) دچار پرخونی است. در بررسی هیستوپاتولوژیک نیز پرخونی شدید دیده می شود. ادم شدید بافت بینابینی باعث گسترش دیواره همبندی بین لوبولی شده است. همچنین ادم بینابینی و پیرامون عروقیو خونریزی های کانونی در این گروه دیده می شود. دیواره آلوئول های ریوی ضخیم شده و به دلیل هایپرتروفی ماکروفاژهای درون عروقی و بینابینی ریوی و نیز بدلیل نفوذ و حاشیه نشینی نوتروفیل ها در دیواره سیاهرگ ها (margination)، بافت ریه هیپرسلولار به نظر می رسد. تمام این تغییرات نشان دهنده وقوع ذات الریه بینابینی حاد در بافت های ریه نمونه های این مطالعه بود (شکل 1، B1,B2). همچنین، این تغییرات بافتی با شدت های مختلف در سایرگروه های تیمار نیز دیده شد (شکل 1، C,D).

همانطور که در جدول 7 مشاهده می شود، در گروه CLP بطور معنادار نسبت به گروه کنترل، ادم التهابی و ارتشاح نوتروفیل در بافت های بینابینی ایجاد شده و گروه تیمار اسانس نعنا در دز mg/kg b.w50 (شکل 1، C) توانست بطور معنادار باعث کاهش ادم شود. از لحاظ پرخونی، بافت ریه در گروه CLP بطور معنادار پرخون تر از گروه کنترل مشاهده شد و تیمار با اسانس نعنا در دو دز
mg/kg b.w50 و 100 (شکل 1، C,D) توانست بطور معنادار باعث کاهش پرخونی شود (جدول 7).

شاخص شدت ذات الریه بینابینی که از میانگین مقادیر متغییرهای دیگر هر نمونه بدست آمده است نشان می دهد که شدت ذات الریه در گروه CLP نسبت به گروه کنترل به صورت معنا داری بیشتر است و تیمار با اسانس نعنا در دو دز mg/kg b.w50 و 100 (شکل 1، C,D) توانست بطور معنادار باعث کاهش شدت ذات الریه بینابینی شود (جدول 7). کاهش معنی دار شاخص های فوق در گروه تیمار شده با ایندومتاسین نیز دیده شد به طوری که شاخص هیستولوژیکی شدت آسیب بافت ریه و تعداد نوتروفیل های نفوذ یافته و حاشیه نشین شده، پس از تیمار رتهای دچار سپسیس با داروی ایندومتاسین کاهش شدید یافت P<0.05)) (شکل 1، E).

بحث

سپسیس پاسخ سیستمیک میزبان به عفونت، پس از تهاجم پاتوژن های میکروبی به جریان خون است که به دنبال خود، سرکوب ایمنی منجر شونده به عدم عملکرد چندین ارگان و حساسیت به عفونت های بیمارستانی را در پی دارد (1).

 

 

 

جدول 7- میانگین و خطای استاندارد مقادیر عددی شاخص های آسیب شناسی در گروه های مختلف مطالعه

شدت ذات الریه بینابینی

پرخونی

ارتشاح نوتروفیل

ادم التهابی

گروه های مطالعه

2/0±1/1

0±1

3/0±8/0

4/0±6/1

LAP

*1/0±2/3

*2/0±5/3

*2/0±5/3

*1/0±14/3

CLP

**1/0±2

**2/0±4/2

4/0±4/2

**2/0±4/1

E.O50

**1/0±1/2

**2/0±2/2

2/0±2/2

3/0±2

E.O100

**2/0±9/1

**2/0±4/2

2/0±2

**2/0±8/1

Indomethacin

*: دارای اختلاف معنادار با گروه LAP                  **: دارای اختلاف معنادار با گروه CLP

 

 

 

 

شکل 1- (A گروه لاپاراتومی LAP: پرخونی و ادم ملایم بافت بینابینی و عدم مشاهده نوتروفیل در بافت ریه 400* (B1, B2 گروه  CLP : پرخونی شدید، ادم و التهاب وسیع بافت بینابینی ریه ( نواحی که با ستاره مشخص گردیده اند ) 100*، گروه CLP : مشاهده ادم التهابی در اطراف سیاهرگ در بافت بینابینی ریه. تجمع آستین وار نوتروفیل ها در اطراف سیاهرگ (سرپیکان). مرزنشینی نوتروفیل ها در مجاور آندوتلیوم سیاهرگ (پیکان ها). 400*  (C گروه اسانس نعنا در دز mg/kg b.w50: پرخونی و ادم ملایم و ارتشاح نوتروفیلها در بافت بینابینی 400* (D گروه اسانس نعنا در دز mg/kg b.w100 : ارتشاح ملایم نوتروفیل ها در اطراف سیاهرگ ( پیکان بزرگ). مرزنشینی نوتروفیل ها در مجاور آندوتلیوم سیاهرگ (پیکان کوچک). حضور تعدادی ماکروفاژ در بافت بینابینی (سرپیکان) 400* (E گروه ایندومتاسین: لکوسیت های چند هسته ای (پلی مورفونوکلئر) از نوع نوتروفیل نفوذ یافته و حاشیه نشین شده در بافت ریه 400*

 

به طور کلی در مدل CLP، با عمل جراحی (بستن دریچه سکوم و سوراخ کردن آن) میکروارگانیسم‌های روده‌ای به داخل جریان خون نشت پیدا کرده و سپسیس ایجاد می‌شود. ایجاد مدل سپسیس توسط جراحی CLP بسیار کم هزینه و سریع می باشد و استاندارد کردن آن نیز آسان است (26).

نتایج حاصل از بررسی پارامترهای دخیل در آسیب اکسیداتیو در بافت ریه رتهای مبتلا به سپسیس نشان داد که در گروه CLP، سطح پارامترهای مربوط به استرس اکسیداتیو 24 ساعت بعد از القاء سپسیس دچار اختلال می شوند. این پارامترها (آنزیم میلوپراکسیداز، مالون دی آلدهید و گلوتاتیون) از شاخص های وضعیت سیستم استرس اکسیداتیو می باشند که در سپسیس به دلیل نقص در سیستم دفاع آنتی اکسیدانی دچار اختلال می شوند (11). اولین مشاهدات در آسیب اکسیداتیو بافتی حاصل از سپسیس افزایش پراکسیداسیون لیپیدهاLP) ) در بافت ریه در گروه  CLPنسبت به گروه کنترل می باشدP<0.05) ). افزایش LP در بافت مذکور همراه با افزایش فعالیت آنزیم MPO و کاهش سطح گلوتاتیون GSH)) در 24 ساعت پس از القاء سپسیس رخ داده است P<0.05)) (جدول 6، نمودار 1). آنزیم MPO نقش بسیار مهمی را در شروع پراکسیداسیون لیپیدها در سیستم in vivo ایفاء می کند. علاوه بر آن، شروع پراکسیداسیون لیپیدها و تشکیل ایکوزانوئیدهای فعال فرایندهای مهمی در التهاب هستند (54). این داده ها همراه با نتایج هیستوپاتولوژیکی (شکل 1) نشان می دهند که آسیب اکسیداتیو بافت ریه حاصل از سپسیس، تخریب بافتی شدیدی را در 24 ساعت پس از CLP موجب شده است. مطالعات دیگر نیز نشان دادند که در مدل التهابی CLP، تغییر پارامترهای دخیل در استرس اکسیداتیو منجر به آسیب بافتی می شود که با نتایج تحقیق حاضر مطابقت دارد (4، 44).

همچنین نتایج حاصل از بررسی مارکرهای آسیب اکسیداتیو بافتی نظیر MPO, GSH, LP در بافت ریه نشان می دهند که اسانس نعنا در هر دو دز 50 و100 میلی گرم به ازاء هر کیلوگرم وزن بدن باعث مهار تغییر پارامترهای فوق در رتهای مبتلا به سپسیس در 24 ساعت پس از CLP می گردد (جدول 6، نمودار 1) که نتایج پاتولوژی نیز اثر اسانس نعنا در تعدیل آسیب بافتی را تایید می کند (شکل 1، C, D). جبران کاهش گلوتاتیون که یک جزء مهم از سیستم حفاظتی داخل سلولی بر علیه استرس اکسیداتیو می‍باشد، منجر به بازیافت مکانیسم دفاع سلولی و توقف پراکسیداسیون لیپیدها گردیده که در نتیجه سلول را در مقابل آسیب اکسیداتیو بافتی محافظت می کند. این نتیجه با گزارش ارائه شده توسطVilla  مبنی بر نقش محافظتی گلوتاتیون در سپسیس مطابقت دارد (51). از سوی دیگر نتایج به دست آمده در این مطالعه نشان داد که میزان FRAP در نمونه ی پلاسمای موش های سپتیکی، 24 ساعت پس از ایجاد CLP کاهش می یابد و تیمار رت ها با اسانس نعنا در دوزهای kg/mg b.w 50 و 100  باعث افزایش و بازگشت سطح ظرفیت آنتی اکسیدانی کل پلاسما (FRAP) به حالت نرمال می شود (جدول 6). اندازه گیری های انجام گرفته در بیماران مبتلا به شوک سپتیک نشان می دهد که میزان FRAP و فاکتورهای دخیل در آن مثل اسید اوریک و بیلی روبین متناسب با شدت سپسیس افزایش می یابد (5). علاوه بر این، نتایج حاصل از تحقیق نشان می دهد که بیماری سپسیس تاثیری بر آنزیم GST ندارد (جدول 6). این نکته حائز اهمیت است که نتایج حاصل از تیمار رت های مبتلا به سپسیس با اسانس نعنا با دوز 50 و100 میلی گرم به ازاء هر کیلوگرم وزن بدن همانند نتایج حاصل از داروی شناخته شده ضد التهابی ایندومتاسین -که در این تحقیق به عنوان گروه کنترل مثبت استفاده شده است- می باشد.

بر اساس آنالیز GC-MS بیشترین ترکیبات موجود در اسانس نعنا کاروون و لیمونن بودند (جدول 5). بسیاری از مطالعات نشان داده اند که این دو ترکیب در خانواده نعنا دارای خواص بسیاری از جمله خواص ضد باکتریایی، ضد قارچی و آنتی اکسیدانی هستند (20، 31، 46، 53).  بر اساس این مطالعات، انتظار می رود که مصرف اسانس توسط حیوانات سپتیکی منجر به تعدیل پارامترهای مرتبط با واکنش های استرس اکسیداتیو/آنتی اکسیدانی شود. برخی از مطالعات in vivo و in vitro نیز نشان داده اند که آنتی اکسیدانهای طبیعی، بافت ها را در مقابل آسیب اکسیداتیو القاء شده توسط عوامل تولید کننده رادیکال های آزاد محافظت می کنند. به عنوان مثال، سیلیمارین (مخلوطی از فلاونولیگنان های جدا شده از گیاه خار مریم) با کاهش پراکسیداسیون لیپیدها و افزایش گلوتاتیون از آسیب اکسیداتیو بافتی حاصل از استامینوفن در مغز رت جلوگیری می کند (36). دیگر مطالعات نیز نشان داده اند که آنتی اکسیدان هایی از قبیل سیلیمارین و  N– استیل سیستئین با تعدیل پارامتر های دخیل در استرس اکسیداتیو از جمله گلوتاتیون، پراکسیداسیون لیپیدها و آنزیم میلوپراکسیداز، از آسیب اکسیداتیو بافتی به خصوص کبد و ریه در سپسیس جلوگیری می کنند (21، 48). تیمار رت های مدل CLP با متیلن بلو نیز با تعدیل عوامل دخیل در استرس اکسیداتیو از جمله گلوتاتیون، پراکسیداسیون لیپیدها، آنزیم میلوپراکسیداز، کاتالاز و سوپراکسید دسموتاز در بافت ریه از آسیب اکسیداتیو این بافت در رت های سپتیکی جلوگیری می کند (13). علاوه بر این، در مطالعه­ای نشان داده شد که کورکومین موجود در زردچوبه از طریق خواص ضد التهابی و آنتی اکسیدانی خود دارای اثرات مفیدی بر روی آسیب کبدی رت های نژاد ویستار داشته است (3). مطالعه­ی دیگری نشان داد تیمار حیوانات با اسانس آویشن شیرازی، از طریق تعدیل پارامترهای دخیل در متابولیسم گزنوبیوتیک هاCYP 450) ، (GST و مهار افزایش سطح  ASTسرم به عنوان مارکر آسیب کبدی، منجر به کاهش آسیب های بافتی کبد ناشی از مسمویت نانوذرات آهن می شود (2).

بررسی پارامتر دخیل در فرایند التهاب در گروه CLP نشان داد که افزایش تولید ROS در رت های سپتیکی منجر به افزایش بیان ژن COX-2 و منجر به افزایش تولید PGE2 و در نتیجه افزایش سطح آن در پلاسما می شود که در نهایت منجر به آسیب بافتی در ریه می گردد (نمودار 3). در سپسیس و التهاب حاد، افزایش تولید رادیکال های آزاد و میانکنش بین انواع سایتوکین های پیش التهابی و ضدالتهابی باعث از کار افتادن بسیاری از ارگان ها و در نهایت مرگ می گردد (14، 40). در این بیماری، اجزاء مهمی از فرایندهای پاتولوژیکی دست به دست هم می دهند تا نوتروفیل ها را برای آزادسازی یک سری از واسطه هایی که در تخریب سلول های نرمال نقش دارند، تحریک کنند. در این میان افزایش تولید ROS توسط ماکروفاژها، نقش مهمی را در آغاز فرآیند التهاب بازی می کند. مطالعات نشان می دهند که القاء ژن COX-2 با تشدید استرس اکسیداتیو در گسترش آسیب های بافتی ناشی از التهاب نقش مهمی دارند (14). همچنین نتایج حاصل از بررسی بیان ژن COX-2 و PGE2 در بافت ریه نشان می دهد که اسانس نعنا در هر دو دز 50 و100 میلی گرم به ازاء هر کیلوگرم وزن بدن باعث تعدیل بیان این ژن و محصول آن (PGE2) در رتهای مبتلا به سپسیس در 24 ساعت پس از CLP می گردد. قابل ذکر است که بیان ژن COX-2 در سلولهای نرمال در سطح بسیار پایینی قرار دارد. این آنزیم در ماکروفاژها و سلول های آندوتلیال در طول شرایط التهابی از جمله سپسیس القاء گردیده و افزایش شدیدی می یابد (12).

به طور خلاصه این نتایج  بیان می کنند که اسانس نعنا با خواص آنتی اکسیدانی و ضد التهابی دارای نقش محافظتی در برابر عوارض و آسیب های بافتی ناشی از سپسیس می باشد که در نهایت منجر به کاهش آسیب های ناشی از سپسیس در بافت ریه می شود. این نتایج با مشاهدات هیستوپاتولوژی نیز تایید شده است.

1. دکتر عبدالرضا اسماعیل زاده، نازیلا بهمئی. 1394. نشریه ی آزمایشگاه و تشخیص سال هفتم – شماره ی 30، 53-64.

2. حدیث کوهی نژاد، آزاده رسولی، رضا حاجی حسینی، آتوسا وزیری، میثم صغیری. 1396. بررسی تاثیر اسانس آویشن شیرازی بر روی متابولیسم گزنوبیوتیک ها در مسمویت حاد ناشی از نانو ذرات آهن. مجله پژوهشهای جانوری(مجله زیست شناسی ایران)، آماده انتشار.

3. محمد نبیونی، ویدا حجتی، آزیتا قربانی و لطیفه کریم زاده باردئی. 1395. اثرات کورکومین بر کبد رت­های ویستار مبتلا به سندرم تخمدان پلیکیستیک القاء شده با استرادیول والرات. مجله پژوهشهای جانوری(مجله زیست شناسی ایران)، جلد 29، شماره 1، صفحات 118-106.

 

4. Aksoy AN, Toker A, Celik M, Aksoy M, Halici Z, Aksoy H. 2014. The effect of progesterone on systemic inflammation and oxidative stress in the rat model of sepsis. Indian J Pharmacol. 46: 622-626.

5. Andresen M, Regueira T, Bruhn A, Perez D, Strobel P, Dougnac A, Marshall G, Leighton F. 2008. Lipoperoxidation and protein oxidative damage exhibit different kinetics during septic shock. Mediators Inflamm.16: 1-8.

6. Angus DC, van der Poll T. 2013. Severe sepsis and septic shock. N Engl J Med. 369 (9): 840-851.

7. Basu S, Eriksson M. 2000. Lipid Peroxidation Induced by an Early Inflammatory Response in Endotoxaemia. Acta Anaesthesiol Scand.14:17-23.

8. Basu S, Eriksson M. 2006. Vitamin E in Relation to Lipid Peroxidation in Experimental Septic Shock. Eur J Pharmacol. 534: 202-209.

9. Benzie IFF, Strain JJ. 1996. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of antioxidant power: the FRAP assay. Anal Biochem. 239: 70-76.

10. Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72(1-2): 248-254.

11. Cherian S, Jameson S, Rajarajeswari C, Helena V, Latha L, Anu Rekha MR, Nagamma T, Subba Raju V, Kini PG, Rao A. 2007. Oxidative stress in sepsis in children. Indian J Med Res. 125(2): 143-148.

12. Crofford LJ, Lipsky PE, Brooks P, Abramson SB, Simon LS, van de Putte LB. 2000. Basic biology and clinical application of specific cyclooxygenase-2 inhibitors. Arthritis Rheum. 43(1): 4-13.

13. Demirbilek S, Sizanli E, Karadag N, Karaman A, Bayraktar N, Turkmen E, Ersoy MO. 2006. The effects of methylene blue on lung injury in septic rats. Eur Surg Res.  38(1): 35-41.

14. Esmaeili B, Rezaee SAR, Layegh P, Tavakkol Afshari J, Phil Dye PH, Ghayoor Karimiani E, Kalalinia F, Rafatpanah H. 2011. Expression of IL-17 and COX2 Gene in Peripheral Blood Leukocytes of Vitiligo Patients. Iran J Allergy Asthma Immunol. 10(2): 81-89.

15. Fatemi F, Allameh A, Khalafi H, Ashrafihelan J. 2010a. Hepatoprotective effects of g-irradiated caraway essential oils in experimental sepsis. Appl Radiat Isotopes. 68: 280-285.

16. Fatemi F, Allameh A, Khalafi H, Rajaee R, Davoodian N, Rezaei MB. 2011. Biochemical properties of γ-irradiated caraway essential oils. J Food Biochem. 35: 650-62.

17. Fatemi F, Allameh A, Khalafi H, Rezaei MB, Seyhoon M. 2010b. The effect of essential oils and hydroalcoholic extract of caraway seed on oxidative stress parameters in rats suffering from acute lung inflammation before and after γ-irradiation. J Med Aroma Plant. 25(4): 441-455.

18. Fatemi F, Allameh A, Khalafi H, Rezaei MB, Seyhoon M. 2010. The effect of essential oils and hydroalcoholic extract of caraway seed on oxidative stress parameters in rats suffering from acute lung inflammation before and after γ-irradiation. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants. 25(4): 441-445.

19. Ghaderi P, Ahmadi R, Balkanyian F,  Moridikyia A,  Mahdavi  E, Tavakoli  P. 2014. In-vitro antibacterial activity of bunium persicumand Mentha longifolia against Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus. International Conference on Chemical, Agricultural and Medical Sciences. May 2-3, Antalya, Turkey.

20. Golluce M, Sahin F, Sokmen M, Ozer H, Daferera D, Sokmen A, Polissiou M, Adiguzel A, Ozken H. 2007. Antimicrobial and antioxidant properties of the essential oils and methanol extract from Mentha longifolia L.ssp.longifolia. Food Chem. 103(4):1449-1456.

21. Gürer A, Ozdoğan M, Gökakin AK, Gömceli I, Gülbaha RO, Arikök AT, Kulaçoğlu H, Aydin R. 2009. Tissue oxidative stress level and remote organ injury in two-hit trauma model of sequential burn injury and peritoneal sepsis are attenuated with N-acetylcysteine treatment in rats. Ulus Travma Acil Cerrahi Derg. 15(1): 1-6.

22. Gutteridge JM, Mitchell J. 1999. Redox Imbalance in the Critically Ill. Br Med Bull. 55: 9-75.

23. Hillegass LM, Griswold DE, Brickson B, Albrightson- Winslow C. 1990. Assessment of myeloperoxidase activity in whole rat kidney. J Pharmacol Methods. 24(4): 285-295.

24. Hotchkiss RS, Monneret G, Payen D. 2013. Immunosuppression in sepsis: a novel understanding of the disorder and a new therapeutic approach. Lancet Infect Dis. 13(3): 260-268.

25. Hotchkiss RS, Monneret G, Payen D. 2013. Sepsis-induced immunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy. Nat Rev. Immunol. 13(12): 862-874.

26. Hubbard WJ, Choudhry M, Schwacha MG, Kerby JD. 2005. Cecal ligation and puncture. Shock. 24(1): 52-57.

27. Jalilzadeh-Amin G, Maham  M. 2015. Antidiarrheal activity and acute oral toxicity of Mentha longifolia L. essential oil. AJP. 5: 128-137.

28. Jalilzadeh-Amin G, Maham M. 2015. The application of 1,8-cineole, a terpenoid oxide present in medicinal plants, inhibits castor oil-induced diarrhea in rats. Pharm Biol. 53(4): 594-9.

29. Jalilzadeh-Amin G, Mahama M. 2013. Evaluation of pulegone on transit time and castor-oil induced diarrhea in rat. Pharmaceutical Sci. 19: 77-82.

30. Kagan Coskun  A , Yigiter M , Oral  A, Odabasoglu F, Halici Z, Mentes O , Cadirci E , Atalay F , Suleyman H. 2011. The Effects of Montelukast on Antioxidant Enzymes and Proinflammatory Cytokines on the Heart, Liver, Lungs, and Kidneys in a Rat Model of Cecal Ligation and Puncture–Induced Sepsis. Sci World J. 11: 1341-1356.

31. Kamkar A, Asadi F, Jebelli Javan A, Jamshidi R. 2009. Antioxidant capacity of essential oil and extract of Iranian Mentha spicat. J Vet Med Lab. 1: 69-77.

32. Keller SA, Paxian M, Lee SM, Clemens MG and Huynh T. 2005. Kupffer Cell Ablation Attenuates Cyclooxygenase-2 Expression after Trauma and Sepsis. J Sur Res. 124:126-133.

33. Levy MM, Artigas A, Phillips GS, Rhodes A, Beale R, Osborn T, Vincent JL, Townsend S, Lemeshow S, Dellinger RP. 2012. Outcomes of the surviving depsis campaign in intensive care units in the USA and Europe: a prospective cohort study. Lancet Infect. Dis. 12 (12): 919-924.

34.  Mayr FB, Yende S, Angus DC. 2014. Epidemiology of severe sepsis. Virulence. 5 (1): 4-11.

35. Nelson SD. 1995. Mechanisms of the formation and disposition of reactive metabolites that can cause acute liver injury. Drug Metab Rev. 27: 147-177.

36. Nencini C, Giorgi G, Micheli L. 2007. Protective effect of silymarine stress in rat brain. Phytomedicine. 14: 129-135.

37. Pavon A, Binquet C, Kara F, Martinet O, Ganster F, Navellou JC, Castelain V, Barraud D, Cousson J, Louis G, Perez P, Kuteifan K, Noirot A, Badie J, Mezher C, Lessire H, Quantin C, Abrahamowicz M, Quenot JP. 2013. Profile of the risk of death after septic shock in the present era: an epidemiologic study, Crit. Care Med. 41 (11): 2600-2609.

38. Prasad S, Subash C.Gupta, Amit K.Tyagi. 2017. Reactive oxygen species (ROS) and cancer: Role of antioxidative nutraceuticals. Cancer Lett. 387: 95-105.

39. Quenot JP, Binquet C, Kara F, Martinet O, Ganster F, Navellou JC, Castelain V, Barraud D, Cousson J, Louis G, Perez P, Kuteifan K, Noirot A, Badie J, Mezher C, Lessire H, Pavon AE. 2013. Study Group, The epidemiology of septic shock in French intensive care units: the prospective multicenter cohort EPISS study, Crit. Care 17 (2): R65.

40. Rackow EC, Astiz ME. 1991. Pathophysiology and treatment of septic shock. JAMA. 266: 548.

41. Razavi SM, Zarrini G. and Molavi G. 2012. The evaluation of some biological activity of Mentha longifolia (L.) Huds growing wild in Iran. Pharmacologia. 3(10): 535-538.

42. Saeidi S, Hassanpour K, Ghamgosha M, Heiat M, Taheri RA, Mirhosseini A, Farnoosh G. 2014. Antibacterial activity of ethyl acetate and aqueous extracts of Menthalongifolia L. and hydroalcoholic extract of  Zataria multiflora Boiss. plants against important human pathogens. Asian Pac J Trop Med. 7(1): S186-S189 .

43. Seldak J, Limdsay. 1986. Estimation of total protein bound and non-protein sulfidryl groups in tissue with Elman, s reagent. Anal Biochem. 25: 192-205.

44. Şener G, Toklu H, Ercan F, Erkanli G. 2005. Protective effect of b-glucan against oxidative organ injury in a rat model of sepsis. Int Immunopharmacol. 5: 1387-96.

45. Sharma RA, Dalgleish AG, Steward WP, O'byrne KJ. 2003. Angiogenesis and the immune response as targets for the prevention and treatment of colorectal cancer (Review). Oncol Rep. 10: 1625-1631.

46. Singh R, Muftah A, Shoshni M, Asma B. 2011. Antibacterial and antioxidant activities of Mentha piperita L. Arab J Chem. 10:1016-1017.

47. Swan DK, Ford B. 1997. Chemoprevention of cancer: review of the literature. Oncol NursForum. 24: 719-727.

48. Toklu HZ, Tunali Akbay T, Velioglu-Ogunc A, Ercan F, Gedik N, Keyer-Uysal M, Sener G. 2008. Silymarin, the antioxidant component of Silybum marianum, prevents sepsis-induced acute lung and brain injury. J Surg Res. 145(2): 214-22.

49. Unnithan CR, Gebreselassie H, Sushen U, Reddy DN, Woldu A, Muuz M. 2013. Chemical composition and antibacterial activity of essential oil of Mentha longifolia L of Mekole, Ethiopia. J Biol Scie Opin. 1(3): 151-153.

50. Victor VM, Rocha M, Fuente MD. 2004. Immune Cells: Free Radicals and Antioxidants in Sepsis. Int Immunopharmacol. 4: 327-347.

51. Villa P, Saccani A, Sica A. 2002. Glutathione protects mice from lethal sepsis by limiting inflammation and potentiating host defense.  J Infect Dis. 185: 1115-20.

52. Wills ED. 1969. Lipid peroxide formation in microsomes: General consideration. Biochem J. 113: 315-324.

53. Zare Bidaki M, Arab M, Khazaei M, Afkar E. 2014. Anti-bacterial effect of Mentha spicata L. essence on eight standard species of gastrointestinal pathogens. J Birjand Univ Med Sci. 21 (3): 274-282.

54. Zhang R, Brennan ML, Shen Z, Macpherson JC, Schmitt D, Cheryl Molenda Ch, Hazen SL. 2002. Myeloperoxidase Functions as a Major Enzymatic Catalyst for initiation of Lipid Peroxidation at Sites of Inflammation. J Bio Chem. 277(48): 46116-22.