بررسی نرزایی دو گونه گیاه دارویی مرزه خوزستانی

(Satureja khuzistanica Jamzad) و مرزه رشینگری (S. rechingeri Jamzad)

مصطفی افضلی فر¹، جواد هادیان^1*، محمد حسین میرجلیلی¹ و مهران عنایت شریعت پناهی²

¹ ایران، تهران، دانشگاه شهید بهشتی، پژوهشکده گیاهان و مواد اولیه دارویی، گروه کشاورزی

² ایران، کرج، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی

تاریخ دریافت: 27/10/93              تاریخ پذیرش: 16/11/96

چکیده

در این تحقیق کشت بساک و میکروسپور دو گونه گیاه دارویی مرزه خوزستانی و مرزه رشینگری با هدف باززایی گیاهان هاپلویید مورد مطالعه قرار گرفت. در ابتدا مرحله نموی تک هسته­ای میکروسپورها با رنگ­آمیزی استوکارمن مشخص و ارتباط آن با اندازه غنچه گل تعیین گردید. در کشت بساک، تأثیر پیش تیمارهای دمایی، تیمارهای هورمونی و نوع کربوهیدرات (مالتوز، ساکارز) در محیط القای  N6 بررسی شد. تراز پلوییدی کالوسهای باززایی شده با استفاده از فلوسایتومتری تعیین گردید. کشت میکروسپور نیز در سه محیط کشت A2-60، FHG و NLN-13 با کاربرد پیش تیمارهای تنشی مختلف (دمایی، هورمونی و گرسنگی) انجام شد. در هر دو گونه، بیشترین درصد کالوس­زایی بساک در ترکیب هورمونی 5/0 میلی گرم در لیتر از بنزیل آدنین، توفوردی و کینتین و پیش تیمار دمایی30 درجه­سانتی­گراد به مدت 3 روز حاصل شد. نتایج آنالیز فلوسایتومتری این کالوسها نشان داد که اکثر آنها از نظر تراز پلوییدی مشابه گیاهان مادری بودند و هاپلوییدی فقط در گونه مرزه رشینگری در کالوس حاصل از ترکیب هورمونی 5/0 میلی گرم در لیتراز بنزیل آدنین، توفوردی و کینتین مشاهده شد. در محیط باززایی (MS)، کالوسها تنها تولید ریشه کردند و شاخه­زایی مشاهده نشد. نتایج کشت میکروسپور نشان داد که در هر دو گونه بیشترین تعداد ساختار­های چند سلولی در محیطهای FHG و NLN-13 با پیش تیمار دمایی 30 درجه­سانتی­گراد به مدت 8 روز به دست آمد. ساختار­های چند سلولی فقط در محیط القایی NLN-13 توانستند به ساختارهای شبه جنینی قلبی شکل نمو یابند. نتایج این تحقیق اطلاعات مناسبی برای نرزایی در این دو گونه فراهم آورد.

واژه های کلیدی: مرزه خوزستانی، مرزه رشینگری، کشت بساک، کشت میکروسپور، اصلاح

* نویسنده مسئول، تلفن 02129904047،  پست الکترونیکی: j_hadian@sbu.ac.ir

مقدمه

مرزه خوزستانی (Satureja khuzistanica Jamzad) و مرزه رشینگری (S. rechingeri Jamzad) از گونه­های انحصاری جنس مرزه در ایران، متعلق به خانواده نعناعیان (Lamiaceae) می­باشند که در مناطق خشک، آفتابی و خاکهای سنگلاخی آهکی جنوب غرب ایران در استانهای لرستان، ایلام و خوزستان رشد می­کنند (1، 2، 18 و  19). هردو گونه در طب سنتی به عنوان مسکن و ضد عفونی کننده همچنین به عنوان دمنوش و ادویه مورد استفاده قرار می گیرند. در سالهای اخیر مطالعات گسترده­ای روی جنبه های فیتوشیمیایی همچنین اثرات بیولوژیکی و دارویی این گیاهان از جمله خواص آنتی اکسیدانی، ضد میکروبی، ضد دیابت، ضد درد، ضد تورم و ضد چربی آنها انجام و نتایج جالب توجهی به دست آمده است (3، 4، 5، 14، 34، 35 و 43). این گونه­ها به دلیل داشتن کارواکرول بالا در اسانس و اسید­های فنولی آزاد به ویژه رزمارینیک اسید در عصاره  از نظر تجاری (کاربرد های دارویی، غذایی، آرایشی، بهداشتی) حائز اهمیت بوده و در سالهای اخیر در سطح بیش از 20 هکتار به صورت تجاری مورد کشت و کار قرار گرفته اند (2، 3، 8، 16،13، 31 و 32).

با توجه به پراکنش محدود دو گونه مرزه خوزستانی و مرزه رشینگری در رویشگاههای طبیعی و گسترش تقاضا برای مواد اولیه گیاهی، ایجاد ارقام مرغوب و همگن جهت کشت در نظام کشاورزی و تأمین مواد اولیه گیاهی مورد نیاز صنایع دارویی

ضروری می­باشد (15 و 16). بررسیهای اولیه نشان داده است که تنوع قابل توجهی از نظر صفات شیمیایی و تولیدی درون و بین رویشگاهها وجود دارد (15 و 16). به  دلیل دگر­گشن بودن این گونه ها، حفظ کلونهای برتر شناسایی شده فقط از طریق تکثیر رویشی امکان پذیر است که هزینه بالایی نسبت به تکثیر با بذر را در بر دارد. به همین دلیل جهت توسعه کشت تجاری این دو گونه، اصلاح رقم بذری همگن و مرغوب مد نظر می باشد (15 و 16).

تولید لاینهای خویش­آمیز به عنوان اولین مرحله در تولید بذور هیبرید و سنتتیک از طریق روشهای سنتی نیاز به چندین نسل خویش آمیزی دارد که فرآیندی وقت گیر و هزینه بر است و در نهایت هموزیگوسیتی کامل نیز به دست نمی آید (27). در مقابل، با دستیابی به فنون تولید گیاهان ­هاپلویید مضاعف شده خالص از طریق کشت بساک یا کشت میکروسپور، این فرآیند در زمان کوتاه و باصرف هزینه کم قابل انجام بوده و گیاهان به دست آمده 100 درصد خالص خواهند بود (9، 17 و 27). عوامل چندی ازجمله ژنوتیپ، شرایط رشدی گیاهان مادری، مرحله نموی دانه گرده، پیش تیمارهای تنشی و ترکیب محیط کشت در موفقیت نرزایی مؤثر هستند (10، 22 و 39). یکی از عوامل تعیین کننده در موفقیت نرزایی زمان برداشت بساکها می­باشد که مناسب­ترین بساکها آنهایی هستند که حاوی میکروسپور تک هسته­ای باشند (38). میکروسپورها در حالت طبیعی یا در شرایط معمول کشت درون شیشه­ای، مسیر طبیعی تکامل فردی (Ontogeny) خود در فاز زایشی را سپری کرده و به دانه گرده رسیده تبدیل می­شوند. این مسیر را می توان از طریق اعمال تنش مناسب به فاز رویشی تغییر  داده و از میکروسپورهای جدا شده تولید جنین نمود (9و36).

کشت بساک و میکروسپور تا کنون در گونه­های مختلف گیاهی مورد بررسی قرار گرفته  که در بسیاری از موارد  موفقیت آمیز بوده است (9، 10، 12، 20، 29 و 39). مطالعات نرزایی در گونه­های مختلف گیاهان دارویی محدود بوده، با این حال، در سالهای اخیر چنین مطالعاتی رو به افزایش است (11، 24، 42 و 43).  در مطالعه نرزایی از گونه­های مختلف نعناییان چون زوفا، ریحان، اسطوخودوس، رزماری، مرزه تابستانه و آویشن موفقیتی گزارش نشده است (9 و 11). با این حال، نرزایی در مورد گیاهانی چون بادرنجبویه از خانواده نعناییان (21)، سرخارگل از خانواده کاسنی (45)، زیره سیاه اروپایی از خانواده چتریان (9) گزارش شده است. 

این تحقیق با هدف دستیابی به شرایط بهینه جهت نرزایی دو گونه مرزه خوزستانی و مرزه رشینگری انجام شد. در ابتدا مراحل نموی دانه گرده و ارتباط آن با اندازه گل در هر دو گونه مرزه خوزستانی و مرزه رشینگری تعیین شد. سپس تأثیر برخی تیمارها بر نرزایی از کشت بساک و میکروسپور هردو گونه مورد بررسی قرار گرفت. این اولین گزارش در مورد نرزایی در این گونه­ها است که می­تواند اطلاعات مفید و مؤثری برای ادامه تحقیقات در این زمینه باشد تا نهایتاً با ایجاد لاینهای هاپلویید مضاعف و تولید ارقام مناسب، کشت تجاری این گونه ها با صرفه اقتصادی بیشتر توسعه یابد.

مواد و روشها

مواد گیاهی: به منظور استفاده از مواد گیاهی همگن در این آزمایش، از دو کلون برتر مرزه خوزستانی (A 28) و مرزه رشینگری (Khaz 8) از نظر ویژگیهای تولیدی و فیتوشیمیایی که در مطالعات قبلی شناسایی شده استفاده شد. گیاهان مادری این کلونها در مزرعه تحقیقاتی کشکان متعلق به شرکت داروسازی خرمان واقع در خرم آباد کشت شده اند. در اواخر پاییز، قلمه های هر یک از کلونها از این مزرعه تهیه و پس از انتقال به گلخانه پژوهشکده گیاهان دارویی، دانشگاه شهید بهشتی در بستر ماسه در گلدانهای استکانی کشت و پس از ریشه زایی کامل در اواخر اردیبهشت ماه به گلدانهای بزرگتر با بستر ماسه، خاک باغچه و کود دامی پوسیده به نسبت 2 : 2: 1 منتقل شدند. گلدانها تا زمان گلدهی در گلخانه نگهداری و هر 5 روز یکبار آبیاری شدند. گیاهان از اواسط شهریور شروع به گلدهی کردند که گلها جهت انجام آزمایشات از هر یک از کلونها برداشت شدند. از هریک از کلونها یک نمونه هرباریومی در هرباریوم پژوهشکده گیاهان دارویی، دانشگاه شهید بهشتی ثبت گردید.

تعیین مراحل نموی میکروسپور: به منظور تعیین مرحله نموی میکروسپور و ارتباط آن با اندازه گل، غنچه­ها در اندازه های مختلف (از هر مرحله رشدی 20 غنچه) از هرگونه برداشت و پس از بررسی ریخت شناسی، در محلول کارنوی تثبیت و در اتانول 70 درصد نگهداری شدند. در ادامه، بساکها با پنس از گل خارج، با آب مقطر شسته شده و با یک قطره محلول استوکارمن در مقابل حرارت غیر مستقیم (بخار آب) رنگ آمیزی و به وسیله میکروسکوپ نوری بررسی شدند (21 و 23).

کشت بساک: گلهای هر گونه با توجه به اندازه غنچه­ها در مرحله نموی مناسب (انتهای تک هسته­ای) جهت کشت بساک جمع­آوری شدند. جهت سترون سازی، غوطه­وری در اتانول 70 درصد به مدت30 ثانیه، شستشو با آب مقطر سترون، همزدن در هیپوکلریت سدیم 3 درصد به مدت 6 دقیقه به آرامی و در نهایت سه بار شستشو با آب مقطر سترون هر بار به مدت 4 دقیقه انجام شد (21، 45).

جهت القای کالوس از بساک، با توجه به تجربیات مختلف محققین در مطالعه نرزایی (4، 6، 11، 20، 22، 25، 28، 29 و 42)، تأثیر نوع کربوهیدرات (مالتوز، ساکارز)، تیمارهای هورمونی (A: 5/0 میلی گرم در لیتر بنزیل آدنین، 5/0 میلی گرم در لیتر 2 و4 دی کلرو فنوکسی استیک اسید و 5/0 میلی گرم در لیتر کینتین، B: 1 میلی گرم در لیتر بنزیل آدنین، 5/0 میلی گرم در لیتر 2 و4 دی کلرو فنوکسی استیک اسید و 36/0 میلی گرم در لیتر کینتین، C: 1 میلی گرم در لیتر بنزیل آدنین، 1 میلی گرم در لیتر 2 و4 دی کلرو فنوکسی استیک اسید و صفر میلی گرم در لیتر کینتین، D: شاهد) و پیش تیمارهای دمایی(دماهای 4 درجه سانتی گراد به مدت 7 روز، 30 درجه­سانتی­گراد به مدت 3 روز و 24 درجه سانتی گراد به عنوان شاهد) در محیط کشت  N6(6) مورد بررسی قرار گرفت. درون هر پتری­دیش 12 بساک قرار داده شد که پس از اعمال پیش تیمارها، در شرایط تاریکی و دمای 24 درجه­سانتی­گراد نگهداری شدند. پس از 25 روز درصد کالوس­زایی در تیمارهای مختلف بررسی و ثبت شد و کالوسها به منظور باززایی به محیط کشت  MS (30) با ترکیبات مختلف دو هورمون BA (0، 5/0، 1، 5/1 میلی گرم در لیتر) و NAA (0، 1/0، 3/0، 5/0، 7/0 میلی گرم در لیتر) در شرایط دمایی 24 درجه­سانتی­گراد، 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی منتقل شدند. در طول این دوره نیز تغییرات (تغییر رنگ کالوس، شاخه زایی، ریشه زایی) ثبت شد. این آزمایشها به صورت فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی در سه تکرار اجرا و تجزیه واریانس داده­های به دست آمده در سطح 5 درصد با استفاده از نرم افزار SAS انجام شد.

تعیین تراز پلوییدی کالوسها:  برای  تعیین  تراز  پلوییدی

کالوسهای حاصل از کشت بساک، از دستگاه فلوسایتومتری (pA 1 Partec, Germany) مجهز به لامپ UV-arc پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی کرج استفاده شد(40). بدین منظور تعداد 20 نمونه کالوس به طور تصادفی از هر تیمار انتخاب و برای تعیین تراز پلوییدی مورد استفاده قرار گرفت. نمونه کالوس داخل یک پتری­دیش دارای 400 میکرولیتر محلول استخراج هسته سلولی، به قطعات کوچک تقسیم گردید و نمونه­ها از صافیهای 50 میکرومتری عبور داده شد. سپس با 1600 میکرولیتر از محلول رنگ­آمیزی DNA به نام DAPI رنگ­آمیزی شدند و پس از مدت 2 الی3 دقیقه نمونه­ها درون دستگاه قرارداده شدند. با توجه به تراز پلوییدی دو گونه مرزه خوزستانی (2C DNA= 1.446 pg) و مرزه رشینگری (2CDNA= 1.456 pg) (37)، برای سنجش تراز پلوییدی کالوسها از گیاه جعفری (Petroselinum sativum) (2n=22 , 2c=4.48 pg) به عنوان گیاه استاندارد استفاده شد.

کشت میکروسپور: پس از جمع آوری گلها در مرحله نموی مناسب ( انتهای تک هسته­ای) و ضدعفونی آنها، جدا سازی میکروسپور (له کردن غنچه ها در شرایط استریل در محیط جدا سازی با پیستون سرنگ، عبور از فیلتر با مش 45 میکرومتر سپس سانتریفیوژ با 900 دور در دقیقه به مدت 3 دقیقه و جدا نمودن رسوب میکروسپور از ته فالکون) انجام شد. به این منظور از دو محیط جداسازی AB (23) و ساکارز 13 درصد  (10) با 6 pH= استفاده شد. با توجه به نتایج بهتر محیط جداسازی ساکارز 13 درصد، در ادامه از این محیط جداسازی استفاده شد.

کشت میکروسپور در سه محیط کشت جنین­زایی شامل A2-60 (39)، FHG (17) و  NLN-13 (25) انجام شد. جهت تغییر فاز نموی میکروسپور­ها از زایشی (گامتوفیتی) به رویشی (اسپوروفیتی) از  پیش تیمار­های مختلف گرسنگی کربنB (دارای 65 میلی­گرم در لیتر از KCl، 600 میلی­گرم در لیتر از  KH₂PO₄، 125 میلی­گرم در لیتر از MgSO₄,7H2O،  65/45 میلی­گرم در لیتر از مانیتول و 500 میلی­گرم در لیتر Ca(NO₃)₂,4H₂O) (33) به مدت 1، 3 و 5 روز، تیمارهای دمایی (شامل دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 4، 7، 10 روز و دمای 30 درجه سانتی­گراد به مدت 3، 5، 8 روز) و تیمار هورمونی2, 4-D (با غلظتهای 25، 35، 45 میلی­گرم بر لیتر به مدت 30 دقیقه) استفاده شد. نمونه های شاهد بدون تیمار و در دمای محیط باقی ماندند. تیمارها به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار مورد بررسی قرار گرفت.

در شرایط استریل زیر هود، 15 غنچه ضدعفونی شده در 4 تا 5 میلی­لیتر محیط جداسازی با استفاده از پیستون سرنگ استریل له شده و از الک آزمایشگاهی 45 میکرومتری عبور داده شدند. سوسپانسیون حاصل به فالکون­های 15 میلی لیتری منتقل و دو بار به مدت 3 دقیقه با 900 دور در دقیقه در دمای 5 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شدند. در ادامه 2 سی سی محیط کشت جنین­زایی به رسوب ته فالکون اضافه و همزده شد تا سوسپانسیون یکنواختی تشکیل شود. سپس 300 میکرولیتر از این سوسپانسیون به پتری دیشهای حاوی محیط جنین­زایی اضافه و با پارافیلم درز­گیری شد. تراکم نهایی حدود 20000 میکروسپور در میلی لیتر بود.  پس از اعمال پیش تیمارها همه پتریها به اتاق کشت با دمای 25 درجه و شرایط تاریکی منتقل شد و هر 4 روز یکبار محیطها جهت بررسی وضعیت میکروسپورها به وسیله میکروسکوپ اینورت (BXS1, Olympus, Japan) بررسی و تغییرات (تقسیمات سلولی) ثبت شدند.

آنالیز آماری: تجزیه واریانس و مقایسه میانگین (آزمون دانکن) صفات بررسی شده به وسیله نرم افزار SAS ver. 9.1 و رسم نمودارها به وسیله نرم افزار Exele انجام شد.

نتایج

تعیین مراحل  نموی  میکروسپور:  میانگین  طول  گلهای

مورد بررسی در هر دو گونه بین 3 تا 5/5 میلی متر بود.

بررسی بساک مربوط به غنچه­های با اندازه­های مختلف، چهار مرحله نموی متفاوت میکروسپور را مشخص نمود. در شکل 1  ارتباط بین اندازه گل و مرحله نموی میکروسپور در مرزه خوزستانی نشان داده شده است. در گونه مرزه رشینگری نیز الگوی مشابه مشاهده شد. نتایج نشان داد که در هر مرحله مشخص شده، غالب میکروسپورهای داخل بساک در مرحله نموی مشابه بودند. جوانترین گلهای مورد بررسی دارای میانگین طول 2/3 میلی متر و قطر 2/1 میلی متر و حاوی بساکهایی با دیواره نازک و به رنگ سبز متمایل به زرد هستند که بیش از 80 درصد میکروسپورهای موجود در آنها در مرحله نموی تتراد قرار داشتند (شکل 1- الف). گلهای با میانگین طول 4/3 تا 8/3 میلی متر و میانگین قطر 3/1 تا 4/1 میلی متر بساکهای بزرگتر با رنگ روشن­تر داشتند و حاوی میکروسپورهای با مرحله نموی تتراد تا تک­هسته­ای بودند که غالب آنها (بیش از 60 درصد) در مرحله نموی تک­هسته­ای قرار داشتند (شکل 1- ب و ج). در این مرحله نموی، هسته ابتدا در مرکز قرار دارد و با نزدیک شدن به انتهای این مرحله هسته به سمت دیواره میکروسپور نقل مکان می­کند. بررسی بساکهای مربوط به گلهای با میانگین طول 5/5 میلی متر نشان داد که اکثر میکروسپورهای موجود در آنها در مرحله نموی پیشرفته­تر (دو هسته­ای) می­باشند (شکل 1- د). طبق این نتایج، جهت نرزایی در هر دو گونه از گلهای با میانگین طول 4/3 تا 8/3 میلی متر که دارای میکروسپور با مرحله نموی تک هسته­ای می­باشند، استفاده شد.

شکل 1-  ارتباط بین اندازه گل و مرحله نموی میکروسپور

کشت بساک: تأثیر فاکتورهای مختلف گونه، پیش­تیمارهای مختلف دمایی و هورمونی و نوع کربوهیدرات جهت القای کالوس هاپلویید از کشت بساک مورد مطالعه قرار گرفت. 15 روز پس از اعمال تیمارها، تشکیل کالوسهای سفید رنگ و فشرده (شکل 2- الف) در برخی از آنها مشهود بود. 25 روز پس از اعمال تیمارها درصد کالوس­زایی در تیمارهای مختلف ثبت و کالوسها به محیط باززایی منتقل شدند. پس از انتقال به محیط باززایی، کالوسها طی ده روز به رنگ سبز  تغییر رنگ دادند (شکل 2 - ب) و 4 هفته بعد در برخی کالوسها ریشه تشکیل شد (شکل 2- ج). نهایتاً، دوهفته پس از تشکیل ریشه، کالوسها شروع به قهوه­ای شدن کردند و از بین رفتند (شکل 2- د).

نتایج تجزیه واریانس داده­ها نشان داد که از نظر درصد کالوس زایی اختلاف معنی­داری بین گونه­ها، نوع کربوهیدارت، پیش تیمار دمایی و ترکیبهای هورمونی وجود داشت (جدول 1). همچنین بین اثرات متقابل گونه و ترکیبات هورمونی، کربوهیدرات و ترکیبات هورمونی، پیش تیمار دمایی و ترکیبات هورمونی (شکل 3) اختلاف معنی­داری وجود داشت.

شکل-2 مراحل مختلف القاء و نمو  کالوس از بساک (الف: تشکیل کالوس 15 روز بعد از کشت، ب : تغییر رنگ کالوسها 10 روز بعد از انتقال به محیط باززایی، ث: تشکیل ریشه در محیط باززایی 4 هفته بعد از انتقال به محیط باززایی، د: قهوه­ای شدن کالوسها 6 هفته بعد از انتقال به محیط باززایی)

بررسی اثرات ساده فاکتورهای مورد بررسی نشان داد که بین گونه­ها، مرزه رشینگری؛ بین نوع کربوهیدرات، مالتوز؛ بین پیش تیمارهای دمایی، دمای 30 درجه سانتی گراد و بین ترکیبات هورمونی، ترکیب A (5/0 میلی گرم در لیتر BA، 5/0 میلی گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی گرم در لیتر کینتین) بیشترین درصد کالوس زایی را داشتند (جدول 1).

اثر متقابل گونه و ترکیبات هورمونی نشان داد که در ترکیب هورمونی A مرزه خوزستانی بیشترین درصد کالوس­زایی را دارد در حالی که در سایر ترکیبهای هورمونی، مرزه رشینگری درصد کالوس زایی بالاتری از مرزه خوزستانی دارد (شکل 3- الف). در بررسی اثر متقابل کربوهیدرات و ترکیبات هورمونی، بیشترین درصد کالوس­زایی در محیط حاوی قند ساکارز و ترکیب هورمونی A به دست آمد (شکل 3- ب). اثر متقابل پیش­تیمار دمایی و ترکیبات هورمونی نیز نشان داد که بیشترین درصد کالوس­زایی در ترکیب هورمونی A و پیش تیمار دمایی 30 درجه­سانتی­گراد به مدت 3 روز حاصل شد (شکل 3- ث).

جدول 1- اثر ساده گونه، نوع کربوهیدرات، تیمارهای هورمونی و پیش­تیمارهای مختلف بر درصد کالوس­زایی 25 روز بعد از کشت

بررسی تراز پلوییدی کالوسها: نتایج به دست آمده از آنالیز فلوسایتومتری کالوسها نشان داد که اکثر کالوسها در تیمارهای مختلف از نظر سطح پلوییدی مشابه گیاهان مادری (شکل 4-الف) بودند.  فقط در دو نمونه از گونه مرزه رشینگری (در ترکیب هورمونی A و پیش تیمار دمایی 30 درجه­سانتی­گراد به مدت 3 روز) کالوسهای هاپلویید (شکل 4-ب) مشاهده شد و در چند نمونه پیکهای متفاوتی از کالوس به دست آمد (شکل 4-ج).

کشت میکروسپور: اثر سه نوع محیط کشت و پیش تیمارهای مختلف بر میکروسپور در دو گونه بررسی شد.

شکل 3- اثر متقابل ترکیبات هورمونی با الف) گونه، ب) کربوهیدرات، ج) پیش تیمار دمایی بر درصد کالوس زایی 25 روز بعد از کاشت (ترکیبات هورمونی  A (0.5 BA + 0.5 2,4-D + 0.5 Kin)، B (1 BA + 0.5 2,4-D + 0.36 Kin)، C (1 BA + 1 2,4-D + 0 Kin) و D (شاهد))

شکل4- نمونه ای از هیستوگرامهای حاصل از آنالیز فلوسایتومتری الف- گیاه مادری مرزه رشینگری ب) کالوس دیپلویید مرزه رشینگری ج) کالوس هاپلویید و دیپلویید مرزه رشینگری در مقایسه با گیاه استاندارد جعفری