نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه بیوفیزیک، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

2 استاد دانشگاه

3 گروه خون‌شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

چکیده

- نیاز روز افزون به مواد مناسب برای کشت سلول و کاربردهای بالینی پژوهشگران علوم مواد و به عبارت درست تر زیست مواد را بر‌آن داشته است که در جستجوی مواد زیست سازگار و بهینه نوینی برای کشت سلول باشند، بستر های مورد استفاده در سامانه های کشت سلول باید علاوه بر زیست سازگاری، ویژگی های فیزیکی- شیمیایی مناسبی برای اتصال و رشد سلول، عدم القای تمایز خودبخودی سلول های بنیادی و نیز قابلیت سازگاری با انواع مختلفی از سلول ها را داشته باشد. در میان انبوهی از زیست مواد موجود، پلیمرهای ترکیبی آکریلاتی و متآکریلاتی از نظر کنترل فرایند ساخت و نیز ویژگی های مکانیکی، فیزیکی و شیمیایی از جمله موادی هستند که قابلیت استفاده در بسیاری از سیستم های کشت سلول را دارند. در پژوهش حاضر ترکیبی از چندین مونومر آکریلاتی به منظور بررسی میزان اتصال و رشد سلولهای فیبروبلاست انسانی مورد ارزیابی قرار گرفتند.
نتایج به دست آمده مؤید این موضوع بود که برخی از این ترکیبات پلیمری از نظر اتصال و رشد، بستر بسیار مناسبی برای کشت و تکثیر سلول بوده و از نظر درجه آبدوستی در حد مطلوبی قرار دارند. همچنین بسترهای مورد مطالعه از نظر ذاتی به سبب دارا بودن گروه های عاملی متعدد برخلاف بسترهای سنتی همچون پلی استایرن، برای اتصال کوالان دیگر ملکول ها به ویژه بیوملکول ها مناسب بوده و برای مطالعه و بررسی اثر حضور آنها در تماس با سلول ها بستری بسیار مناسب خواهد بود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The evaluation of the attachment and proliferation of human fibroblast cells on poly(meth) acrylate surfaces.

نویسندگان [English]

  • Mosslim Sedghi 1
  • Masoud Soleimani 3

1 Department of Biophysics, Faculty of biological sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran.

2 professor

3 Departments of Hematology, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran

چکیده [English]

Growing demand for suitable material for cell culture and biomedical applications has been challenged biomaterial community to looking for compatible materials for cell culture uses. in addition of
biocompatibility and having appropriate physical-chemical characteristics, cell culture surfaces should not induce spontaneous differentiation of stem cells and should be suitable with different kind of cells.
Among the bulk of existing biomaterials, acrylate and methacrylate combinations of polymers in terms of manufacturing process control, as well as mechanical, physical and chemical properties, are substances that can be used in many cell culture systems.In the present study, a combination of several acrylate monomers was evaluated to determine the attachment and growth of human fibroblast cells.
The results confirm the fact that some of these polymer compounds, in terms of cell attachment and growth, are a very suitable substrate for cell culture and expansion, and are in a good agreement with respect to degree of hydrophilicity. Also, the substrates due to having multiple functional groups, in contrast to traditional substrates such as polystyrene, are suitable for covalent binding to other molecules, especially biomolecules, and will be suitable for studying their effects in contact with cells.

کلیدواژه‌ها [English]

  • poly(meth)acrylate
  • cell attachment
  • cell growth
  • cell culture substrate

بررسی میزان اتصال و رشد سلولهای فیبروبـلاست انسانی بر روی بستـر تهیه شده از ترکیبات پلیمری (مت)آکریلاتی.

مسلم صدقی1، حسین نادری منش1* و مسعود سلیمانی2

1 ایران،تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه بیوفیزیک/نانوبیوتکنولوژی

2 ایران، تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم پزشکی، گروه هماتولوژی

تاریخ دریافت: 11/9/96                تاریخ پذیرش: 16/11/96

چکیده

نیاز روز افزون به مواد مناسب برای کشت سلول و کاربردهای بالینی پژوهشگران علوم مواد و به عبارت درست تر زیست مواد را بر­آن داشته است که در جستجوی مواد زیست سازگار و بهینه نوینی برای کشت سلول باشند، بستر های مورد استفاده در سامانه های کشت سلول باید علاوه بر زیست سازگاری، ویژگیهای فیزیکی- شیمیایی مناسبی برای اتصال و رشد سلول، عدم القای تمایز خود به خودی سلولهای بنیادی و نیز قابلیت سازگاری با انواع مختلفی از سلولها را داشته باشد. در میان انبوهی از زیست مواد موجود، پلیمرهای ترکیبی آکریلاتی و متآکریلاتی از نظر کنترل فرآیند ساخت و نیز ویژگیهای مکانیکی، فیزیکی و شیمیایی از جمله موادی هستند که قابلیت استفاده در بسیاری از سیستمهای کشت سلول را دارند. در پژوهش حاضر ترکیبی از چندین مونومر آکریلاتی به منظور بررسی میزان اتصال و رشد سلولهای فیبروبلاست انسانی مورد ارزیابی قرار گرفتند.

نتایج به دست آمده مؤید این موضوع بود که برخی از این ترکیبات پلیمری از نظر اتصال و رشد، بستر بسیار مناسبی برای کشت و تکثیر سلول بوده و از نظر درجه آب دوستی در حد مطلوبی قرار دارند. همچنین بسترهای مورد مطالعه از نظر ذاتی به سبب دارا بودن گروههای عاملی متعدد برخلاف بسترهای سنتی همچون پلی استایرن، برای اتصال کوالان دیگر مولکولها به ویژه بیومولکولها مناسب بوده و برای مطالعه و بررسی اثر حضور آنها در تماس با سلولها بستری بسیار مناسب خواهد بود.

واژه های کلیدی: پلی(مت) آکریلات، اتصال سلول، بستر کشت سلول.

* نویسنده مسئول، تلفن: 82884410 ، پست الکترونیکی: naderman@modares.ac.ir

مقدمه

 

در سالهای اخیر نیاز زیست شناسان و متخصصین بالینی به مواد مناسب برای کاربردهای آزمایشگاهی و درون بدن همچون پروتزها و استنتهای قلبی و ­یا بستر­های مورد استفاده در کشت سلولهای بنیادی به منظور تکثیر مؤثر آنها، جامعه علوم مواد و پلیمر را به چالش کشانده است (11).{,  #79@@hidden}{Mei, 2010 #79} مطالعه شیمی سطح موادی که برای رشد سلولها مورد استفاده قرار گرفته اند از اهمیت بالایی برخوردار است (9).

بسترهای مناسب کشت سلول علاوه  بر  زیست  سازگاری

باید مکان مناسبی را برای اتصال و رشد سلول فراهم سازند، این مهم در مطالعات بسیاری مورد بررسی قرار گرفته و تأیید شده است که ویژگیهای توپوگرافیک سطح، اتصال و رشد سلول را متأثر از خود می سازد. (4، 5، 7، 8 و10) همچنین مواد مورد استفاده در کشت سلول و آزمایشات بالینی باید سمّی نبوده و غیر­محلول در آب و پایدار باشند (9).

در این مطالعه نقش ترکیبات مونومری مختلف آکریلاتی و متاکریلاتی در تهیه پلیمری مرکب به عنوان بستری برای رشد سلول مورد بررسی قرار گرفت. هر چند پیش از این انواع مختلفی از مواد به عنوان بستر کشت سلول مورد ارزیابی قرار گرفته شده اند در مقایسه با آنها پلیمر­های مرکب (مت)آکریلاتی قابلیتهای منحصر به فردی از خود نشان می دهند. پلیمرهای مرکب آکریلاتی علاوه بر ویژگیهای ذکر شده شفاف بوده، به حرارت مقاوند و در تماس با محیط آبی قابلیت تشکیل هیدروژل دارند. آکریلاتها همچنین زیست مواد­هایی با قابلیت تنظیم ویژگیهای فیزیکی هستند که به طور متداول مورد استفاده قرار می گیرند (12).

در این مطالعه 4 نوع مونومر آکریلاتی به دو گروه HEMA و NVP تقسیم شدند. هر گروه شامل 3 مونومر بودند که تنها مونومر اول آنها با یکدیگر تفاوت دارد. این دو گروه خود شامل 9 ترکیب با نسبت مختلف از سه مونومر تشکیل دهنده خود هستند.

گروه HEMA شامل سه مونومر هیدروکسی اتیل متاکریلات (HEMA)، 2-کربوکسی اتیل آکریلات (2-CEA) و تترااتیلن گلیکول دی متاکریلات (TEGDMA) است و گروه NVP شامل 1-وینیل2-پیرولیدون (NVP) بوده، دو پلیمر دیگر آن مشابه با گروه اول است.  نسبتهای این سه مونومر در 9 حالت مختلف تهیه گردید و از آنجا که مونومر سوم نقش ارتباط دهنده (crosslinker) و مونومر دوم نقش حامل گروه کربوکسیل و نیز مونومر اول به عنوان مونومر آب دوست (hydrophil) در این گروه حضور دارد تغییرات در مقادیر و نسبتهای این سه مونومر تأثیر مهمی در خواص فیزیکی- شیمیایی بستر پلیمری نهایی به جای می گذارد. همچنین وجود گروه عاملی کربوکسیلیک در یکی از مونومر ها امکان استفاده از بستر نهایی به عنوان پایه ای مناسب به منظور اتصال مولکولهای زیستی همچون پپتید های مشتق شده از ECM را ممکن می سازد(12). این گروه عاملی همچنین به دلیل ایجاد شرایط آب دوستی در ایجاد شرایط فیزیکی- شیمیایی مناسب اتصال سلول نقش دارد.

پیش­تر مِی و همکارانش ترکیبی از چندین مونومر آکریلاتی برای تهیه بستری مناسب برای کشت سلولهای بنیادی پرتوان انسانی را مورد استفاده قرار دادند و ارتباط بین میزان سختی (Stiffness) و توانایی تشکیل کلنی سلولهای بنیادی پرتوان مورد بررسی قرار دادند. نتایج این مطالعات نشان می دهد که پلیمرهایی که زاویه تماس آب آنها متعادل بود (بین 65 تا 80 درجه) و جزء دسته مونومرهایی با چندین گروه آکریلاتی ساخته شده بودند بیشترین میزان تشکیل کلنی را از خود نشان دادند (6 و 11).

مواد و روشها

مواد و ابزار آزمایشگاهی: مونومر های هیدروکسی اتیل متاکریلات (HEMA)، 2-کربوکسی اتیل آکریلات (2-CEA)، تترا اتیلن گلیکول دی متاکریلات (TEGDMA) همگی از شرکت سیگا-آلدریچä (Sigma-Aldrich™) خریداری گردید. همچنین آغازگرهای نوری ایرگاکیور 819 (Bis (2,4,6-trimethylbenzoyl)-phenylphosphineoxide) و داروکور 1173 (2-Hydroxy-2-methyl-1-phenyl-propan-1-one) نیز از شرکت سیگما- آلدریچ تهیه گردید. پلیتهای کشت سلول مورد استفاده در این پژوهش از شرکت SPL کره جنوبی تهیه گردید. اتانول 200-پروف مورد استفاده از شرکت سیگما-آلدریچä تهیه گردید.

هوخست 33342 و رسازورین سدیم (معرف تست آلامار آبی (Alamarblue®)) به منظور انجام تستهای سلولی از شرکت سیگما تهیه گردید. دستگاه پخت فرابنفش تزریق نیتروژن (Nitrogen Purged UV Chamber) مورد استفاده در این پژوهش توسط محقق ساخته شد و در پروسه ثبت اختراع قرار دارد، همچنین دستگاه ATR-FTIR مورد استفاده ساخت شرکت ترمو-فیشرNicolet™ iS™ 50 و نیز دستگاه زاویه تماس ساخت شرکت  دیتا فیزیکس (Dataphysics™) بوده است. همچنین از دستگاه Cytation3  ساخت کمپانی بیوتک (BioTek™) به منظور انجام تست اتصال و سمیت سلول استفاده گردید. همچنین به منظور انجام تستهای آماری آنالیز واریانس دو طرفه (Two-way ANOVA) و تست مقایسه چندگانه توکی (Tukey) از نرم افزار GraphPad Prism™ 7.0 استفاده شد.

تهیه بسترهای پلیمری: بسترهای پلیمری مورد استفاده همگی از ترکیب 4 مونومر آکریلاتی در دو گروه سه تایی تهیه شدند(جدولهای 1و2 )، هر گروه از یک مونومر آب دوست، یک مونومر حامل گروه کربوکسیلیک و یک مونومر به عنوان ارتباط دهنده تشکیل شده بودند. در گروه اول از مونومر هیدروکسی اتیل متآکریلات(HEMA) و در گروه دوم از مونومر n-وینیل پیرولیدون(NVP) به عنوان مونومر آب دوست استفاده شد، دیگرمونومرهای دو گروه با هم یکسان بودند، در گروه اول مونومر هیدروکسی اتیل متآکریلات با دو مونومر دیگر که شامل 2-کربوکسی اتیل آکریلات و تترا اتیلن گلیکول دی متاکریلات بودند در نسبتهای مختلف (9 حالت) ترکیب شده سپس با دو آغازگر نوری با نسبت 3 درصد حجمی- حجمی مخلوط گردیده و نهایتاً به منظور رقیق سازی در دو حالت 2 درصد حجمی- حجمی و 10 درصد حجمی- حجمی با اتانول 200-پروف ترکیب شده و برای پوشش سازی کف پلیت و فلاسک کشت سلول به کار برده شد. به همین صورت نیز ترکیبات گروه NVP تهیه شدند، نسبتهای تهیه شده شامل 9 حالت مختلف برای گروه HEMA و 9 حالت مختلف برای گروه NVP بود و درصد های نهایی این مخلوطها در اتانول نیز شامل دو حالت 2 درصد در اتانول و 10 درصد در اتانول بوده که در مجموع 36 حالت مختلف پلیمری را شامل گردید. ترکیبات گروه HEMA به ترتیب (Poly(meth)acrylate) PMA01-PMA09 و ترکیبات گروه NVP به ترتیب PMA11-PMA19 نام گرفتند. از این پس در تمامی نمودارها نام گذاری به همین صورت خواهد بود.

 

جدول 1

ترکیبات PMA

مونومر اتصال دهنده (%حجم)

مونومر کربوکسیل دار (%حجم)

مونومر آب دوست (%حجم)

 شماره PMA

 

Tetra[ethylene glycol] dimethacrylate (3)

 

2-Carboxyethyl acrylate (20)

 

Hydroxyethyl methacrylate (80)

PMA 01

 Tetra[ethylene glycol]

dimethacrylate (10)

2-Carboxyethyl acrylate (20)

Hydroxyethyl

methacrylate (80)

PMA 02

 Tetra[ethylene glycol]

dimethacrylate (6)

2-Carboxyethyl acrylate (30)

Hydroxyethyl

methacrylate (80)

PMA 03

 Tetra[ethylene glycol]

dimethacrylate (10)

2-Carboxyethyl acrylate (20)

Hydroxyethyl

methacrylate (70)

PMA 04

 Tetra[ethylene glycol]

dimethacrylate (3)

2-Carboxyethyl acrylate (20)

Hydroxyethyl

methacrylate (70)

PMA 05

 Tetra[ethylene glycol]

dimethacrylate (10)

2-Carboxyethyl acrylate (30)

Hydroxyethyl

methacrylate (70)

PMA 06

 Tetra[ethylene glycol]

dimethacrylate (30)

2-Carboxyethyl acrylate (20)

Hydroxyethyl

methacrylate (50)

PMA 07

 Tetra[ethylene glycol]

dimethacrylate (20)

2-Carboxyethyl acrylate (30)

Hydroxyethyl

methacrylate (50)

PMA 08

 Tetra[ethylene glycol]

dimethacrylate (30)

2-Carboxyethyl acrylate (50)

Hydroxyethyl

methacrylate (50)

PMA 09

         

 

جدول2

ترکیبات PMA

مونومر اتصال دهنده (%حجم)

مونومر کربوکسیل دار (%حجم)

مونومر آب دوست (%حجم)

 شماره PMA

 

 Tetra[ethylene glycol] dimethacrylate (3)

 

2-Carboxyethyl acrylate (20)

 

1-Vinyl-2-pyrrolidinone (80)

PMA 11

 Tetra[ethylene glycol]

dimethacrylate (10)

2-Carboxyethyl acrylate (20)

1-Vinyl-2-pyrrolidinone (80)

PMA 12

 Tetra[ethylene glycol]

dimethacrylate (6)

2-Carboxyethyl acrylate (30)

1-Vinyl-2-pyrrolidinone (80)

PMA 13

 Tetra[ethylene glycol]

dimethacrylate (10)

2-Carboxyethyl acrylate (20)

1-Vinyl-2-pyrrolidinone (70)

PMA 14

 Tetra[ethylene glycol]

dimethacrylate (3)

2-Carboxyethyl acrylate (20)

1-Vinyl-2-pyrrolidinone (70)

PMA 15

 Tetra[ethylene glycol]

dimethacrylate (10)

2-Carboxyethyl acrylate (30)

1-Vinyl-2-pyrrolidinone (70)

PMA 16

 Tetra[ethylene glycol]

dimethacrylate (30)

2-Carboxyethyl acrylate (20)

1-Vinyl-2-pyrrolidinone (50)

PMA 17

 Tetra[ethylene glycol]

dimethacrylate (20)

2-Carboxyethyl acrylate (30)

1-Vinyl-2-pyrrolidinone (50)

PMA 18

 Tetra[ethylene glycol]

dimethacrylate (30)

2-Carboxyethyl acrylate (50)

1-Vinyl-2-pyrrolidinone (50)

PMA 19

 

 

گروه HEMA شامل سه مونومر هیدروکسی اتیل متاکریلات (مونومر شماره 1)، 2-کربوکسی اتیل آکریلات (مونومر شماره 2) و تترا اتیلن گلیکول دی متاکریلات (TEGDMA) به همراه 2 آغازگر نوری بیس(2،4،6-تری متیل بنزویل)-فنیل فسفاین اکساید (Irgacure 819) و 2-هیدروکسی-2-متیل پروپیوفنون (Darocur 1173) (تصویر 1.2 ) هر کدام از این دو آغازگر با غلظت نیم درصد وزنی-وزنی نسبت به مخلوط نهایی  آکریلاتی تهیه شدند. میزان آغازگر های نوری در ترکیبات تهیه شده برای همه ترکیبات یکسان در نظر گرفته شد تا تنها متغیر آزمایش خود ترکیبات مونومری و نسبت آنها با همدیگر و نیز رقت آنها در اتانول باشد.

 

 

2-Hydroxy-2-methylpropiophenone (Darocur 1173)

تصویر1

 

Bis(2,4,6-trimethylbenzoyl)-phenylphosphineoxide (Irgacure 819)

تصویر2

گروه NVP کاملاً شبیه گروه HEMA بوده با این تفاوت که مونومر n- وینیل پیرولیدون جایگزین مونومر هیدروکسی متیل متآکریلات گردید. به این ترتیب دو گروه مونومری بوجود آمد که با توجه به اینکه 9 حالت مختلف مونومری و نهایتاً 2 درصد متفاوت مخلوط نهایی برای این دو گروه در نظر گرفته شد، در مجموع 4 پلیت 96 خانه هر کدام 72 خانه (8 تکرار برای هر حالت) به علاوه 8 تکرار برای حالت TCP در کل 296 خانه با روش رسوبدهی (casting) پوشش داده شد. ساختار مونومرها و نیز آغازگرهای نوری به کار رفته در این آزمایش در جدولهای 1 و 2 قابل مشاهده است.

پوشش سازی ترکیبات آکریلاتی با قرار دادن 5/0 - 20 میکرولیتر از محلول نهایی مونومری در کف پلیت 96 خانه قرار گرفت. محلول آکریلاتی حاصل سپس به مدت 5-90 دقیقه درون دسیکاتور ( یا زیر هود فیوم (fume hood)) قرار گرفت تا حلال آن به طور کامل تبخیر گردد. حضور حلال به علت اختلال در پلیمریزاسیون مانع روند پلیمریزه شدن می گردد.

پس از تبخیر حلال، نمونه تحت تابش پرتو فرابنفش با توان تابشی حدوداً 2 mW/cm2 قرار گرفت، این فرآیند با حفظ دمای واکنش در دمای اتاق کنترل گردید. پلیتهای حاصل سپس به مدت 48 ساعت درون آب دوبار یونیزه بر روی همزن مغناطیسی شستشو شدند تا مونومرهای احتمالی شرکت نکرده در واکنش از آن خارج گردند.

پس از شست و شوی پلیتها، آنها در دمای اتاق خشک شدند و برای انجام تستهای سلولی به مدت 60 دقیقه تحت تابش پرتو فرابنفش یونیزان درون هود لامینار قرار گرفته و پس از آن تا زمان کشت سلول تحت شرایط استریل نگهداری شدند.

کشت سلول: به منظور بررسی اتصال و زیست پذیری سلولی بر روی بستر های آکریلاتی، ابتدا پلیتهای 96 خانه که تحت پوشش پلیمر به شرح فوق قرار گرفته بودند انتخاب گردیدند. پلیتها تحت پرتو فرابنفش استریلیزه شده و قبل از کشت سلول با PBS یکبار شسته شدند. سلولهای فیبروبلاست انسانی (HFF) پرایمری پاساژ 5 تهیه گردید. و با محیط DMEM high Glc. و سرم گاوی 10 درصد کشت داده شد. سپس درون پلیتهایی که با پلیمر پوشش دهی و استریل شده بودند کاشته شدند. برای پلیتهای 96 خانه روزهای اول تا پنجم بین 5000 تا 3000 سلول در هر خانه کاشته شد. برای بررسی تست اتصال سلولی، 2 دسته پلیمری HEMA و NVP طبق توضیح قبلی به همراه کنترل TCP در 4 پلیت 96 خانه در دو غلظت 2 و 10 درصد استفاده شد. آزمایش اتصال سلول و رشد کوتاه مدت در مدت زمان 24 ساعت در انکوباتور کشت سلول در دمای 37 درجه سانتی گراد و CO2 5 درصد کشت داده شده و سپس با استفاده از رنگ فلورسنت هوخست 33342 هسته سلولهای زنده رنگ آمیزی شد و نهایتاً با دستگاه Cytation3 در طول موج تحریک 350 نانومتر و طول موج تابش 461 نانومتر با gain=100 خوانده شد. نتایج در نمودارهای 3-الف و ب قابل ملاحظه است.

همچنین به منظور بررسی رشد و تکثیر بلند مدت و عدم سمیت سلولی، تست آلامار بلو (Alamarblue) انجام شد. به این منظور محلول 02/0 درصد (غلظت نهایی) از نمک رسازورین سدیم شرکت سیگما آلدریچ در بافر فسفات سالین تهیه گردید، این غلظت از نمک مذکور به منظور انجام تست سمیت سلولی و زنده مانی سلولهای جانوری مناسب است(12). سپس سلولهای کشت داده شده بر روی پلیمر را پس از گذشت زمانهای 3 و 5 روز از انکوباتور خارج کرده و پس از حذف محیط رویی محلول رسازورین سدیم را به آن افزوده و به مدت 4 ساعت در انکوباتور قرار داده تا ترکیب مذکور توسط سلولهای زنده و محیط احیاءکننده آنها احیاء گردد و ترکیب رسوفورین سدیم که شدیداً فلورسنت است تولید کند. پس از گذشت زمان مذکور با استفاده از دستگاه Cytation3 و با طول موج تحریک 545 نانومتر و طول موج تابش 595 نانومتر و gain=100 پلیتها خوانده شدند. داده های حاصل از تستهای زنده مانی و تکثیر سلولی توسط نرم افزار گراف- پد به روش آنالیز واریانس دو­طرفه و تست مقایسه چندگانه توکی مورد تحلیل قرار گرفت، مقادیر در قالب نمودارهای روزهای اول، سوم و پنجم ارائه گردیده است.

نتایج

نتایج تست زاویه تماس: از بین ترکیباتی پلی آکریلاتی مورد آزمایش در تست تکثیر سلولی 8 ترکیب از نتایج روز سوم انتخاب شدند. این ترکیبات میزان رشد سلول را در حد قابل توجهی نسبت به کنترل (TCP) حفظ کردند. همان طور که در نمودار  1 مشهود است PMA01 2درصد، به میزان معناداری نسبت به PMA12-14& PMA18 زاویه تماس کمتری داشته و طبیعتاً آب دوست تر است. همچنین PMA03، 10درصد و PMA08، 2درصد هر دو به طور معنی داری از PMA12-14& PMA18 زاویه تماس کمتری داشته و آب دوست تر هستند. میزان آب دوستی هر ترکیب به طور مشخصی متأثر از گروههای عاملی در معرض آن است و PMA03& 08 به دلیل دارا بودن مونومر HEMA به جای NVP بیشتر آب دوست هستند، همان طور که پیش تر گفته شد تنها تفاوت PMA08 با PMA18 و نیز PMA03 با PMA13 در جایگزین شدن هیدروکسی اتیل متاکریلات توسط N-وینیل پیرولیدون است و حتی نسبت پلیمری یکسانی دارند. از این رو تفاوتهای موجود در زاویه تماس قطره آب در این ترکیبات پلیمری حاصل از همین جایگزینی است. نکته دیگر اختلاف معنی دار زاویه تماس برای ترکیب PMA01 در دو حالت 2درصد و 10درصد آن است، که در این مورد نشان­دهنده رابطه معکوس ضخامت پلیمر بر خیس شوندگی (Wettability) بستر است (جدول 3). زوایای تماس ترکیبات آکریلاتی مختلف که جزییات آن در جدول 1 آمده است.

 

 

جدول 3- مقادیر زوایای تماس هشت ترکیب آکریلاتی.

 

شماره ترکیب

غلظت نهایی ترکیب

میانگین زاویه تماس

 

شماره ترکیب

غلظت نهایی ترکیب

میانگین زاویه تماس

الف

PMA08

2%

۴۹.۰˚ ±۲.۰˚

ج

PMA12

2%

۶۴.۸˚ ±۲.۰˚

ب

PMA01

2%

۴۷.۵˚ ±۱.۵˚

چ

PMA13

2%

۷۳.۱˚ ±۲.۵˚

پ

PMA01

10%

۵۶.۹˚ ±۳.۱˚

ح

PMA14

2%

۷۲.۴˚ ±۱.۱˚

ت

PMA03

10%

۵۳.۸˚ ±۳.۱˚

خ

PMA18

2%

۶۸.۱˚ ±۲.۵˚

 

 

 

نمودار 1

به منظور ارزیابی شکل گیری لایه پلیمری ترکیبات (پلی)آکریلاتی و نیز مقایسه تغییرات شیمیایی سطح در اثر تغییر دادن نسبت و نوع ترکیبات مونومری، اسپکتروسکوپی ATR-FTIR انجام گرفت (نمودار 2).

نوار های انتقالی (Transmittance) در cm-1 3400 حضور گروه هیدورکسیل (OH) را نشان می دهد که می تواند از گروه کربوکسیل مونومر 2-کربوکسی اتیل آکریلات و یا گروه هیدورکسیل مونومر هیدروکسی اتیل متآکریلات (درمورد گروه دارای مونومر HEMA ) مشتق شده باشد (15).

در حدود عدد موجی 1717 پیک مربوط به گروه کربونیل (-C=O) مشاهده می گردد که مربوط به گروه استری یا اسیدی (کربوکسیلیک اسیدی) است. البته سهم گروههای استری در این پیک بیشتر است ولی با این وجود این هر دو روی هم منطبق می شوند. همچنین پیک در حدود ناحیه  cm-11425 آمید نوع سه است که به علت حضور مونومر NVP قابل مشاهده است که در اصل حاصل کشش پیوند کربن-نیتروژن بوده و البته به علت رزونانس موجود روی پیوند مذکور در ملکول NVP حد واسط یگانه و دوگانه است (14).

 

 

نمودار 2- ب- طیف های عبوری ATR-FTIR پنج ترکیب از دسته ترکیبات گروه NVP.

 

 

از دیگر نقاط مهم این طیف پیک مرتبط با عدد موجی cm-1950-900 است که مربوط به خمش باند وینیلی است (14). صرف نظر از اینکه مونومر سر گروه HEMA باشد یا NVP، وقتی غلظت TEGDMA افزایش یابد یک باند تقریباً کوچک و خفیف در حدود عدد موج 950 مشاهده می شود، به نظر می­رسد علت ظهور این پیک عدم شرکت یکی از دو انتهای وینیلی مونومر TEGDMA در فرآیند پلیمریزاسیون و آزاد باقی ماندن آن است. در گروه NVP، وقتی غلظت مونومر NVP کم شود پیک گروه کربونیل (-C=O) مربوط به جزء آمیدی موجود در مونومر NVP نسبت به کربونیل استری یا اسیدی سهم کمتری خواهد داشت و از آنجایی که مونومر آب دوست HEMA با دارا بودن جزء استری جایگزین مونومر آب دوست NVP می شود، با کاهش سهم کربونیل آمیدی، سهم کربونیل استری در این پیک بیشتر می شود. این موضوع مؤید انطباق سهم مونومریهای NVP و HEMA شرکت کرده در فرآیند پلیمریزاسیون با مقادیر مورد استفاده در ترکیبات مونومری است. نکته دیگری که در بررسی دقیق­تر نمودار ATR-FTIR قابل مشاهده است این است که در حالتی که HEMA سرگروه ترکیبات مونومری است با تغییر نسبت و غلظت مونومرها، تغییرات زیادی روی الگوی پیکها دیده نمی شود، علت البته مشخص است، از آنجا که در این دسته مونومری گروههای عاملی مشابهی وجود دارد (متیل، کربوکسیل، هیدروکسیل و ..) وقتی نسبتهای این مونومر­ها دچار تغییر می شود تفاوت زیادی در ساختار پلیمر رخ نمی­دهد و تنها سهم اشتراک گروههای عاملی در پیکها تغییرات جزئی می کند و الگوی نمودار نسبتا دست نخورده باقی می­ماند. در مورد گروه NVP به علت تفاوت زیاد خود مونومر NVP با دیگر مونومرها تغییرات اساسی در الگوی نمودار پدید می آید. حضور و همچنین تغییر در نسبت این مونومر به وضوح الگوی نمودار را تحت تأثیر خود قرار می­دهد.

نتایج کشت سلول: همان گونه که در نمودار 3 (الف و ب) آزمون اتصال و زنده­مانی سلول قابل مشاهده است میزان اتصال و در نتیجه رشد سلولها در روز اول به طور میانگین بر روی برخی از سطوح گروه کو-پلیمری NVP بیشتر از سطوح پلیمری HEMA بوده است. و البته در گروه کو-پلیمری NVP نیز با افزایش میزان مونومر ارتباط دهنده (Crosslinker monomer) این میزان افزایش یافته است. در نمودار روز اول گروه NVP مشاهده شد که پلیمر حاصل از ترکیبات PMA17-19 میزان اتصال و رشد بسیار بیشتری-حتی نسبت به نمونه کنترل- داشته اند و البته تقریباً بین دو دسته 2درصد و 10درصد از این ترکیبات هم شباهت زیادی از نظر اتصال و رشد سلولها وجود دارد. با توجه به شباهت نسبتهای مونومری این دو دسته (2درصد و 10درصد) این فرضیه که نسبت بیشتر بالای مونومر ارتباط دهنده نقش در اتصال سلولها به بستر ایفا کرده باشد تقویت می گردد. این شباهت در بین دو دسته 2درصد و 10درصد از ترکیبات کو-پلیمری HEMA نیز به صورت واضحی قابل مشاهده است و در بین آنها نیز افزایش میزان مونومر ارتباط دهنده  به طور معناداری در میزان اتصال و رشد سلولها مؤثر بوده است. هر چند در مورد گروه HEMA نسبت به گروه NVP این افزایش در اتصال و رشد سلولی به مراتب کمتر است.

همان طور که در نمودار 3 مشاهده می شود با افزایش نسبت مونومر ارتباط دهنده (TEGDMA) در PMA14 نسبت به PMA11-13 با افزایش اتصال و رشد سلولها مواجه بوده است. در PMA16-19 نیز هرگاه سهم مونومر ارتباط دهنده نسبت به ترکیبات قبل از خود افزایش یابد به صورت معنی داری افزایش رشد سلول دیده می شود. البته در مورد نمودار 3-الف که HEMA مونومر به عنوان مونومر آب دوست در ترکیب حاضر است اختلافها خیلی معنی دار نیست. با این حال تقریباً تمامی حالات ترکیبات HEMA نسبت به حالت کنترل از رشد قابل قبولی برخوردار بوده و حتی اتصال و رشد غلظت 10درصد از ترکیبات شرکت کرده در پلیمریزاسیون نسبت به حالت کنترل به صورت معنی داری بیشتر است.

با مقایسه نمودار رشد سلول در روز اول و سوم، و بررسی دو نمودار متناظر ترکیبات HEMA و NVP مشاهده گردید که تغییر در نسبت پلیمر ها در ترکیب پلیمری به صورت معنی داری باعث ایجاد تفاوت در رشد سلول خصوصاً با گذشت زمان از روز اول تا سوم می گردد. این به نحوی است که به طور مثال در نمودار روز اول ترکیبات HEMA در ابتدا تقاوت ها کمتر محسوس است و تنها در ترکیبات غلیظ تر ( غلظت 10درصد) می توان تفاوتهای حاصل از تغییر غلظت خصوصاً افزایش میزان مونومر ارتباط دهنده را مشاهده کرد. ولی در مورد ترکیبات NVP همان طور که پیش تر اشاره شد این تفاوتها واضح تر و مشخص و در عین حال با الگویی مشابه در  هر  دو  غلظت  2 درصد  و

10درصد قابل مشاهده است (نمودار 3-الف و ب).

 

 

 

در مورد نمودار های روز سوم (4-الف و ب) نیز مشهود است که رشد سلولها در ترکیبات گروه HEMA در غلظت 10درصد ترکیبات بیشتر است که با توجه به ساختار هیدروژلی این ترکیبات (خصوصاً در غلظتهای بالاتر) و اتصال بیشتر سلول بر روی این غلظت از ترکیبات وجود و رشد سلولهای بیشتر در روز سوم نیز قابل انتظار بود.

ولی در  مورد  ترکیبات گروه NVP وضع کمی متفاوت تر

است، هر چند اتصال اولیه سلولها بر روی این سطوح نسبت به ترکیب رقیب در روز اول تا حد قابل توجهی بیشتر بود، با این حال در روزسوم منحنی رشد سلولها شیب ملایم تری پیدا کرده است که نشان از اتصال اولیه مناسب اما سرعت رشد آرام تر است. با این حال به جز چند استثناء در تست روز سوم ترکیبات گروه NVP تا حدودی ترکیبات رقیق تر (2 درصد)  شانس  بهتری  برای

تکثیر سلولها هستند.

 

 

 

در نمودار های روز پنجم (نمودار 5- الف و ب) نکته مهمی روی می دهد، چنانچه پیش تر ذکر شد ترکیبات پلیمری HEMA ساختاری هیدروژل مانند ایجاد می کنند، حال با توجه به اینکه با افزایش غلظت این ترکیبات ضخامت این لایه پلیمری افزایش می­یابد و نیز با گذشت روزهای مجاورت این بستر با محیطهای آبی (محیط کشت) اتصال بستر به کف پلیت تضعیف شده و پس از روز چهارم و پنجم دچار لایه لایه شدگی (delamination) از بستر می گردد. این موضوع باعث می شود که ترکیبات HEMA با غلظت 10درصد در روز پنجم با کاهش شدید تعداد سلول متصل به خود روبرو شوند، اما در این میان یک استثناء وجود دارد و آن هم 3 ترکیب انتهایی نمودار یعنی PMA07-PMA09 هستند که نسبت مونومر ارتباط دهنده در آنها افزایش دو چندانی می­یابد، این ترکیبات به علت دارا بودن مونومر ارتباط دهنده بیشتر نسبت به شش ترکیب قبل خود در گروه ترکیبات غلیظ تر (10درصد) توانستند کماکان در روز پنجم هم از لایه لایه شدن و جداشدن از کف پلیت رهایی یابند و طبیعتاً تعداد سلولهای آنها همچون ترکیبات متناظرشان در گروه ترکیبات رقیق تر(2درصد) مانده وحتی کمی بیشتر است. در مورد نمودار  5-ب یعنی ترکیبات گروه NVP در روز پنجم تقریباً به طور یکسانی شاهد رشد سلولی کامل در بیشتر ترکیبات بوده و جز استثنائاتی می توان گفت رشد سلولها بین این ترکیبات تفاوت معنی داری ندارد.


 

 

 

جدول4-  مقادیر انحراف از معیار نمودارهای 4،3و 5 برای درصد تکثیر سلولهای کشت داده شده بر روی ترکیبات پلیمری.

 

روز اول

روز سوم

روز پنجم

غلظت 2%

غلظت 10%

غلظت 2%

غلظت 10%

غلظت 2%

غلظت 10%

PMA-01

۲.۸۷

۳.۶۸

۰.۶۷

۱.۲۴

۱.۲۸

۱.۶

PMA-02

۲.۴۶

۳.۱۲

۰.۷۶

۳.۴۵

۰.۷۷

۰.۵۲

PMA-03

۰.۸۲

۲.۰۶

۰.۵۲

۲.۵

۰.۹

۰.۳۹

PMA-04

۱.۷۴

۳.۷

۰.۳۸

۲.۱۶

۰.۶۴

۰.۷

PMA-05

۱.۲۴

۳.۱۵

۱.۱

۲.۲۱

۱.۵

۰.۵۳

PMA-06

۰.۸۱

۳.۹۹

۰.۳۹

۱.۱۱

۲.۱۴

۱.۰۸

PMA-07

۰.۶۲

۴.۱

۱.۱۵

۱.۹۹

۰.۹۷

۲.۸۵

PMA-08

۱.۱۶

۴

۱.۷۴

۱.۵۴

۱.۶۴

۱.۰۴

PMA-09

۲.۵۴

۵.۹

۰.۷۹

۱.۸۳

۱.۰۷

۰.۹

PMA-11

۱.۱۲

۱.۷۲

۰.۷۳

۲.۴۳

۱.۸

۱.۵۵

PMA-12

۰.۵

۰.۹۳

۱.۷۷

۱.۱۳

۱.۶۶

۰.۸۱

PMA-13

۱.۱۴

۱.۸۵

۱.۶۸

۱.۲۸

۰.۷۲

۰.۷۵

PMA-14

۰.۸۶

۲.۳۴

۱.۹

۱.۴۷

۲.۱۲

۱.۰۵

PMA-15

۱.۴۷

۴.۱۶

۱.۱۴

۰.۵۶

۰.۶۷

۱.۰۳

PMA-16

۱.۳۸

۴.۱

۱.۲۱

۰.۹۴

۱.۶۲

۰.۴

PMA-17

۳.۲۹

۲.۷۸

۰.۶۶

۰.۴۲

۱.۰۲

۰.۶۵

PMA-18

۱.۶۴

۷.۵۵

۱.۹۶

۱.۹۸

۰.۸۸

۰.۴۷

PMA-19

۲.۴۴

۳.۳۹

۱.۸۸

۰.۶۸

۱.۱۴

۰.۸۱

 


بحث و نتیجه­گیری

غالب ترکیبهای پلیمری دارای مقاومت مکانیکی مناسبی از نظر حفظ بستر مناسب برای اتصال و رشد سلول هستند، همچنین این پلیمرهای ترکیبی دارای گروههای عاملی مناسب برای برهمکنش با سطح سلول و ایجاد ویژگیهای فیزیکی- شیمیایی مناسب برای اتصال سلول هستند. ترکیبات (مت)آکریلاتی برای تکثیر سلول به خوبی ترکیبات تجاری کشت سلول هستند و حتی در برخی موارد از نظر زنده مانی و تکثیر سلولی بهتر از مواد مرسوم در ظروف کشت سلول سنتی عمل می کنند. (3)

در مورد ترکیبات NVP اتصال مناسب ترکیبات با پلیت، یکپارچگی بستر و عدم وجود مشکل لایه لایه شدن از نقاط قوت این ترکیب است، اگرچه شفافیت ترکیبات گروه HEMA تا حدودی برگ برنده آنها در مقابل ترکیبات رقیب است. در پایان به نظر میرسد به کارگیری ترکیبات با درصد بالاتر مونومر ارتباط دهنده به منظور استحکام و پایداری بیشتر بستر مفید باشد و البته از نظر ایجاد امکان اتصال بهتر سلول نیز مؤثر خواهد بود.

هر چند رشد و تکثیر سلولها بر روی بیشتر بسترهای پلی آکریلاتی خصوصاً تا انتهای روز سوم قابل قبول بوده و حتی در موارد بسیاری نسبت به حالت کنترل از تکثیر و رشد بیشتری هم برخوردار بوده است با این حال همان طور که ملکومیان و همکارانش اشاره کرده اند رقتهای کمتر ترکیبات پلیمری خصوصاً در دسته HEMA از لایه لایه شدن بستر در روزهای سوم به بعد جلوگیری کرده و در این مطالعه نیز این مورد به وضوح مشاهده گردید (10 و 15). با این حال در بررسی نمودارهای رشد و تکثیر سلولی در روزهای پنجم و به ویژه در مورد گروه HEMA دیده می شود که افزایش مونومر ارتباط دهنده مانع لایه لایه شدن بستر در طولانی مدت گردیده و این خود نشان از عملکرده صحیح و مطابق انتظار این مونومر در تثبیت و پایدارسازی بستر دارد.

بنابراین با توجه به مشکل لایه لایه شدن ترکیبات HEMA با غلظت بالا، قطعاً توصیه می گردد در صورت به کارگیری این ترکیبات از غلظتهای بالای آن استفاده نشود، یا حداقل از غلظت مونومر ارتباط دهنده برای جلوگیری از کنده شدن بستر استفاده گردد. علاوه بر این با افزایش مونومر ارتباط دهنده، گروههای عاملی کربوکسیل بیشتری برای برهمکنشهای آب دوست به نفع اتصالات سلولی در دسترس است. گروههای عاملی اینچنین همان طور که در تحقیقات پیشین اشاره شده علاوه بر ایجاد محیطی مناسب برای اتصال و لنگراندازی سلولی، قابلیت قرارگیری به عنوان بستر اتصالی برای فاکتور های تغذیه ای و تحریک رشد و تمایز سلول را نیز دارند که این امکان کاستن مکملهای محلول در محیط کشت را نیز فراهم می کند (1 و 2).

1- مهرابی، مریم، حسینخانی، سامان، جلیلی، سیروس، مصطفایی، علی، 1394، تمایز سلولهای بنیادی پوست انسان به سلولهای سازنده انسولین در محیط برون تن با استفاده از گلوکز و عصاره پانکراس ترمیمی، مجله پژوهشهای سلولی و ملکولی(مجله زیست شناسی ایران)، جلد 28، شماره. 1

2- نصیرنیا، حوری، قلمبران، محمدرضا، میمندی پور، امیر، بیات، منصور، 1394، بررسی امکان رشد سلولهای استخوانی (SAOS-2) روی داربستهای پوشش دار شده با نانوذرات کیتوسان-آلژینات، مجله پژوهشهای سلولی و ملکولی (مجله زیست شناسی ایران)، جلد 28، شماره. 3

 

3- Fadeev A. G.,Martin A. W., Melkoumian Z,. Shogbon C. B., Weber D. M., Weber J. L., Yue Z.,  (2013)Swellable (meth) acrylate surfaces for culturing cells in chemically defined media, US8530236 B2.

4- Gray, D. S., J. Tien and C. S. Chen (2003). "Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned Young's modulus." J Biomed Mater Res A 66(3): 605-614.

5- Higuchi, A., Q.-D. Ling, S. S. Kumar, Y. Chang, T.-C. Kao, M. A. Munusamy, A. A. Alarfaj, S.-T. Hsu and A. Umezawa (2014). "External stimulus-responsive biomaterials designed for the culture and differentiation of ES, iPS, and adult stem cells." Progress in Polymer Science 39(9): 1585-1613.

6- Higuchi, A., Q. D. Ling, Y. A. Ko, Y. Chang and A. Umezawa (2011). "Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells." Chem Rev 111(5): 3021-3035.

7- Jiang, X., R. Ferrigno, M. Mrksich and G. M. Whitesides (2003). "Electrochemical Desorption of Self-Assembled Monolayers Noninvasively Releases Patterned Cells from Geometrical Confinements." Journal of the American Chemical Society 125(9): 2366-2367.

8- Jiang, X., S. Takayama, X. Qian, E. Ostuni, H. Wu, N. Bowden, P. LeDuc, D. E. Ingber and G. M. Whitesides (2002). "Controlling Mammalian Cell Spreading and Cytoskeletal Arrangement with Conveniently Fabricated Continuous Wavy Features on Poly(dimethylsiloxane)." Langmuir 18(8): 3273-3280.

9- Lee, J. N., X. Jiang, D. Ryan and G. M. Whitesides (2004). "Compatibility of mammalian cells on surfaces of poly(dimethylsiloxane)." Langmuir 20(26): 11684-11691.

10- Mata, A., C. Boehm, A. J. Fleischman, G. Muschler and S. Roy (2002). "Growth of connective tissue progenitor cells on microtextured polydimethylsiloxane surfaces." Journal of Biomedical Materials Research 62(4): 499-506.

11- Mei, Y., K. Saha, S. R. Bogatyrev, J. Yang, A. L. Hook, Z. I. Kalcioglu, S. W. Cho, M. Mitalipova, N. Pyzocha, F. Rojas, K. J. Van Vliet, M. C. Davies, M. R. Alexander, R. Langer, R. Jaenischand D. G. Anderson (2010). "Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells." Nat Mater 9(9): 768-778.

12- Melkoumian, Z., J. L. Weber, D. M. Weber, A. G. Fadeev, Y. Zhou, P. Dolley-Sonneville, J. Yang, L. Qiu, C. A. Priest, C. Shogbon, A. W. Martin, J. Nelson, P. West, J. P. Beltzer, S. Pal and R. Brandenberger (2010). "Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells." Nat Biotechnol 28(6). 606-610.

13- Page, B., M. Page and C. Noel (1993). "A new fluorometric assay for cytotoxicity measurements in-vitro." Int J Oncol 3(3): 473-476.

14- Stuart, B. (2004). Infrared spectroscopy : fundamentals and applications, Chichester, West Sussex, England ; Hoboken, NJ : J. Wiley, [2004] ©2004.

15- Tajabadi, M., M. E. Khosroshahi and S. Bonakdar (2013). "An efficient method of SPION synthesis coated with third generation PAMAM dendrimer." Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 431(Supplement C): 18-26.