مقایسه لاینهای افزایشی دیزومیک گندم- جو بر اساس خصوصیات سیتوژنتیکی و مولکولی

محسن فرشادفر¹، هوشمند صفری^2*، هومن شیروانی¹ و صالحه آقایی­نیا³

¹ ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، گروه کشاورزی

² ایران، کرمانشاه، سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزیو منابع طبیعی استان کرمانشاه، بخش تحقیقات جنگلها و مراتع

³ایران، کرمانشاه، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد کرمانشاه، گروه اصلاح نباتات

تاریخ دریافت: 27/8/96                تاریخ پذیرش: 28/9/96

چکیده

محصولات ژنتیکی مانند لاینهای افزایشی و جایگزینی، منابع ژنتیکی با ارزشی در جهت برنامه­های اصلاحی و تحقیقات بنیادی می­باشند. هدف از این تحقیق مقایسه لاینهای افزایشی گندم - جو، که در آن کروموزومهای جو زراعی واریته Betzes به زمینه ژنتیکی گندم نان واریته Chinese spring منتقل شده، بر اساس نشانگرهای سیتوژنتیکی و مولکولی بود. بر اساس مطالعات سیتوژنتیکی وجود کروموزومهای اضافی در لاینهای افزایشی تأیید شد و تطابق کاریوتیپ حاصل از این کروموزومها با کاریوتیپ والد دهنده نیز تأیید گردید. مطالعات سیتوژنتیکی مشخص کرد که سه کروموزوم H1، H4 و H5 بیشترین تفاوت مورفولوژیکی با والد گیرنده داشتند و کروموزوم H6 دارای بیشترین شباهت مورفولوژیکی با والد گیرنده بود. تنوع ژنتیکی مطلوبی بر اساس مارکر ISSR در بین لاینها مشاهده شد. آغازگرهای­ IS₁₀ و  IS₁₅ بهترین چندشکلی را در بین لاینها نشان دادند. آغازگرهای مورد بررسی بیشتر مناطقی از کروموزومهای H2، H3 و H7 را در جو تکثیر کردند. مناطق تکثیری توسط آغازگرهای مورد استفاده برای مارکر ISSR کمتر بر روی کروموزومهای H4، H5 و H6 قرار داشتند.

واژه های کلیدی: جو، لاین افزایشی، مارکر ISSR، سیتوژنتیک

* نویسنده مسئول، تلفن: 09183305823 ، پست الکترونیکی: hooshmand.safari@gmail.com

مقدمه

امروزه گندم (Triticum aestivum) غذای اصلی مردم بسیاری از کشورها می‌باشد به‌ طوری که بیش از 20 درصد کالری مورد نیاز جمعیت جهان را تأمین می‌کند (9). گندم به علت داشتن نشاسته، پروتئین و خواص نانوایی خوب بر سایر غلات ترجیح داده می­شود. اگر چه از سایر غلات نیز می­توان نان تهیه نمود، ولی تا امروز هیچ گیاهی در تهیه نان برای تغذیه انسان نتوانسته است با گندم رقابت کند (17). جو (Hordeum vulgare)از نظر اهمیت غذایی و سطح زیر کشت در میان غلات، پس از گندم، ذرت و برنج مقام چهارم را دارد. اما با توجه به اینکه در شرایط متنوع آب و هوایی قابل کشت است، از نظر دامنه گسترش کشت مقام اول را داراست (16). لاینهای افزایشی دیزومیک که حامل یک جفت کروموزوم از گونه­های خویشاوند به زمینه ژنتیکی گونه گیرنده هستند، می­توانند به منظور تعیین کروموزومهایی که حامل ژنهای کنترل کننده مقاومت به شوری، خشکی و غیره باشند، مورد استفاده قرار گیرد (22). لاینهای دارای یک کروموزوم اضافی از طریق اضافه شدن یک کروموزوم به گونه دریافت کننده تولید می­گردد و لاینهای دارای دو کروموزوم اضافی، از افزوده شدن یک جفت کروموزوم همولوگ از یک گونه خویشاوند به زمینه ژنتیکی گونه گیرنده به دست می­آیند (13). لاینهای افزایشی منابع ژنتیکی با ارزشی برای اصلاح گیاهان و تحقیقات پایه­ای  هستند (28). یک لاین کروموزوم افزایشی محصولات پیشرفته­ای در یک نوع گونه گیاهی است که برای اهداف زیادی مورد استفاده قرار می­گیرد، از قبیل معرفی ویژگیهای با ارزش نوع گیرنده، نقشه ژنی و نشان­گذاری یک کروموزوم بیگانه وارد شده، یک ژن بیگانه آزمایشی و فهم رفتار جفت شدگی میتوزی و ساختار کروموزوم و جدا کردن ژنهای منحصر به­فرد (8، 18، 23 و 28). برای شناسایی لاینهای افزایشی که حامل کروموزومهای مختلف انتقال داده شده می­باشند از یکی از تکنیکهای مورفولوژی، کاریوتیپ کروموزوم اضافه شده، جفت شدن کروموزوم میوزی در گیاهان F1 حاصل از تلاقی بین دو لاین افزایشی بیگانه (DAAL) (Disomic aline addition lines) ، تشخیص بیوشیمیایی و تلاقی داخلی (Inter crossing) استفاده می گردد. لاینهای اضافی مونوسومیک و دی­سومیک را می­توان از نظر مورفولوژیکی از همدیگر و از والد دریافت­کننده شناسایی نمود زیرا کروموزومهای اضافه شده ویژگیهای مورفولوژیکی سنبله و ویژگیهای رویشی را تغییر می­دهد. جا به جاییها ممکن است هم کیفی و هم کمی باشد. بیشتر تغییرات به­خاطر کنش متقابل بین ژنهای والدهای دهنده و گیرنده می­باشد و هر کروموزوم یک اثر خاصی روی مورفولوژی و باروری گیاه دارد (14، 24 و 26). لاینهای افزایشی دیزومیک گندم - جو برای مطالعه و بررسی بیان ژنهای خارجی در ژنوم گندم و ترسیم نقشه فیزیکی ژنوم جو توسط Cho و همکاران (2006) مورد استفاده قرار گرفته است و از این طریق نقشه فیزیکی ژنهای موجود در لاین 6H مشخص شده است. نتایج این پژوهش نشان­دهنده بی­نظمی (فعالیت و عدم فعالیت) لوکوسها بود که پدیده­ای مرسوم و عادی در لاینهای افزایشی دیزومیک گندم - جواست. لاینهای افزایشی دیزومیک جو-گندم برای تهیه نقشه فیزیکی ژنی کروموزومهای جو یک منبع عالی ژنی می­باشد. از این طریق بررسی سازمان ژنی در جو امکان­پذیر شده است (10). لذا در تحقیق حاضر از طریق روشهای سیتوژنتیکی و مولکولی بر اساس مارکر ISSR لاینهای افزایشی کروموزومی جو-گندم که در آن جو به عنوان والد دهنده و گندم به عنوان والد گیرنده بود مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

مواد گیاهی مورد آزمایش: به منظور بررسی خصوصیات کروموزومی گونه جو زراعی بر اساس نشانگرهای کاریوتیپی و مولکولی از هفت لاین افزایشی که هرکدام دارای یک جفت کروموزوم اضافی منتقل شده به زمینه ژنتیکی گندم زراعی، واریته بهاره چینی (Chinese spring)، از والد گونه جو زراعی واریته L. Betzes بودند، استفاده گردید (جدول 1).

آزمایش سیتوژنتیکی: در ابتدا بذور داخل پتری­دیش و روی کاغذ صافی کشت شدند. پس از 48 ساعت ریشه تحت پیش تیمار محلول آلفا برومونفتالین 1/0 درصد (وزنی/حجمی) به ‎مدت 3 ساعت قرار گرفت. پس از این مرحله ریشه­ها برای عمل تثبیت مدت 18 ساعت در محلول لویتسکی قرار گرفتند. بعد از تثبیت برای نگهداری طولانی بلافاصله در  اتانول 70 درصد (حجمی/حجمی) به یخچال مننتقل شدند. جهت مطالعه لاین، نمونه‎ها در ماده هیدرولیزکننده (هیدروکسید سدیم 1 نرمال) در درجه حرارت 64 درجه سانتی‎گراد، قرار داده شدند. بعد از هیدرولیز، نمونه­ها در محلول رنگ هماتوکسیلین به‎مدت 4 ساعت قرار گرفتند. پس از قرار دادن نمونه‎ها روی لام، منطقه مریستمی با استفاده از تیغ مخصوص برش داده شد و پس از قرار دادن یک قطره­ محلول استیک اسید 45 درصد (حجمی/حجمی) روی نمونه، لامل روی آن گذاشته شد. با وارد کردن ضربات آهسته بر روی نمونه سلولهای ریشه پخش شدند. تصاویر کروموزومی با میکروسکوپ نوری (Olympus BH2) مجهز به دوربین ذخیره شدند.

کروموزومهای 5 سلول متافازی عکس برداری شده از هر لاین در یک فایل جداگانه، مرتب گردید. با استفاده از نرم افزار3.3  MicroMeasure و از طریق مشخص کردن ابتدا و انتهای کروموزوم و محل سانترومر آنها، ویژگیهای کروموزومی نظیر طول بازوی بلند (L) (Long arm)، طول بازوی کوتاه (S) (Short arm)، طول کل کروموزوم (CL) (Total chromosome length)، نسبت بازوها (AR) (Arm ratio)، شاخص سانترومری (CI) (Centromer index) محاسبه و در محیط Excel ذخیره شدند، همچنین نوع کروموزومها K.F)) (karyotype formula) بر اساس روش Levan تعیین گردید (21).

آزمایش مولکولی: استخراج DNA به روشCTAB  تغییر یافته (12) برای ژنوتیپها انجام گرفت. کمیت و کیفیت DNA استخراج شده با استفاده از ژل آگارز 8/0 درصد (وزنی / حجمی) و روش اسپکتروفتومتری مشخص شد. واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) در حجم 20 میکرولیتر (50 نانوگرم DNA الگو، 2 میلی مولار MgCl₂، 05/0 میلی مولار از هر dNTP، 2/0 میکرومول آغازگر، یک واحد آنزیم Taq DNA Polymerase و بافر واکنش به مقدار x1) انجام شد. چرخه حرارتی شامل یک مرحله واسرشت سازی اولیه در دمای ۹۵ درجه سلسیوس و به مدت ۵ دقیقه و 40 سیکل حرارتی بود که در هر چرخه نیز، زمان و دمای واسرشت سازی به ترتیب ۳۰ ثانیه و ۹۵ درجه سلسیوس، زمان اتصال آغازگر 45 ثانیه و دمای آن برای هر آغازگر (جدول 2) متفاوت بود. همچنین زمان و دمای توسعه رشته نیز به ترتیب ۶۰ ثانیه و ۷۲ درجه سلسیوس بود. توسعه نهایی به مدت 7 دقیقه در دمای ۷۲ درجه سلسیوس انجام شد. در این آزمایش از ژل آگارز 2 درصد (وزنی / حجمی) با بافر TBE (Tris base, Boric acid and EDTA) یک درصد برای بارگذاری محصولات واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR) (Polymerase chain reaction) استفاده گردید و سپس رنگ آمیزی ژل در محلول اتیدیوم برماید (یک میکروگرم در میکرو­لیتر) انجام گردید و از دستگاه Gel Document جهت نمایان شدن  باندها استفاده شد. در پایان نیز با استفاده از نرم افزارDarwin 5  داده­های حاصل مورد بررسی قرار گرفت. محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC) (Polymorphic information content) از طریق فرمول  (25) محاسبه گردید.

نتایج

مطالعات سیتوژنتیکی: بررسی سلولهای متافازی لاینهای افزایشی مورد مطالعه، وجود جفت کروموزوم اضافی برای تمام لاینها را نشان داد.

در شکل 1 سیتوتیپ و کاریوتیپ لاینهای افزایشی، والد دهنده و گیرنده ارائه شده است. به منظور تعیین کروموزم اضافه شده به زمینه ژنتیکی والد گیرنده از مطالعات انجام شده توسط Tjio و Hagber (1951)، که مورد قبول اکثر سیتولوژیستهایی است که روی جو کار می­کنند، استفاده شد (28)، هرچند از مطالعات Tuleen (1973) و Kunzel (1976) نیز در شناسایی کروموزومهای 1، 2 و 3 استفاده گردید (20 و 30). در مجموع تعداد هفت جفت کروموزوم منتقل شده به زمینه ژنتیکی والد گیرنده شناسایی شد و از این کروموزومها یک کاریوتیپ ساختگی تهیه گردید که این کاریوتیپ تحت عنوان کاریوتیپ H.V_s نامگذاری شد (شکل 2).

بررسی ویژگیهای کروموزومهای اضافی: در شکل 2 کاریوتیپ ساختگی کروموزومهای اضافه شده به زمینه ژنتیکی والد گیرنده ارائه شده است. همان طور که ملاحظه می­گردد، تمام کروموزومها متاسنتریک بودند. نتایج نشان داد که کروموزوم شماره یک، پانزدهمین کروموزوم لاین H1؛ کروموزوم شماره دو، ششمین کروموزوم لاین H2؛ کروموزوم شماره سه، شانزدهمین کروموزوم لاین H3؛ کروموزوم شماره چهار، پانزدهمین کروموزوم لاین H4؛ کروموزوم شماره پنج، بیستمین کروموزوم لاین H5؛ کروموزوم شماره شش، پانزدهمین کروموزوم لاین H6 و کروموزوم شماره هفت، ششمین کروموزوم لاین H7 بود (شکل 1).

تجزیه خوشه­ای صفات کاریوتیپی: به منظور تأیید تعیین کروموزومهای اضافی مشخص شده برای کاریوتیپ لاینهای افزایشی (H1، H2، H3، H4، H5، H6 و H7)، والد گیرنده (Ch.S)، والد دهنده (H.V) و کاریوتیپ ساختگی از کروموزومهای اضافی تعیین شده (H.V_s) صفات کاریوتیپی طول کل کروموزوم، طول بازوی بلند، طول بازوی کوتاه، شاخص سانترومری و نسبت بازوی بلند به کوتاه محاسبه شد و بر اساس خصوصیات کاریوتیپی تجزیه کلاستر به روش Ward انجام شد که نمودار خوشه­ای حاصل در شکل 3 ارائه شده است. چنانکه ملاحظه می­گردد، والد دهنده به همراه کاریوتیپ حاصل از کروموزومهای منتقل شده در یک گروه قرار گرفتند و این مسئله تأییدی بر شناسایی کروموزمهای منتقل شده بود. بنابراین می­توان بیان داشت که کروموزومهای مشخص شده به عنوان کروموزومهای انتقالی در لاینهای افزایش مورد بررسی، به درستی مشخص شدند. کاریوتیپ ارائه شده بر اساس کروموزومهای اضافی تطابق بالایی با کاریوتیپ والد دهنده داشت.

شکل 1- سیتوتیپ و کاریوتیپ لاین­های افزایشی، والد دهنده و گیرنده

شکل 2- کاریوتیپ ساختگی کروموزومهای اضافه شده به زمینه ژنتیکی والد گیرنده

شکل 3- نمودار خوشه­ای حاصل از تجزیه کلاستر لاینهای افزایشی، والد دهنده (H.V)، والد گیرنده (Ch.S) و کاریوتیپ ساختگی کروموزومهای (H.V_s) اضافی تعیین شده بر اساس خصوصیات کاریوتیپی به روش Ward

بررسی­های مولکولی: به منظور مکان­یابی بیشترین مناطق تکثیر شده در لاینهای مورد بررسی برای کروموزوم اضافه شده به زمینه ژنتیکی والد گیرنده 12 آغازگر ISSR مورد استفاده قرار گرفت؛ که از این 12 آغازگر تنها 9 عدد دارای باند­های قابل امتیاز­دهی بودند. آغازگر­های ISSR در مجموع توانستند 58 مکان مارکری را شناسایی کنند که از این تعداد 8  باند یک شکل مشاهده شد و سایر باند­ها چند شکل بودند. آغازگر­های IS₅ و IS₁₃ بیشترین تعداد باند (تعداد 9 باند) و آغازگر IS₁₅ کمترین تعداد باند (تعداد 4 باند) را نشان دادند. الگوی باندی 9 لاین مورد بررسی با استفاده از آغازگر­ IS₅ در شکل 4 نشان داده شده است. هر ژنوتیپ به طور متوسط 33/32 باند برای 9 پرایمر نشان داد و لاین H7 با تعداد 36 باند دارای بیشترین تعداد باند و لاین H6 با تعداد 25 باند دارای کمترین تعداد باند بود. نتایج به دست آمده برای آغازگر­های استفاده شده، در جدول 2 ارائه شده است. کمترین میزان درصد چند شکلی را آغازگر­های IS₁₃ و IS₁₆ به ترتیب به میزان 67/66 درصد و 75 درصد داشتند و بیشترین درصد چند شکلی برای آغازگر­های IS₁₀، IS₁₁، IS₁₄ و IS₁₅ به میزان 100 درصد بود، همچنین میانگین درصد چند شکلی برابر 67/88 درصد بود. متوسط تعداد باند­های تولید شده توسط هر آغازگر برای 9 لاین برابر 44/6 بود و متوسط تعداد باند­های چندشکل 56/5 بود. بیشترین میزان PIC مربوط به آغازگرهای­ IS₁₀ و  IS₁₅ بود.

ماتریس تشابه ژنوتیپها با استفاده از ضریب تشابه دایس: تشابه ژنتیکی لاینهای مورد بررسی با استفاده از ضریب تشابه دایس از 434/0 تا 845/0 متغیر بود (جدول 3)، میانگین تشابه بین لاینها برابر 655/0 بود. بنابراین می­توان بیان داشت تنوع نسبتاً مطلوبی در بین لاینهای مورد بررسی بر اساس نشانگر ISSR وجود داشت.

متوسط تشابه بین لاینهای افزایشی 695/0 بود، بنابراین شباهت بین لاینهای افزایشی از متوسط تشابه بیشتر بود. متوسط تشابه لاینهای افزایشی با والد گیرنده 722/0 بود، این متوسط ضریب تشابه بالا دلالت بر این دارد که کروموزومهای منتقل شده تأثیر بالایی بر تغییر زمینه ژنتیکی والد گیرنده بر اساس پرایمرهای ISSR مورد بررسی نداشتند. متوسط تشابه لاینهای افزایشی با والد دهنده 499/0 بود، پایین بودن این ضریب تشابه نیز بیانگر تأثیر کم کروموزومهای انتقالی در زمینه ژنتیکی والد گیرنده بر اساس مارکرهای ISSR مورد بررسی بود. والد دهنده و گیرنده فاصله ژنتیکی بالایی داشتند (453/0) و پرایمرهای مورد بررسی به خوبی دو گونه مورد مطالعه را ازهمدیگر تفکیک کردند.

شکل 4- الگوی باندی لاینهای مورد بررسی با استفاده از آغازگر IS₅

لاینهای H4، H5 و H6 بیشترین شباهت (به ترتیب با ضریب تشابه 810/0، 793/0 و 792/0) با والد گیرنده را داشتند و دارای بیشترین فاصله (به ترتیب با ضریب تشابه 434/0، 453/0 و 509/0) با والد دهنده بودند. ازطرف دیگر لاین H7 دارای بیشترین شباهت (604/0) با والد دهنده بود، تشابه بالای این لاین با والد دهنده نشانگر این مطلب بود که پرایمرهای مورد بررسی مکانهای بیشتری را بر روی کروموزوم H7 در جو را تکثیر کردند. لاین H1 دارای بیشترین فاصله (552/0) با والد گیرنده بود  و با والد دهنده  تشابه نسبتاً بالایی (505/0) را نشان داد. در مجموع هرچقدر تشابه لاینها به والد گیرنده بیشتر بود آغازگرهای مورد بررسی مکانهای مارکری کمتری از کروموزومهای اضافه شده به زمینه ژنتیکی والد گیرنده را تکثیر کردند.

تجزیه خوشه­ای: نمودار حاصل از تجزیه خوشه­ای به روش UPGMA بر اساس ضریب تشابه دایس باعث گروه­بندی لاینها در چهار گروه شد (شکل 5).

شکل 5- نمودار حاصل از تجزیه خوشه­ای لاینها بر اساس داده­های نشانگر ISSR با روش UPGMA

چنانکه ملاحظه می­گردد گروه­بندی حاصل از تجزیه خوشه­ای به خوبی والد دهنده و گیرنده را در دو گروه جداگانه قرار داد. از طرف دیگر تمام لاینهای افزایشی با والد گیرنده در فاصله نسبتاً بالاتری نسبت به خط برش در یک گروه قرار گرفتند. اما ملاحظه می­گردد که لاینهای H4، H5 و H6 با بیشترین شباهت با والد گیرنده در یک گروه قرار داشتند. و گروه بعدی شامل لاینهای H2، H3 و H7 بود، که لاینهای این گروه اکثراً شباهت بالاتری با والد دهنده داشتند. گروه سوم لاین H1 بود که به تنهایی در یک گروه قرار داشت و در نهایت گروه چهارم بود که شامل والد دهنده بود.

تجزیه به مختصات اصلی: با توجه به نتایج به دست آمده از تجزیه به مختصات و بر اساس مختصات اول و دوم دیاگرام پراکنشی ژنوتیپها رسم شد، که این دیاگرام با نتایج تجزیه خوشه­ای بیشتر با توجه به مختصات اول مطابقت داشت، اما بر اساس مختصات دوم نیز تا حدودی تطابق مشاهده گردید (شکل 6). در مجموع والد دهنده و گیرنده بر اساس دو محور مختصات اصلی اول و دوم از همدیگر تفکیک شدند و از طرف دیگر لاینهای H4، H5 و H6 با بیشترین شباهت با والد گیرنده بر اساس نمودار در کنار والد گیرنده در یک گروه قرار داشتند. همچنین لاینهای H2، H3 و H7 نیز بر اساس دو محور مختصات در یک گروه بودند و لاین H1 نیز محور مختصات جداگانه­ای داشت که بیشتر به والد دهنده نزدیک تر بود.

شکل 6- بای پلات لاینها برای نشانگر ISSR بر اساس دو محور مختصات اصلی اول و دوم