نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 عضو هیات علمی دانشگاه پیام نور

2 عضو هیات علمی بخش تحقیقات جنگلها و مراتع، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی استان کرمانشاه، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرمانشاه، ایران

3 مدرس گروه کشاورزی دانشگاه پیام نور

4 کارشناس ارشد اصلاح نباتات دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرمانشاه

چکیده

محصولات ژنتیکی مانند لاین‌های افزایشی و جایگزینی، منابع ژنتیکی با ارزشی در جهت برنامه‌های اصلاحی و تحقیقات بنیادی می‌باشند. هدف از این تحقیق مقایسه لاین‌های افزایشی گندم-جو، که در آن کروموزوم‌های جو زراعی واریته Betzes به زمینه ژنتیکی گندم نان واریته Chinese spring منتقل شده، بر اساس نشانگرهای سیتوژنتیکی و مولکولی بود. بر اساس مطالعات سیتوژنتیکی وجود کروموزوم‌های اضافی در لاین‌های افزایشی تایید شد و تطابق کاریوتیپ حاصل از این کروموزوم‌ها با کاریوتیپ والد دهنده نیز تایید گردید. مطالعات سیتوژنتیکی مشخص کرد که سه کروموزوم H1، H4 و H5 بیشترین تفاوت مورفولوژیکی با والد گیرنده داشتند و کروموزوم H6 دارای بیشترین شباهت مورفولوژیکی با والد گیرنده بود. تنوع ژنتیکی مطلوبی بر اساس مارکر ISSR در بین لاین‌ها مشاهده شد. آغازگرهای‌ IS10 و IS15 بهترین چندشکلی را در بین لاین‌ها نشان دادند. آغازگرهای مورد بررسی بیشتر مناطقی از کروموزوم‌های H2، H3 و H7 را در جو تکثیر کردند. مناطق تکثیری توسط آغازگرهای مورد استفاده برای مارکر ISSR کمتر بر روی کروموزوم‌های H4، H5 و H6 قرار داشتند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Camparision of wheat-barely disomic addition lines using cytogenetical and molecular markers

نویسندگان [English]

  • mohsen farshadfar 1
  • hooshmand safari 2
  • hooman shirvani 3
  • salehe aghaienia 4

1 - Associ. Prof., Department of Agriculture, Payame Noor University, I.R. Iran

2 Faculty Member of Research Department of Forests and Rangelands, Kermanshah Agricultural and Natural Resources Research and Education Center, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Kermanshah, I.R. of Iran

3 Department of Agriculture, Payame Noor University, I.R. Iran

4 M.Sc., Plant breeding, Islamic Azad University, Borujerd, I.R. Iran

چکیده [English]

Genetic materials such as alien additions and substitutions are valuable genetic resources for both plant breeding and basic research. The objective of this study was determination of genetic diversity in wheat addition lines of Hordeum vulgare L., (2n = 2x =14. cv. Betzes) into the genetic background of bread wheat (Triticum aestivum L., 2n = 6x =24, AABBDD, cv. Chinese Spring) by cytogenetical and molecular markers. Cytogenetical study indicated that chromosomes of 1H, 4H and 5H had the morphological differences with recipient parent and 6H had the morphological similarity with recipient parent. A desirable genetic diversity observed based on ISSR markers between the lines. The primers of IS10 and IS15 showed the best polymorphism between the lines. The studied primers were amplified in barley the most regions of the chromosomes of 2H, 3H and 7H. The proliferation regions by using primers for ISSR marker lower placed on chromosomes of 4H, 5H and 6H.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Barely
  • Addition line
  • ISSR marker
  • Cytogenetic

مقایسه لاینهای افزایشی دیزومیک گندم- جو بر اساس خصوصیات سیتوژنتیکی و مولکولی

محسن فرشادفر1، هوشمند صفری2*، هومن شیروانی1 و صالحه آقایی­نیا3

1 ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، گروه کشاورزی

2 ایران، کرمانشاه، سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزیو منابع طبیعی استان کرمانشاه، بخش تحقیقات جنگلها و مراتع

3ایران، کرمانشاه، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد کرمانشاه، گروه اصلاح نباتات

تاریخ دریافت: 27/8/96                تاریخ پذیرش: 28/9/96

چکیده

محصولات ژنتیکی مانند لاینهای افزایشی و جایگزینی، منابع ژنتیکی با ارزشی در جهت برنامه­های اصلاحی و تحقیقات بنیادی می­باشند. هدف از این تحقیق مقایسه لاینهای افزایشی گندم - جو، که در آن کروموزومهای جو زراعی واریته Betzes به زمینه ژنتیکی گندم نان واریته Chinese spring منتقل شده، بر اساس نشانگرهای سیتوژنتیکی و مولکولی بود. بر اساس مطالعات سیتوژنتیکی وجود کروموزومهای اضافی در لاینهای افزایشی تأیید شد و تطابق کاریوتیپ حاصل از این کروموزومها با کاریوتیپ والد دهنده نیز تأیید گردید. مطالعات سیتوژنتیکی مشخص کرد که سه کروموزوم H1، H4 و H5 بیشترین تفاوت مورفولوژیکی با والد گیرنده داشتند و کروموزوم H6 دارای بیشترین شباهت مورفولوژیکی با والد گیرنده بود. تنوع ژنتیکی مطلوبی بر اساس مارکر ISSR در بین لاینها مشاهده شد. آغازگرهای­ IS10 و  IS15 بهترین چندشکلی را در بین لاینها نشان دادند. آغازگرهای مورد بررسی بیشتر مناطقی از کروموزومهای H2، H3 و H7 را در جو تکثیر کردند. مناطق تکثیری توسط آغازگرهای مورد استفاده برای مارکر ISSR کمتر بر روی کروموزومهای H4، H5 و H6 قرار داشتند.

واژه های کلیدی: جو، لاین افزایشی، مارکر ISSR، سیتوژنتیک

* نویسنده مسئول، تلفن: 09183305823 ، پست الکترونیکی: hooshmand.safari@gmail.com

مقدمه

 

امروزه گندم (Triticum aestivum) غذای اصلی مردم بسیاری از کشورها می‌باشد به‌ طوری که بیش از 20 درصد کالری مورد نیاز جمعیت جهان را تأمین می‌کند (9). گندم به علت داشتن نشاسته، پروتئین و خواص نانوایی خوب بر سایر غلات ترجیح داده می­شود. اگر چه از سایر غلات نیز می­توان نان تهیه نمود، ولی تا امروز هیچ گیاهی در تهیه نان برای تغذیه انسان نتوانسته است با گندم رقابت کند (17). جو (Hordeum vulgare)از نظر اهمیت غذایی و سطح زیر کشت در میان غلات، پس از گندم، ذرت و برنج مقام چهارم را دارد. اما با توجه به اینکه در شرایط متنوع آب و هوایی قابل کشت است، از نظر دامنه گسترش کشت مقام اول را داراست (16). لاینهای افزایشی دیزومیک که حامل یک جفت کروموزوم از گونه­های خویشاوند به زمینه ژنتیکی گونه گیرنده هستند، می­توانند به منظور تعیین کروموزومهایی که حامل ژنهای کنترل کننده مقاومت به شوری، خشکی و غیره باشند، مورد استفاده قرار گیرد (22). لاینهای دارای یک کروموزوم اضافی از طریق اضافه شدن یک کروموزوم به گونه دریافت کننده تولید می­گردد و لاینهای دارای دو کروموزوم اضافی، از افزوده شدن یک جفت کروموزوم همولوگ از یک گونه خویشاوند به زمینه ژنتیکی گونه گیرنده به دست می­آیند (13). لاینهای افزایشی منابع ژنتیکی با ارزشی برای اصلاح گیاهان و تحقیقات پایه­ای  هستند (28). یک لاین کروموزوم افزایشی محصولات پیشرفته­ای در یک نوع گونه گیاهی است که برای اهداف زیادی مورد استفاده قرار می­گیرد، از قبیل معرفی ویژگیهای با ارزش نوع گیرنده، نقشه ژنی و نشان­گذاری یک کروموزوم بیگانه وارد شده، یک ژن بیگانه آزمایشی و فهم رفتار جفت شدگی میتوزی و ساختار کروموزوم و جدا کردن ژنهای منحصر به­فرد (8، 18، 23 و 28). برای شناسایی لاینهای افزایشی که حامل کروموزومهای مختلف انتقال داده شده می­باشند از یکی از تکنیکهای مورفولوژی، کاریوتیپ کروموزوم اضافه شده، جفت شدن کروموزوم میوزی در گیاهان F1 حاصل از تلاقی بین دو لاین افزایشی بیگانه (DAAL) (Disomic aline addition lines) ، تشخیص بیوشیمیایی و تلاقی داخلی (Inter crossing) استفاده می گردد. لاینهای اضافی مونوسومیک و دی­سومیک را می­توان از نظر مورفولوژیکی از همدیگر و از والد دریافت­کننده شناسایی نمود زیرا کروموزومهای اضافه شده ویژگیهای مورفولوژیکی سنبله و ویژگیهای رویشی را تغییر می­دهد. جا به جاییها ممکن است هم کیفی و هم کمی باشد. بیشتر تغییرات به­خاطر کنش متقابل بین ژنهای والدهای دهنده و گیرنده می­باشد و هر کروموزوم یک اثر خاصی روی مورفولوژی و باروری گیاه دارد (14، 24 و 26). لاینهای افزایشی دیزومیک گندم - جو برای مطالعه و بررسی بیان ژنهای خارجی در ژنوم گندم و ترسیم نقشه فیزیکی ژنوم جو توسط Cho و همکاران (2006) مورد استفاده قرار گرفته است و از این طریق نقشه فیزیکی ژنهای موجود در لاین 6H مشخص شده است. نتایج این پژوهش نشان­دهنده بی­نظمی (فعالیت و عدم فعالیت) لوکوسها بود که پدیده­ای مرسوم و عادی در لاینهای افزایشی دیزومیک گندم - جواست. لاینهای افزایشی دیزومیک جو-گندم برای تهیه نقشه فیزیکی ژنی کروموزومهای جو یک منبع عالی ژنی می­باشد. از این طریق بررسی سازمان ژنی در جو امکان­پذیر شده است (10). لذا در تحقیق حاضر از طریق روشهای سیتوژنتیکی و مولکولی بر اساس مارکر ISSR لاینهای افزایشی کروموزومی جو-گندم که در آن جو به عنوان والد دهنده و گندم به عنوان والد گیرنده بود مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

مواد گیاهی مورد آزمایش: به منظور بررسی خصوصیات کروموزومی گونه جو زراعی بر اساس نشانگرهای کاریوتیپی و مولکولی از هفت لاین افزایشی که هرکدام دارای یک جفت کروموزوم اضافی منتقل شده به زمینه ژنتیکی گندم زراعی، واریته بهاره چینی (Chinese spring)، از والد گونه جو زراعی واریته L. Betzes بودند، استفاده گردید (جدول 1).

آزمایش سیتوژنتیکی: در ابتدا بذور داخل پتری­دیش و روی کاغذ صافی کشت شدند. پس از 48 ساعت ریشه تحت پیش تیمار محلول آلفا برومونفتالین 1/0 درصد (وزنی/حجمی) به ‎مدت 3 ساعت قرار گرفت. پس از این مرحله ریشه­ها برای عمل تثبیت مدت 18 ساعت در محلول لویتسکی قرار گرفتند. بعد از تثبیت برای نگهداری طولانی بلافاصله در  اتانول 70 درصد (حجمی/حجمی) به یخچال مننتقل شدند. جهت مطالعه لاین، نمونه‎ها در ماده هیدرولیزکننده (هیدروکسید سدیم 1 نرمال) در درجه حرارت 64 درجه سانتی‎گراد، قرار داده شدند. بعد از هیدرولیز، نمونه­ها در محلول رنگ هماتوکسیلین به‎مدت 4 ساعت قرار گرفتند. پس از قرار دادن نمونه‎ها روی لام، منطقه مریستمی با استفاده از تیغ مخصوص برش داده شد و پس از قرار دادن یک قطره­ محلول استیک اسید 45 درصد (حجمی/حجمی) روی نمونه، لامل روی آن گذاشته شد. با وارد کردن ضربات آهسته بر روی نمونه سلولهای ریشه پخش شدند. تصاویر کروموزومی با میکروسکوپ نوری (Olympus BH2) مجهز به دوربین ذخیره شدند.

 

جدول 1- لیست لاینهای مورد بررسی در این مطالعه

شماره

لاین

مشخصات لاین

1

H1

کروموزوم شماره یک والد دهنده به زمینه ژنتیکی والد گیرنده اضافه شده است

2

H2

کروموزوم شماره دو والد دهنده به زمینه ژنتیکی والد گیرنده اضافه شده است

3

H3

کروموزوم شماره سه والد دهنده به زمینه ژنتیکی والد گیرنده اضافه شده است

4

H4

کروموزوم شماره چهار والد دهنده به زمینه ژنتیکی والد گیرنده اضافه شده است

5

H5

کروموزوم شماره پنج والد دهنده به زمینه ژنتیکی والد گیرنده اضافه شده است

6

H6

کروموزوم شماره شش والد دهنده به زمینه ژنتیکی والد گیرنده اضافه شده است

7

H7

کروموزوم شماره هفت والد دهنده به زمینه ژنتیکی والد گیرنده اضافه شده است

8

Ch.S

والد گیرنده که واریته بهاره چینی (Chinese spring) گندم زراعی بود

9

H.V

والد دهنده که واریته L. Betzes جو زراعی بود

 

 

کروموزومهای 5 سلول متافازی عکس برداری شده از هر لاین در یک فایل جداگانه، مرتب گردید. با استفاده از نرم افزار3.3  MicroMeasure و از طریق مشخص کردن ابتدا و انتهای کروموزوم و محل سانترومر آنها، ویژگیهای کروموزومی نظیر طول بازوی بلند (L) (Long arm)، طول بازوی کوتاه (S) (Short arm)، طول کل کروموزوم (CL) (Total chromosome length)، نسبت بازوها (AR) (Arm ratio)، شاخص سانترومری (CI) (Centromer index) محاسبه و در محیط Excel ذخیره شدند، همچنین نوع کروموزومها K.F)) (karyotype formula) بر اساس روش Levan تعیین گردید (21).

آزمایش مولکولی: استخراج DNA به روشCTAB  تغییر یافته (12) برای ژنوتیپها انجام گرفت. کمیت و کیفیت DNA استخراج شده با استفاده از ژل آگارز 8/0 درصد (وزنی / حجمی) و روش اسپکتروفتومتری مشخص شد. واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) در حجم 20 میکرولیتر (50 نانوگرم DNA الگو، 2 میلی مولار MgCl2، 05/0 میلی مولار از هر dNTP، 2/0 میکرومول آغازگر، یک واحد آنزیم Taq DNA Polymerase و بافر واکنش به مقدار x1) انجام شد. چرخه حرارتی شامل یک مرحله واسرشت سازی اولیه در دمای ۹۵ درجه سلسیوس و به مدت ۵ دقیقه و 40 سیکل حرارتی بود که در هر چرخه نیز، زمان و دمای واسرشت سازی به ترتیب ۳۰ ثانیه و ۹۵ درجه سلسیوس، زمان اتصال آغازگر 45 ثانیه و دمای آن برای هر آغازگر (جدول 2) متفاوت بود. همچنین زمان و دمای توسعه رشته نیز به ترتیب ۶۰ ثانیه و ۷۲ درجه سلسیوس بود. توسعه نهایی به مدت 7 دقیقه در دمای ۷۲ درجه سلسیوس انجام شد. در این آزمایش از ژل آگارز 2 درصد (وزنی / حجمی) با بافر TBE (Tris base, Boric acid and EDTA) یک درصد برای بارگذاری محصولات واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR) (Polymerase chain reaction) استفاده گردید و سپس رنگ آمیزی ژل در محلول اتیدیوم برماید (یک میکروگرم در میکرو­لیتر) انجام گردید و از دستگاه Gel Document جهت نمایان شدن  باندها استفاده شد. در پایان نیز با استفاده از نرم افزارDarwin 5  داده­های حاصل مورد بررسی قرار گرفت. محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC) (Polymorphic information content) از طریق فرمول  (25) محاسبه گردید.

نتایج

مطالعات سیتوژنتیکی: بررسی سلولهای متافازی لاینهای افزایشی مورد مطالعه، وجود جفت کروموزوم اضافی برای تمام لاینها را نشان داد.

 

جدول 2- درصد چند شکلی، تعداد کل باند و محتوای اطلاعات چند شکلی در آغازگر­های مورد استفاده

کد آغازگر

توالی آغازگر

مکان­های تکثیر شده

مکان­های چند شکل

درصد چند شکلی

PIC

IS5

5'- AGAGAGAGAGAGAGAGC-3'

9

8

89/88%

302/0

IS9

5'- CTCTCTCTCTCTCTCTG-3'

5

4

80%

326/0

IS10

5'- GAGAGAGAGAGAGAGA Rc-3'

5

5

100%

494/0

IS11

5'-ACACACACACACACACC-3'

5

5

100%

346/0

IS12

5'-TGTGTGTGTGTGTGTGG-3'

8

7

5/87%

247/0

IS13

5'- AGAGAGAGAGAGAGAGYT-3'

9

6

67/66%

296/0

IS14

5'- GACAGACAGACAGACA-3'

5

5

100%

316/0

IS15

5'- GGATGGATGGATGGAT-3'

4

4

100%

395/0

IS16

5'-DBDACACACACACACACA-3'

8

6

75%

241/0

میانگین

 

44/6

56/5

67/88%

329/0


در شکل 1 سیتوتیپ و کاریوتیپ لاینهای افزایشی، والد دهنده و گیرنده ارائه شده است. به منظور تعیین کروموزم اضافه شده به زمینه ژنتیکی والد گیرنده از مطالعات انجام شده توسط Tjio و Hagber (1951)، که مورد قبول اکثر سیتولوژیستهایی است که روی جو کار می­کنند، استفاده شد (28)، هرچند از مطالعات Tuleen (1973) و Kunzel (1976) نیز در شناسایی کروموزومهای 1، 2 و 3 استفاده گردید (20 و 30). در مجموع تعداد هفت جفت کروموزوم منتقل شده به زمینه ژنتیکی والد گیرنده شناسایی شد و از این کروموزومها یک کاریوتیپ ساختگی تهیه گردید که این کاریوتیپ تحت عنوان کاریوتیپ H.Vs نامگذاری شد (شکل 2).

بررسی ویژگیهای کروموزومهای اضافی: در شکل 2 کاریوتیپ ساختگی کروموزومهای اضافه شده به زمینه ژنتیکی والد گیرنده ارائه شده است. همان طور که ملاحظه می­گردد، تمام کروموزومها متاسنتریک بودند. نتایج نشان داد که کروموزوم شماره یک، پانزدهمین کروموزوم لاین H1؛ کروموزوم شماره دو، ششمین کروموزوم لاین H2؛ کروموزوم شماره سه، شانزدهمین کروموزوم لاین H3؛ کروموزوم شماره چهار، پانزدهمین کروموزوم لاین H4؛ کروموزوم شماره پنج، بیستمین کروموزوم لاین H5؛ کروموزوم شماره شش، پانزدهمین کروموزوم لاین H6 و کروموزوم شماره هفت، ششمین کروموزوم لاین H7 بود (شکل 1).

تجزیه خوشه­ای صفات کاریوتیپی: به منظور تأیید تعیین کروموزومهای اضافی مشخص شده برای کاریوتیپ لاینهای افزایشی (H1، H2، H3، H4، H5، H6 و H7)، والد گیرنده (Ch.S)، والد دهنده (H.V) و کاریوتیپ ساختگی از کروموزومهای اضافی تعیین شده (H.Vs) صفات کاریوتیپی طول کل کروموزوم، طول بازوی بلند، طول بازوی کوتاه، شاخص سانترومری و نسبت بازوی بلند به کوتاه محاسبه شد و بر اساس خصوصیات کاریوتیپی تجزیه کلاستر به روش Ward انجام شد که نمودار خوشه­ای حاصل در شکل 3 ارائه شده است. چنانکه ملاحظه می­گردد، والد دهنده به همراه کاریوتیپ حاصل از کروموزومهای منتقل شده در یک گروه قرار گرفتند و این مسئله تأییدی بر شناسایی کروموزمهای منتقل شده بود. بنابراین می­توان بیان داشت که کروموزومهای مشخص شده به عنوان کروموزومهای انتقالی در لاینهای افزایش مورد بررسی، به درستی مشخص شدند. کاریوتیپ ارائه شده بر اساس کروموزومهای اضافی تطابق بالایی با کاریوتیپ والد دهنده داشت.

 

     
     

سیتوتیپ لاین H3

سیتوتیپ و کاریوتیپ لاین H2

سیتوتیپ و کاریوتیپ لاین H1

     
     

سیتوتیپ و کاریوتیپ لاین H6

سیتوتیپ و کاریوتیپ لاین H5

سیتوتیپ و کاریوتیپ لاین H4

     
     

سیتوتیپ و کاریوتیپ والد گیرنده

سیتوتیپ و کاریوتیپ والد دهنده

سیتوتیپ و کاریوتیپ لاین H7

شکل 1- سیتوتیپ و کاریوتیپ لاین­های افزایشی، والد دهنده و گیرنده

 

 

 

شکل 2- کاریوتیپ ساختگی کروموزومهای اضافه شده به زمینه ژنتیکی والد گیرنده

 

شکل 3- نمودار خوشه­ای حاصل از تجزیه کلاستر لاینهای افزایشی، والد دهنده (H.V)، والد گیرنده (Ch.S) و کاریوتیپ ساختگی کروموزومهای (H.Vs) اضافی تعیین شده بر اساس خصوصیات کاریوتیپی به روش Ward

بررسی­های مولکولی: به منظور مکان­یابی بیشترین مناطق تکثیر شده در لاینهای مورد بررسی برای کروموزوم اضافه شده به زمینه ژنتیکی والد گیرنده 12 آغازگر ISSR مورد استفاده قرار گرفت؛ که از این 12 آغازگر تنها 9 عدد دارای باند­های قابل امتیاز­دهی بودند. آغازگر­های ISSR در مجموع توانستند 58 مکان مارکری را شناسایی کنند که از این تعداد 8  باند یک شکل مشاهده شد و سایر باند­ها چند شکل بودند. آغازگر­های IS5 و IS13 بیشترین تعداد باند (تعداد 9 باند) و آغازگر IS15 کمترین تعداد باند (تعداد 4 باند) را نشان دادند. الگوی باندی 9 لاین مورد بررسی با استفاده از آغازگر­ IS5 در شکل 4 نشان داده شده است. هر ژنوتیپ به طور متوسط 33/32 باند برای 9 پرایمر نشان داد و لاین H7 با تعداد 36 باند دارای بیشترین تعداد باند و لاین H6 با تعداد 25 باند دارای کمترین تعداد باند بود. نتایج به دست آمده برای آغازگر­های استفاده شده، در جدول 2 ارائه شده است. کمترین میزان درصد چند شکلی را آغازگر­های IS13 و IS16 به ترتیب به میزان 67/66 درصد و 75 درصد داشتند و بیشترین درصد چند شکلی برای آغازگر­های IS10، IS11، IS14 و IS15 به میزان 100 درصد بود، همچنین میانگین درصد چند شکلی برابر 67/88 درصد بود. متوسط تعداد باند­های تولید شده توسط هر آغازگر برای 9 لاین برابر 44/6 بود و متوسط تعداد باند­های چندشکل 56/5 بود. بیشترین میزان PIC مربوط به آغازگرهای­ IS10 و  IS15 بود.

ماتریس تشابه ژنوتیپها با استفاده از ضریب تشابه دایس: تشابه ژنتیکی لاینهای مورد بررسی با استفاده از ضریب تشابه دایس از 434/0 تا 845/0 متغیر بود (جدول 3)، میانگین تشابه بین لاینها برابر 655/0 بود. بنابراین می­توان بیان داشت تنوع نسبتاً مطلوبی در بین لاینهای مورد بررسی بر اساس نشانگر ISSR وجود داشت.

 

جدول 3- ماتریس تشابه با استفاده ضریب تشابه دایس برای لاینهای مورد بررسی با استفاده از نشانگر ISSR

لاین

H1

H2

H3

H4

H5

H6

H7

Ch.S

H2

603/0

 

 

 

 

 

 

 

H3

638/0

828/0

 

 

 

 

 

 

H4

500/0

724/0

690/0

 

 

 

 

 

H5

621/0

638/0

638/0

845/0

 

 

 

 

H6

509/0

774/0

660/0

811/0

830/0

 

 

 

H7

586/0

810/0

810/0

707/0

690/0

679/0

 

 

Ch.S

552/0

707/0

672/0

810/0

793/0

792/0

724/0

 

H.V

509/0

472/0

509/0

434/0

453/0

509/0

604/0

453/0

                                                                                                                                                                                                                                                                               

 

 

متوسط تشابه بین لاینهای افزایشی 695/0 بود، بنابراین شباهت بین لاینهای افزایشی از متوسط تشابه بیشتر بود. متوسط تشابه لاینهای افزایشی با والد گیرنده 722/0 بود، این متوسط ضریب تشابه بالا دلالت بر این دارد که کروموزومهای منتقل شده تأثیر بالایی بر تغییر زمینه ژنتیکی والد گیرنده بر اساس پرایمرهای ISSR مورد بررسی نداشتند. متوسط تشابه لاینهای افزایشی با والد دهنده 499/0 بود، پایین بودن این ضریب تشابه نیز بیانگر تأثیر کم کروموزومهای انتقالی در زمینه ژنتیکی والد گیرنده بر اساس مارکرهای ISSR مورد بررسی بود. والد دهنده و گیرنده فاصله ژنتیکی بالایی داشتند (453/0) و پرایمرهای مورد بررسی به خوبی دو گونه مورد مطالعه را ازهمدیگر تفکیک کردند.

 

 

شکل 4- الگوی باندی لاینهای مورد بررسی با استفاده از آغازگر IS5

 

لاینهای H4، H5 و H6 بیشترین شباهت (به ترتیب با ضریب تشابه 810/0، 793/0 و 792/0) با والد گیرنده را داشتند و دارای بیشترین فاصله (به ترتیب با ضریب تشابه 434/0، 453/0 و 509/0) با والد دهنده بودند. ازطرف دیگر لاین H7 دارای بیشترین شباهت (604/0) با والد دهنده بود، تشابه بالای این لاین با والد دهنده نشانگر این مطلب بود که پرایمرهای مورد بررسی مکانهای بیشتری را بر روی کروموزوم H7 در جو را تکثیر کردند. لاین H1 دارای بیشترین فاصله (552/0) با والد گیرنده بود  و با والد دهنده  تشابه نسبتاً بالایی (505/0) را نشان داد. در مجموع هرچقدر تشابه لاینها به والد گیرنده بیشتر بود آغازگرهای مورد بررسی مکانهای مارکری کمتری از کروموزومهای اضافه شده به زمینه ژنتیکی والد گیرنده را تکثیر کردند.

تجزیه خوشه­ای: نمودار حاصل از تجزیه خوشه­ای به روش UPGMA بر اساس ضریب تشابه دایس باعث گروه­بندی لاینها در چهار گروه شد (شکل 5).

 

 

 

شکل 5- نمودار حاصل از تجزیه خوشه­ای لاینها بر اساس داده­های نشانگر ISSR با روش UPGMA


چنانکه ملاحظه می­گردد گروه­بندی حاصل از تجزیه خوشه­ای به خوبی والد دهنده و گیرنده را در دو گروه جداگانه قرار داد. از طرف دیگر تمام لاینهای افزایشی با والد گیرنده در فاصله نسبتاً بالاتری نسبت به خط برش در یک گروه قرار گرفتند. اما ملاحظه می­گردد که لاینهای H4، H5 و H6 با بیشترین شباهت با والد گیرنده در یک گروه قرار داشتند. و گروه بعدی شامل لاینهای H2، H3 و H7 بود، که لاینهای این گروه اکثراً شباهت بالاتری با والد دهنده داشتند. گروه سوم لاین H1 بود که به تنهایی در یک گروه قرار داشت و در نهایت گروه چهارم بود که شامل والد دهنده بود.

تجزیه به مختصات اصلی: با توجه به نتایج به دست آمده از تجزیه به مختصات و بر اساس مختصات اول و دوم دیاگرام پراکنشی ژنوتیپها رسم شد، که این دیاگرام با نتایج تجزیه خوشه­ای بیشتر با توجه به مختصات اول مطابقت داشت، اما بر اساس مختصات دوم نیز تا حدودی تطابق مشاهده گردید (شکل 6). در مجموع والد دهنده و گیرنده بر اساس دو محور مختصات اصلی اول و دوم از همدیگر تفکیک شدند و از طرف دیگر لاینهای H4، H5 و H6 با بیشترین شباهت با والد گیرنده بر اساس نمودار در کنار والد گیرنده در یک گروه قرار داشتند. همچنین لاینهای H2، H3 و H7 نیز بر اساس دو محور مختصات در یک گروه بودند و لاین H1 نیز محور مختصات جداگانه­ای داشت که بیشتر به والد دهنده نزدیک تر بود.

 

 

شکل 6- بای پلات لاینها برای نشانگر ISSR بر اساس دو محور مختصات اصلی اول و دوم


بحث

در یک جمع بندی کلی می­توان بیان داشت که وجود کروموزومهای اضافی در لاینهای افزایشی تأیید شد و کاریوتیپ حاصل از این کروموزومها با کاریوتیپ والد دهنده تطابق داشت. Gupta (1970) با استفاده از مورفولوژی کروموزومهای منتقل شده چاودار در زمینه ژنتیکی گندم گزارش کرد که برای این کروموزومهای انتقالی تنوع مورفولوژیکی وجود دارد (15)، همچنین Szakacs و Molnar-lang (2010) عدم پایدارای کروموزومهای انتقالی چاودار به زمینه ژنتیکی گندم را گزارش نمودند (28). از طرف دیگر وجود چندشکلی بین واریته­ای برای مورفولوژی کروموزومهای جو زراعی گزارش شده است (31). در هرحال اخوان و سعیدی (1389) بر اساس مورفولوژی کروموزومهای جو زراعی کاریوتیپ آن را مشخص کردند، که کاریوتیپ به دست آمده در این تحقیق با کاریوتیپ گزارش شده توسط آنها تطابق بالایی داشت (1).

همچنین در مطالعه دو کاریوتیپ H.V و H.Vs مشخص گردید که عامل تفکیک این دو کاریوتیپ از همدیگر،  بیشتر طول بازوی کوتاه و متوسط طول کل کروموزوم بود. دیگر صفات کاریوتیپی این دو کاریوتیپ با همدیگر یکسان بود و کلیه کروموزومها به صورت متاسانتریک بودند. اخوان و سعیدی (1389) برای جمعیتهای مختلف گونه جو زراعی کاریوتیپ متقارنی گزارش کردند و در اکثر جمعیتها تمام کروموزومها متاسانتریک بودند و در مواردی وجود یک کروموزوم ساب­متاسنتریک نیز گزارش کردند (1). یزدان­ستا و همکاران (1383) فرمول کاریوتیپی m7 را برای جو زراعی گزارش کردند (6). با توجه به کاریوتیپهای تهیه شده مشخص گردید که کروموزومهای منتقل شده به والد گیرنده در چه محلی قرار گرفته اند . نتایج این بخش با نتایج به دست آمده از مطالعات قبلی که بر روی جو توسط بخشی خانیکی (1384)، اخوان و سعیدی (1389)، Tjio و Hagber (1951) و همچنین مطالعات Tuleen  (1973) و Kunzel (1976) صورت گرفته است مطابقت داشت (1، 3، 20، 29 و 30). از طرف دیگر مشخص شد که سه کروموزوم H1، H4 و H5 بیشترین تفاوت مورفولوژیکی را با والد گیرنده داشتند و کروموزوم H6 دارای بیشترین شباهت مورفولوژیکی با والد گیرنده بود. موسوی و همکاران (1389) در مطالعه لاینهای جایگزینی کروموزومی گندم هوپ در زمینه ژنتیکی بهاره چینی نشان دادند که لاینهای 2B,7B,7D,4D,3D,7A,6A و هوپ در یک گروه قرار گرفتند ، لذا می­توان از آنها برای اصلاح ژنتیکی تحمل به خشکی در گندم بهره جست (5). Riley و Chapman (1958) جفت شدن میوزی را در لاینهای اضافی و جایگزین واریته گندم Chinese spring به روش سی-بندینگ مطالعه نمودند (26). صبوری و همکاران (1396) در بررسی مکان یابی صفات مربوط به سنبله در جو، کروموزم شماره 4 را دارای اهمیت معرفی نمودند (4).

با توجه به نتایج به دست آمده تنوع ژنتیکی مطلوبی بر اساس مارکر ISSR در بین لاینها مشاهده شد، محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC) از صفر تا 5/0 متغیر است و هرچه این عدد بزرگتر باشد بیانگر فراوانی بیشتر چند شکلی برای آن جایگاه در ژنوتیپهای تحت بررسی می­باشد بنابراین آغازگرهای­ IS10 و  IS15بهتر از سایر آغازگر­ها توانستند فاصله ژنتیکی لاینها را مشخص کنند و آغازگر IS12، IS13 و IS16 با کمترین میزان PIC و درصد چندشکلی توانایی خوبی در جداسازی لاینها نداشتند.  Abou-Deif و همکاران (2013) با استفاده 8 آغازگر ISSR تعداد بیست ژنوتیپ گندم را مورد بررسی قرار دادند و متوسط درصد چندشکلی 8/84 درصد را گزارش نمودند (7) همچنین Deshmukh و همکاران (2012) کاربرد مارکرهای مولکولی، بویژه ISSR را در زمینه تعیین مقاومت به خشکی ژنوتیپهای گندم گزارش کرده اند (11). نتایج تجزیه تنوع ژنتیکی بر اساس مارکر مولکولی ISSR با نتایج حاصل از بررسیهای سیتوژنتیکی تطابق چندانی نداشت. اما بر اساس پرایمر­های مورد بررسی لاینهای H2، H3 و H7  به والد دهنده شباهت بیشتری داشته و می­توان بیان داشت که پرایمرهای استفاده شده در مطالعه حاضر بیشتر مناطقی از کروموزومهای H2، H3 و H7 را در جو تکثیر کردند. Jin-Kun و همکاران (2002) بر اساس مارکر ISSR ژنوتیپهای گندم را با روش تجزیه خوشه­ای گروه­بندی کرده و آنها را در چهار گروه قرار دادند و بیان داشتند که می­توان با استفاده از مارکر ISSR تفاوت را در بین کولتیوارهای گندم مشخص نمود (19). از طرف دیگر لاینهای H4، H5 و H6 بیشتر به والد گیرنده شبیه بودند و بنابراین می­توان بیان داشت که مناطق تکثیری توسط آغازگرهای مورد استفاده برای مارکر ISSR کمتر بر روی کروموزومهای H4، آ5 و H6 قرار داشتند. نکته جالب توجه لاین H1 بود که بر اساس دو روش مطالعه شده (سیتوژنتیک و مارکر) فاصله بالایی با والد دهنده و گیرنده داشت. این امر بیانگر مطلبی بود که قبلاً نیز به آن اشاره شد و آن این است که کروموزومهای افزایشی بر اساس پرایمرهای مورد بررسی در زمینه ژنتیکی والد گیرنده تغییرات بالایی ایجاد نکردند. Sofalian و همکاران (2009) 27 ژنوتیپ گندم را با 15 آغازگر ISSR مورد مطالعه قرار دادند که نتایج حاصل از تجزیه خوشه­ای بر اساس روش UPGMA ژنوتیپها را در سه گروه اصلی قرار داد و نشان داد که نشانگرهای ISSR می­توانند تغییرات ژنتیکی ژرم­پلاسم گندم را به خوبی نشان دهند (27). اسماعیلی و همکاران (1396) نشانگرهای مولکولی نیمه تصادفی را ابزار مفیدی جهت بررسی گندم دیم معرفی نمودند (2).

1- اخوان، آ.، سعیدی، ح. ا.، 1389. بررسی روابط و تنوع درون گونه­ای L.  Hordeum vulgare( جو زراعی و خودرو) در ایران با استفاده از داده­های سیتولوژی. تاکسونومی و بیوسیستماتیک، 2: 47-58.

2- اسماعیلی، ا.، نظریان فیروزآبادی، ف.، سمیعی، ک.، دریکوند، ر.، 1396. بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای گندم دیم با استفاده ازآغازگرهای نیمه تصادفی اینترونی-اگزونی. مجله پژوهش های سلولی مولکولی (مجله زیست شناسی ایران).30 (2): 117-126.

3- بخشی­خانیکی، غ. ر.، 1384. سیتوژنتیک گیاهی. ترجمه، سینگ، آر. جی.، انتشارات دانشگاه پیام­نور، تهران.

4- صبوری، ح.،  تقی زاده، ز.، حسینی مقدم، ح.،  فلاحی، ح ع.، کاتوزی، م.،1396. اهمیت کروموزوم 4 در کنترل ژنتیکی صفات مرتبط با سنبله در جو. مجله پژوهش های سلولی مولکولی (مجله زیست شناسی ایران). پذیرفته شده. انتشار آنلاین از تاریخ 22 آبان 1396.

5- موسوی، س. ص.، هوشمند، س.، محمدی، ش.، خدامباشی، م.، 1389. تعیین کروموزوم­های حامل ژن­های کنترل­کننده ویژگی­های کمی مرتبط با تحمل به خشکی در گندم نان با استفاده از لاین­های جایگزین. مجله الکترونیک تولید گیاهان زراعی، 3: 97-114.

6- یزدان­ستا، س.، کریم­زاده، ق. و طهماسبی سروستانی، ز. ع.، 1383. بررسی کاریوتیپی برخی از ژنوتیپهای جو بدون پوشینه .(Hordeum vulgare L.) مجله علوم کشاورزی ایران، 4: 827-837.

 

7- Abou-Deif, M H., Rashed, M A., Sallam, M A A., Mostafa, E A H., Ramadan, W A. (2013). Characterization of Twenty Wheat Varieties by ISSR Markers. Middle-East Journal of Scientific Research, 15: 168-175.

8- Bass, H W., Riera-Lizarazu, O., Ananiev, E V., Bordoli, S J., Rines, H W., Phillips, R L., Sedat, J. W., Agard, D A., Cande, W. Z. (2000). Evidence the coincident initiation of homolog pairing and synapsis during telomere-clustering (bouquet) stage of meiotic prophase. J Cell Sci, 113: 1033-1042.

9- Bushuk, W., Rasper, V.F. (1994). Wheat proudaction, properties and quality. BlakieAcademicand professional an imprint Chapman and Hall.287-310pp

10- Cho, S., Garvin, D. F., Muehlbauer, G. J. (2004). Barley Gene Expression in wheat-Barley Chromosome Addition Lines and Transcriptome-Based Physical Mapping of Barley Genes. International Triticeae Mapping Initiative Workshop. Abstract, No. 18.

11- Deshmukh, R., Tomar, N. S., Tripathi, N., Tiwan, S. (2012). Identification of RAPD and ISSR markers for drought tolerance in wheat (Triticum aestivum L.). Physiol. Mol. Biol. Plants, 18: 101-104.

12- Doyle, J J., Doyle, J. L. (1987). A rapd DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem bull. 19: 11-15.

13- Ellis, R P., Forster, B. P., Robinson, D., Handley, L. L., Gordon, D. C., Russell, J. R., Powell, W. (2000). Wild barley: a source of genes for crop improvement in the 21st century. J. Experimental Botany, 51: 9-17.

14- Evans, L. E., Jenkins, B. C. (1960). Individual Secale cereale chromosome additions to Triticum aestivum. I. The addition of individual "Dakold" fall rye chromosomes to "Kharkov" winter wheat and their subsequent identification. Can J Genet Cytol,2: 205-215.

15- Gupta, P K. (1970). Variability in the Morphology of Rye {Secale cereale) Chromosomes when placed in Wheat {Triticiim aesti-vum) Background. Phyton, 14: 9-13.

16- Hayes, P M. (1992). Economic trait loci (quantitative trait loci- QTL) analysis progress report. North American Barley Genome Mapping project (NABGMP). Barley Genetics Newsletter, 21: 30-31.

17- Heyne, E C. (1987). Wheat and wheat improvement. America Society of Agronomy ING. Madison. Wisconsin USA.

18- Jin, W., Melo, T. R., Nagaki, K., Talbert, P. B., Henikoff, S., Dawe, R. K., Jiang, J. (2004). Maize Centromeres: Organization and Functional Adaptation in the Genetic Background of Oat.The Plant Cell, 16: 571-581.

19- Jin-Kun, D., Ying-Yin, O., Zhong-Fu, N., Hui-Ru, P., Qi-Xin, S. (2002). Genetic Diversity Revealed by ISSR Molecular Marker in Common Wheat,Spelt,Compactum and Progeny of Recurrent Selection. J.G. G., 29: 445-452.

20- Kunzel, G. (1976). Indications for a necessary revision of the barley karyogramme by use of translocations. In: Barley Genetics IV, eds. M. J. C. Asher, R. P. Ellis, A. M. Hayter and R. N. H. Whitehouse; pp. 275-281. Edinb. Univ. Press.

21- Levan, A., Fredga, K., Sandbery, A. (1964). Nomencleature for centromeric position on chromosome. Heriditas, 52:201-220.

22- Mahmood, A. and Quarrie, S. A. (1993). Effects of salinity on growth, ionic relations and physiological traits of wheat, disomic addition lines from Thinopyrum bessarabicum, and two amphiploids. Plan Breeding, 110: 265-276.

23- Muehlbauer, G. J., Riera-Lizarazu, O., Kynast, R. G., Martin, D., Phillips, R. L., Rines, H. W. (2000). A maize-chromosome 3 addition line of oat exhibits expression of the maize homeobox gene liguleless3 and alterations of cell fate. Genome, 43: 1055-1064.

24- O'Mara, J. G. (1940). Cytogenetic studies on Triticale. I. A method for determining the effects of individual Secale chromosomes on Triticum. Genetics, 25: 401-408.

25- Powell, W., Morgante, M., Andre, C., Hanafey, M., Vogel, J., Tingey, S., Rafalski A. (1996). The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Molecular Breeding, 2: 225-238.

26- Riley, R., Chapman, V. (1958). The production and phenotypes of wheat-rye chromosome addition lines. Heredity, 12: 301-315.

27- Sofalian, O., Chaparzadeh, N., Dolati, M. (2009). Genetic diversity in spring wheat landraces from northwest of Iran assessed by ISSR markers. Not. Bot. Hort. Agrobot., 37: 252-256.

28- Szakacs, E., Molnar-Lang, M. (2010). Molecular cytogenetic evaluation of chromosome instability in Triticum aestivum–Secale cereale disomic addition lines. J. Appl. Genet., 51: 149-152.

29- Tjio, J H., Hagberg, A. (1951). Cytological studies of some x-ray mutants of barley. An Estacion Experimental. Aula. Dei., 2: 149-167.

30- Tuleen, N. A. (1973). Karyotype analysis of multiple translocation stocks of barley. Can. J. Genet. Cytol. 15:267-273.

31- Vahidy, A A., Bushreen, J. (1995). Intervarietal polymorphism of constitutive heterochromatin in Hordeum vulgare L. Pak. J. Bot., 27: 417-423.