غربالگری جدایه‌های هالوتولرانت مقاوم به فلزات سنگین و تولیدکننده پپتیدهای غیرریبوزومی

فاطمه شهرستانی¹، شمس‌الضحی ابوالمعالی^2* و شکیبا درویش علیپور آستانه¹

¹ ایران، سمنان، دانشگاه سمنان، گروه زیست‌فناوری

² ایران، سمنان، دانشگاه سمنان، گروه زیست‌شناسی

تاریخ دریافت: 14/7/96                تاریخ پذیرش: 16/11/96

چکیده

امروزه، بشر برای حل مشکلات صنایع دارویی، غذایی و شیمیایی، به سمت طبیعت و ترکیبات فعال زیستی روی آورده است. از جمله منابع این ترکیبات، متابولیتهای ثانویه تولید شده توسط میکروارگانیسمهایی است که از مناطق بسیار سخت جداسازی شده اند. هدف از این مطالعه، بررسی سویه‌های هالوتولرانت‌ جدا شده از دریاچه حاج‌علی‌قلی‌خان با قابلیتهای تولید متابولیتهای ثانویه است. میکروارگانیسمهای نمک‌دوست و تحمل‌کننده نمک مقاوم به نیکل، کادمیم، مس و کبالت از دریاچه حاج‌علی‌قلی‌خان جدا شدند. توانایی ژنتیکی این جدایه‌ها برای تولید متابولیتهای ثانویه، با استفاده از تکثیر ژنهای nrpS با آغازگرهای اختصاصی NS1/NS2، A3/A7 ارزیابی گردید. از غربال‌گری میکروارگانیسمهای دریاچه نمک به ترتیب 13 ، 5/19 ، 75/43  و 7/3 درصد جدایه‌ها از محیطهای کشت MGM، MH ، SWN  LNSWNو 62/20 درصد از جدایه‌ها از محیط بدون نمک نوترینت آگار به دست آمد. سنجش مقاومت به فلزات در جدایه‌های غربال شده از دریاچه نشان داد که بیشترین فراوانی جدایه‌ها در مقاومت به نیکل و حساسیت به فلز کادمیم است. نتایج تکثیر ژنهای nrpS در جدایه‌های هالوتولرانت مقاوم به فلزات با دو جفت آغازگرهای اختصاصی 3 تا 7 قطعه DNA را نشان داد. حضور ژنnrpS در بین میکروارگانیسمهای نمک دوست نسبی و تحمل کننده نمک، ارتباط مستقیم بین مقاومت به فلزات سنگین و توانایی ژنتیکی تولید متابولیتهای ثانویه را نشان می دهد.

واژه های کلیدی: فلزات سنگین، کادمیم، نیکل، هالوتولرانت، nrpS

* نویسنده مسئول، تلفن: 02331533197 ، پست الکترونیکی: s_abolmaali@semnan.ac.ir

مقدمه

امروزه افزایش تولید پسابهای کارخانجات و فاضلابهای شهری سبب رهاسازی ترکیبات آلی و معدنی، آلودگی آب و خاک شده است. از طرف دیگر فرآیندهای طبیعی مانند سیل، زلزله، آتشفشان نیز به این آلودگی افزوده است. با توسعه فناوریها، اخیراً فلزات سنگین مس، کبالت، نیکل، کادمیم، روی و سرب به عنوان مهم‌ترین آلاینده‌های پساب شناخته شده‌اند که با روند متعارف تصفیه فاضلاب قابل حذف نمی‌باشند(21). انباشت فلزات سنگین در گیاهان حاصل از خاکهای آلوده، هشدار دهنده‌ترین اثرات مضر فلزات بر سلامت انسان است (3 و 5). علی رغم سمیت فلزات سنگین برای اعصاب، کبد، استخوان برخی از این فلزات تا سطوح معینی برای رشد میکروارگانیسمها ضروری بوده و در مقادیر بالاتر از آن برای سلول سمی می‌باشند. کبالت، مس، نیکل و روی در تنظیم بیان ژن و فعالیت زیست ‌مولکولها،آنزیمها یا کوفاکتورهای آنزیم، نقش حیاتی دارند(19).

در چند دهه اخیر حذف فلزات سمی از فاضلابهای صنعتی به روشهای فیزیکی و شیمیایی تصفیه آب، اکسیداسیون و احیاء، رسوب شیمیایی، فیلتراسیون، روش الکتروشیمیایی، تبخیر، تبادل یونی و اسمز معکوس صورت گرفته است. نیاز به محلولهای قوی و حذف یونهای فلزی غیر قابل پیش‌بینی، برخی از معایب این روشها هستند. علاوه بر این، استفاده از محلولهای قوی برای پاکسازی فلزات سنگین، باعث آلودگی ثانویه محیط زیست می‌گردد(13). زیست پالایی با کمک میکروارگانیسمها می‌تواند به طور مؤثری باعث کاهش فلزات سنگین در محیط زیست گردد(15). توانایی میکروارگانیسمها برای حذف فلزات سنگین از محلولهای آبی، به ویژه در محدوده کمتر از 1 تا 100 میلی گرم، روش زیست‌پالایی را از دیگر روشهای پالایش متمایز می‌نماید(2). در دهه ‌اخیر، تحقیقات زیادی بر روی معرفی میکروارگانیسمهای توانا با توجه به دو ویژگی زیست‌پالایی و زیست‌سازگاری انجام گرفته و با توجه به همین خصوصیت مطالعات بسیاری برروی میانکنش میکروارگانیسمها با فلزات سمی در حال انجام است(19). در سال 2014 محمدزاده و همکاران در یک مطالعه توصیفی، از خاک آلوده به لجن فاضلاب مزارع مجاور تصفیه‌خانه غرب اهواز نمونه برداری کرده و باکتریهای مقاوم به کادمیم و نیکل را جداسازی و میزان تجمع زیستی و جذب زیستی نیکل و کادمیم توسط این باکتریها را مورد مطالعه قراردادند (18). در این مطالعه باکتریهای جداسازی شده به جنسهای Bacillus، Staphylococcus وActinomyceteتعلق داشتند که از این میان Actinomycete بیشترین مقدار تجمع زیستی را برای هر دو فلز نشان داد. در غلظتهای کمتر، مقدار تجمع زیستی کادمیم و نیکل بیشتر از جذب زیستی و در سطوح آلودگی بالا مقدار جذب زیستی بیشتر بود. در هر دو روش زیست پالایی، باکتریها توانایی بیشتری برای پالایش کادمیم نسبت به نیکل نشان دادند(18).

با توجه به اینکه میکروارگانیسمها تنوع زیادی در واکنشهای متابولیکی دارند مسیرهای متابولیت ثانویه و فراورده‌های تولید شده در میکروارگانیسمها، آنها را برای سازگاری در زیستگاههای اکولوژیکی متنوع و مقابله با تنشهای محیطی آماده می‌کند که این امر می‌تواند از جنبه‌های صنعتی مورد توجه قرار گیرد(5). در این موارد، اساسی‌ترین فرآیندی که سلولها در مقابله با فلزات سنگین به کار می‌برند تا به زیست‌پالایی بینجامد، هم بند کردن این کاتیونها با گروههای عاملی در سطح سلول و نیز هم بند کردن با پروتئینهای خاصی در درون سلول می‌باشد. اما تنوع ترکیبات و فلزات سمی از یک سو و تنوع میکروارگانیسمها از سوی دیگر باعث می‌شود که به روشهای دیگری نیز برای مقابله با فلزات و ترکیبات سمی در سلول توجه شود(8 و 17).

پپتیدهای پلی کتاید و پپتیدهای غیرریبوزمی دو دسته مهم از متابولیتهای ثانویه‌ای باکتریایی هستند که در تولید فراورده‌های بیولوژیک در میکروارگانیسم و تحمل شرایط سخت محیطی نقش مهمی ایفاء می‌کنند. این دسته از پپتیدها با ساختار متنوع که حاصل فعالیتهای آنزیمهای دستجات ژنیnrpS هستند، توانایی ترکیب با فلزات سنگین را دارند(9). آنزیمهای nrpS ترکیبات چند آنزیمی هستند که پروتئینهای اختصاصی با طیف گسترده فعالیتهای زیستی را از پپتیدهایی با ساختارهای متفاوت و وزن مولکولی کم، به روشی مستقل از نوکلئیک اسید می‌سازند. در این سازوکار غیرریبوزومی ساخت پپتید، ترکیباتی مانند لیپوپپتیدها، دپسی‌پپتیدها و پپتیدولاکتونها از پیش‌سازهایی شامل: اسیدهای چرب، آمینواسیدهای غیرپروتئینوژنیک، هیدروکسی آمینواسیدها، آمینواسیدها با نیتروژن متیله شده، شبه آمینواسیدها و D-آمینواسیدها ترکیب بندی می‌گردند(23). هدف از این مطالعه بررسی توانایی میکروارگانیسمهای مقاوم به فلزات سنگین نیکل، کبالت، کادمیم و مس غربال شده از دریاچه نمک حاج‌علی‌قلی‌خان برای تولید محصولات ژنهای nrpS بود. در این مطالعه میکروارگانیسمهای مقاوم به فلزات سنگین با توانایی تولید محصولات ژنهای nrpS معرفی شدند.‌

مواد و روشها

نمونه‌برداری: نمونه‌برداری از نواحی مختلف جنوب غربی دریاچه نمک حاج‌علی‌قلی‌خان سمنان (موقعیت جغرافیایی N3550 تا N3600 و E5426 تا E5454) به صورت تصادفی انجام گرفت. نمونه‌ها شامل خاک، آب و نمک دریاچه بود که در محل نمونه‌برداری کدگذاری و در شرایط استریل به آزمایشگاه منتقل و برای کشت آماده شدند.

جداسازی میکروارگانیسمها: از نمونه‌های خاک و نمک، 1 گرم به 10 میلی‌لیتر سرم فیزیولوژی و از نمونه آب دریاچه 1 میلی‌لیتر به 9 میلی‌لیتر سرم فیزیولوژی اضافه شد.  نمونه‌های خاک، آب و نمک، در سری رقت های شامل ^1- 10، ^2- 10، ^3- 10  هریک به صورت جداگانه به مدت دو ساعت در 200 دور در دقیقه گرماگذاری گردید. از مایع رویی آنها در محیط کشت نوترینت براث ­(مرک) با 3، 7، 10، 15 و 20 درصد کلرید سدیم (مرک) و محیطهای کشت (SWN) Sea water  Nutrient Agar  (10)، (MH ) Moderate  halophilic medium  (16)، (LNSWN) Low nutrient Modified halophilic medium ، MGM) ) Medium Modified Growth (24) به ترتیب با 2، 2،10 و 23 درصد کلرید سدیم کشت انجام و در فواصل زمانی 24 ساعت، 72 ساعت و 14 روز پس از انجام کشت اولیه، با روش کشت چهار مرحله‌ای، جداسازی و خالص شدند. جدایه‌های خالص شده درگلیسرول 20 درصد و در فریزر 70- درجه سلسیوس نگهداری شدند.

شناسایی جدایه‌ها بر اساس ویژگیهای ریخت شناسی و بیوشیمیایی: بعد از خالص‌سازی میکروارگانیسمها، شناسایی هر یک از آنها برروی محیط کشت‌ جداسازی شده، بر‌ اساس ویژگیهای ماکروسکوپی شامل اندازه کلنی، شکل ظاهری، رنگ، سطح، حاشیه و جنس کلنی انجام گرفت. در مرحله بعد شناسایی بر اساس ویژگیهای میکروسکوپی شامل شکل میکروارگانیسم (میله‌ای، کروی، مارپیچی)، اندازه، نحوه قرار گرفتن میکروارگانیسمها در روی لام (مجتمع یا پراکنده وشکل اجتماع آنها)، نوع واکنش به رنگ‌آمیزی گرم، وجود اسپور، محل و شکل اسپور انجام شد. با آزمونهای حرکت، کاتالاز و اکسیداز، برخی از ویژگیهای بیوشیمیایی جدایه‌ها تعیین گردید. در بررسی فعالیت کاتالازی جدایه‌ها، از پراکسید هیدروژن 3 درصد و کشت جامد تازه میکروارگانیسم و برای بررسی فعالیت اکسیدازی، از محلول 1 درصد تترامتیل پارافنیلن دی‌آمین دی‌هیدروکلراید استفاده شد(10).

غربال‌گری بر اساس میزان تحمل نمک کلرید سدیم: برای تعیین هالوفیل یا هالوتولرانت بودن میکروارگانیسمها، هر یک از جدایه‌ها بر روی محیط با درصد کلرید سدیم کمتر یا بیشتر نسبت به محیط جداسازی خود، کشت شدند؛ بدین‌‌ترتیب که جدایه‌های حاصل از محیط MGM (23 درصد کلرید سدیم) روی محیط SWN (2 درصد کلرید سدیم) و برعکس و جدایه‌های حاصل از محیط MH (10 درصد کلرید سدیم) روی هر دو محیط مذکور کشت گردیدند.

غربالگری بر اساس مقاومت به فلز با روشهای لکه‌گذاری در محیط جامد و میکروپلیت: میکروارگانیسمهای مقاوم به 10 درصد تا 23 درصد کلرید سدیم (21 جدایه حاصل از جداسازی از محیط کشتهای MGM و MH) به منظور بررسی مقاومت به فلزات سنگین،  NiSO₄. 6H2O, CdCl₂. H₂O, CoSO₄. 7H₂O, CuSO₄. 5H₂O  انتخاب گردیدند.

برای سنجش مقاومت جدایه‌ها به فلزات با روش لکه‌گذاری، (1) محیط کشت MH حاوی  فلزات نیکل، مس، کبالت و کادمیم،  با غلظتهای  5/0، 1، 2، 3، 5 ،7  و صفر میلی مولار تهیه شد. سپس با استفاده از رقتهای ^3-10و  ^6-10 نیم مک‌فارلند  هر باکتری  در محیط MH  لکه‌گذاری به صورت نقطه‌ای انجام گرفت. پلیتها به مدت 36 ساعت در دمای 37 درجه سلیسیوس گرماگذاری شدند.

در روش (2) در هر چاهک از میکروپلیت، 200 میکرولیتر محیط کشت MH حاوی غلظتهای mM 5/0، 1، 12/3، 25/6، 5/12، 25، 50  اضافه گردید. 20 میکرولیتررقت
^1-10 از OD نیم مک‌فارلند جدایه‌های حاصل از محیط کشت MGM و محیط کشت MH ، به محیط مایع تلقیح شدند. در این روش، فلز و محیط کشت بدون میکروارگانیسم، به عنوان شاهد منفی و محیط کشت حاوی میکروارگانیسم بدون فلز به عنوان شاهد مثبت در نظر گرفته شدند. میکروپلیتها حاوی هر جدایه به مدت 36 ساعت در دمای 37 درجه سلیسیوس گرماگذاری شدند(1).

استخراج DNAژنومی و بررسی وجود ژن nrpS به روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز: استخراج DNA از جدایه‌ها با استفاده از کیت DNP TM KIT از شرکت سیناژن طبق روش ارائه شده در کیت انجام شد.   DNA   استخراج شده با تیمارRNAse A   خالص گردید. بررسی وجود ژن nrpS به وسیله واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و با کمک آغازگرهای اختصاصی (جدول1) انجام شد. اجزا واکنش شامل 1 نانوگرمDNA  الگو، بافر 1X،mM  (2-5/1) MgCl₂،  mM (25/0) dNTP،mM  25/0 از هر پرایمر (جدول 1) و 1 واحد آنزیم Taq Polymerase درحجم نهایی 25 میکرولیتر بود. واسرشتگی اولیه در دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه با کمک دستگاه ترموسایکلر مدلLabcycler (SensoQuesT)  انجام شد. تکثیر در 35 چرخه شامل: واسرشتگی در دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، جفت‌شدگی در دمای 56-45 درجه سانتی گراد به مدت 40 ثانیه و طویل سازی در دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت 1 دقیقه انجام گرفت. مرحله طویل شدن نهایی نیز در دمـای 72 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه انـجـام شد .در نـهایـت مـحصـول واکنش زنجیره‌ای پلیمراز به روش الکتروفورز با استفاده از ژل آگارز 8/0 درصد بررسی گردید. شرایط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با کمک غلظتهای متفاوت MgCl₂ شامل 5/1، 8/1 و 2 میلی مولار و دماهای جفت شدگی 47، 51، 53، 55، 57 درجه سانتی گراد در هر مورد بهینه‌سازی گردید.

جدول 1- مشخصات پرایمر مورد استفاده

آنالیز داده‌ها: تجزیه وتحلیل آماری، نتایج این پژوهش با کمک نرم افزار SPSS22 انجام گرفته و میزان 05/0 >  p به عنوان تفاوت آماری معنی دار در نظر گرفته شد.

نتایج

جداسازی میکروارگانیسمها: از محیط کشت MGM، 20 جدایه؛ MH، 31 جدایه؛SWN ،  70 جدایه؛LNSWN ، 6 جدایه و NA بدون کلریدسدیم 33 جدایه خالص سازی گردید. زمان رشد میکروارگانیسمها در محیطهای SWN،LNSWN  و NA 1-2 روز، در محیط MH بین 2-3 روز و در محیط MGM بین 2 تا 10 روز بود.

مشاهدات ماکروسکوپی جدایه‌های غربال شده نشان داد که کلنیها رنگهای بی‌رنگ، شیری، مایل به قهوه‌ای و صورتی مایل به قرمز داشتند. پیگمان قرمز اغلب در جدایه های حاصل از محیط MGM مشاهده شده است و اندازه کلنیها از بسیار کوچک (با قطر حدود 1 میلی‌متر) تا بزرگ (قطر حدود 1 سانتیمتر) متغیر بود. شکل کلنیها به صورت دایره‌ای با حاشیه منظم/ غیرمنظم، ریزوئیدی/ جوانه­دار، سطوح کلنی برجسته صاف/ چروکیده، سطوح فرورفته بود. قوام کلنی‍ها حالتهای متفاوت جامد، سفت، لزج وکشسان داشت.

ویژگیهای ریخت‌شناسی جدایه‌ها: براساس نتایج بررسیهای میکروسکوپی حدود 90 درصد جدایه‌ها باسیل گرم مثبت و 10 درصد باقیمانده شامل باسیلهای گرم منفی، کوکسی‍های گرم مثبت، گرم منفی و Actinomycete بودند. حدود 5 درصد جدایه‌ها دارای اسپور (مرکزی، انتهایی و نیم انتها) با اندازه بزرگ‌تر از سلول و برخی نیز هم‌اندازه سلول بودند.

20 درصد سویه‌های جدا شده از محیط کشت MGM، کاتالاز منفی و 80 درصد کاتالاز مثبت بودند. همه میکروارگانیسم‍های جدا شده از محیط کشت MH کاتالاز مثبت بودند. 10 درصد سویه‌های جدا شده از محیط کشت MGM، با افزودن محلول آزمون اکسیداز، تغییر رنگ نشان ندادند.80 درصد سویه­ها تغییر رنگ شدید به بنفش را نشان دادند (اکسیداز قوی) و در 10 درصد دیگر، رنگ کلنیها کمی مایل به بنفش دیده شد (اکسیداز ضعیف). در مورد سویه‌های جدا شده از محیط کشت MH، 42 درصدمیکروارگانیسمها در پاسخ به معرف اکسیداز تغییر رنگ ندادند (اکسیداز منفی)، 6 درصد سویه‌ها دارای اکسیداز قوی و در 52 درصد رنگ کلنی‍ها کمی مایل به بنفش شد (اکسیدازمثبت).

بررسی مقاومت به فلز جدایه ها: در سنجش مقاومت به فلز تمامی جدایه‌های محیط  MGM که ازنظر مورفولوژی وخصوصیت بیوشیمیایی یکسان نبودند، بررسی شدند. نتایج نشان داد که  در روش میکروپلیت،  بیشترین مقاومت را نسبت به فلز نیکل و بیشترین حساسیت را نسبت به فلز کادمیم نشان دادند. بیشترین غلظتی که میکروارگانیسمها در آن رشد کردند برای فلز نیکل mM 6 و برای فلزات کبالت، کادمیم و مس به ترتیب 3، 5/0 و mM 5/0 بود. همان‌طور که در تصویر 1 مشاهده می‌شود، در این روش تعداد میکروارگانیسمهایی که در غلظت mM 5/0 فلز مس رشد کردند بیشتر از کادمیم بود (تصویر1).

تصویر1- نتایج بررسی مقاومت به فلزات نیکل، کبالت، مس و کادمیم به روش میکروپلیت. جدایه‌ها حداکثر mM 6 فلز نیکل،  Mm3 فلز کبالت، mM 5/0 مس و کادمیم را تحمل کردند. برای وضوح بهتر تصویر شناسه جدایه‌ها فقط با شماره و بدون شاخص کلکسیون؛ DDBCC، نشان داده شده است.

بررسی مقاومت جدایه‌های هالوتولرانت نسبت به فلز نیکل با روش لکه­گذاری در محیط جامد نشان داد که 10 درصد جدایه­ها حداکثر 3میلی­مولار، 30 درصد جدایه­ها 2 میلی­مولار، 5 درصد جدایه­ها 1 میلی­مولار، 5 درصد جدایه­ها 5/0 میلی­مولار از فلز نیکل و 20 درصد جدایه‌ها هیچ غلظتی از فلز را تحمل نکردند. در بررسی مشابه نسبت به فلز کبالت، 25 درصد جدایه­ها غلطت 3 میلی‌مولار، 5 درصد جدایه‌ها غلظت 2 میلی‌مولار، 25 درصد جدایه‌ها غلظت 1 میلی‌مولار، 10 درصد جدایه غلظت 5/0 میلی­مولار، 5 درصد جدایه‌ها نسبت به فلز کبالت حساس بودند. این در حالی است که این جدایه‌ها نسبت به فلز کادمیم در هیچ غلظتی رشد نداشتند ولی نسبت به فلز مس، 25 درصد جدایه‌ها غلظت 2 میلی‌مولار، 25 درصد جدایه‌ها غلظت 1 میلی‌مولار، 20 درصد جدایه‌ها غلظت صفر را تحمل کردند و 30 درصد سویه‌ها عدم رشد را نشان دادند. نتیجه این آزمایش برای یک جدایه مقاوم به فلز نیکل، کبالت، مس و حساس به کادمیم و یک جدایه حساس به فلزات کبالت، مس و کادمیم و نسبتاً مقاوم به نیکل، در تصویر 2 نشان داده شده است. جدایه شماره 151 روی محیط کشت حاوی فلزات نیکل و کبالت تا حدود 3 میلی‌مولار رشد ضعیفی داشت. این جدایه حداکثر روی 2 میلی‌مولار مس رشد داشت اما قادر به رشد برروی محیط کشت حاوی کادمیم نبود. جدایه شماره 11 فقط برروی محیط حاوی 2 میلی‌مولار نیکل رشد کرد. رشدی از این جدایه برروی محیطهای دارای 5/0 و یا 1 میلی‌مولار کبالت، مس، کادمیم مشاهده نشد.

تصویر 2- نتایج غربالگری جدایه‌ها به روش لکه گذاری، (الف) جدایه 151 مقاوم نسبت به فلزات نیکل، کبالت و مس؛ (ب) جدایه11 نسبتاً مقاوم به نیکل و حساس به کبالت، مس و کادمیم.

نتایج بررسی وجود ژن nrpSبا استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز: تکثیر با کمک آغازگرهایNS1  و NS2 و دمای جفت شدگی 50 درجه سانتی گراد و غلظت منیزیم 2 میلی مولار، وجود قطعات ژنی با اندازه بین 400 تا 1500 جفت بازی را در جدایه‌های 5، 11، 130، 133، 138، 144و 151 نشان داد. در اغلب جدایه‌ها قطعه DNA بین800 تا 900 جفت بازی ظاهر گردید (تصویر 3).

تصویر3- نتایج تکثیر ژنهایnrpS : الف) با استفاده از جفت آغازگرهایA3/A7 ؛ ب) با استفاده از جفت آغازگرهای NS1/NS2.  مسیرها با شماره جدایه‌ها مشخص گردیده‌اند. مسیرM نردبان مولکولی bp50.