پژوهش‌های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)

ارزیابی تنوع ژنتیکی و گروه‌بندی لاین‌های ذرت (Zea mays L.)با استفاده از نشانگرهای ISSR

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه.

2 عضو هیات علمی دانشگاه ارومیه

3 گروه اصلاح نباتات دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس، تهران.

4 گروه زراعت و اصلاح نباتات دانشکده کشاورزی دانشگاه رازی کرمانشاه.

5 موسسه تحقیقات ثبت و گواهی بذر و نهال، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشا.رزی، کرج.

چکیده

از آنجا که تولید بذر هیبرید نیار به انتخاب و تلاقی لاین‌های خالص مطلوب دارد لذا شناسایی لاین‌هایی با خصوصیات ژنتیکی مناسب یکی از اهداف اصلاح‌گران گیاه می‌باشد. در این مطالعه از نشانگر ISSR (Inter-simple sequence repeat) به منظور ارزیابی تنوع ژنتیکی 100 لاین خالص ذرت استفاده شد. 16 آغازگر مورد استفاده، 81 مکان ژنی را تکثیر کردند که از بین آن‌ها 78 مکان ژنی (% 12/95) چندشکل بودند. آغازگرهای UBC825 و UBC811 به ترتیب بیشترین (8 مکان) و کمترین (2 مکان) تعداد مکان چندشکل را تولید نمودند. مقادیر میزان اطلاعات چندشکل (polymorphic information content) (PIC) از 152/0 (آغازگر UBC867) تا 365/0 (آغازگر A12) متغیر بود و میانگین آن 213/0 به‌دست آمد. تجزیه خوشه ای بر اساس ضریب تشابه Jaccard و الگوریتم Complete linkage لاین‌های مورد بررسی را در 3 گروه اصلی قرار داد. تجزیه واریانس مولکولی با استفاده از نشانگرهای ISSR نشان داد که 9 درصد تنوع به تنوع بین گروهی و 91 درصد به تنوع درون گروهی مربوط می‌شود. نتایج حاصل نشان داد که نشانگرهای ISSR قادرند چندشکلی بالایی را نشان دهند و از این‌رو ابزار مفیدی برای انگشت نگاری و دسته‌بندی ژنوتیپ‌های ذرت در گروه‌های مختلف به‌شمار می‌روند. از این ویژگی می‌توان در تعیین گروه‌های هتروتیک و پیش‌بینی هتروزیس در تولید بذر ذرت هیبرید استفاده نمود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Assessment of genetic diversity and grouping of maize lines (Zea mays L.) using ISSR markers

نویسندگان [English]

  • Ali Ghafari Azar 1
  • Reza Darvishzadeh 2
  • Zahra Aghaali 3
  • Danial Kahrizi 4
  • Babak Darvishi 5

1 Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Urmia University, Urmia, Iran.

2 Urmia university

3 Dept. of Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran

4 Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, University of Razi, Kermanshah, Iran

5 Seed and Plant Certification and Registration Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran.

چکیده [English]

Since the production of maize hybrids needs to selection and crossing of desirable inbred lines, identification of lines with suitable genetic characteristics is one of the objectives of plant breeders. In this study, ISSR markers were used to assess genetic diversity in 100 inbred lines of maize. Sixteen primers amplified 81 loci, of which 78 (95.12 %) were polymorphic. The maximum and minimum number of polymorphic bands were produced by UBC825 (8 loci) and UBC811 (2 loci) primers, respectively. The polymorphic information content (PIC) ranged from 0.65 (UBC849) to 0.93 (443), with an average of 0.77. Cluster analysis based on Jaccard’s similarity coefficient and complete linkage algorithm categorized the studied lines into 3 main clusters. The analysis of molecular variance using ISSR data showed that 9% of the variation was explained by the variation among population and 91% by the variation within population. The results showed that the ISSR markers capable to display a high degree of polymorphism among lines and are useful tools for fingerprinting and categorizing of maize genotypes into different groups. This feature can be used in determining heterotic groups and prediction of heterosis in maize hybrid production.

کلیدواژه‌ها [English]

  • AMOVA
  • Genetic diversity
  • ISSR marker
  • maize

ارزیابی تنوع ژنتیکی و گروه بندی لاینهای ذرت  (Zea mays L.)با استفاده از

نشانگرهای ISSR

علی غفاری آذر1، رضا درویش زاده1،2*، زهرا آقاعلی3، دانیال کهریزی4 و بابک درویشی5

1 ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی

2 ارومیه، دانشگاه ارومیه، پژوهشکده زیست فناوری

3 تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح نباتات

4 کرمانشاه، دانشگاه رازی، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات

5 کرج، سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی، مؤسسه تحقیقات ثبت و گواهی بذر

تاریخ دریافت: 30/5/96                تاریخ پذیرش: 16/11/96

چکیده

از آنجا که تولید بذر هیبرید نیار به انتخاب و تلاقی لاینهای خالص مطلوب دارد لذا شناسایی لاینهایی با خصوصیات ژنتیکی مناسب یکی از اهداف اصلاح­گران گیاه می­باشد. در این مطالعه از نشانگر ISSR (Inter-simple sequence repeat) به منظور ارزیابی تنوع ژنتیکی 100 لاین خالص ذرت استفاده شد. 16 آغازگر مورد استفاده، 81 مکان ژنی را تکثیر کردند که از بین آنها 78 مکان ژنی (12/95 درصد) چندشکل بودند. آغازگرهای UBC825 و UBC811 به ترتیب بیشترین 8 و کمترین 2 تعداد مکان چندشکل را تولید نمودند. مقادیر میزان اطلاعات چندشکل(Polymorphic information content) (PIC) از 152/0 (آغازگر UBC867) تا 365/0 (آغازگر A12) متغیر بود و میانگین آن 213/0به دست آمد. تجزیه خوشه ای بر اساس ضریب تشابه Jaccard و الگوریتم پیوستگی کامل (Complete linkage) لاینهای مورد بررسی را در 3 گروه اصلی قرار داد. تجزیه واریانس مولکولی با استفاده از نشانگرهای ISSR نشان داد که 9 درصد تنوع به تنوع بین گروهی و 91 درصد به تنوع درون گروهی مربوط می‌شود. نتایج حاصل نشان داد که نشانگرهای ISSR قادرند چندشکلی بالایی را نشان دهند و از این­رو ابزار مفیدی برای انگشت نگاری و دسته­بندی ژنوتیپهای ذرت در گروههای مختلف به شمار می­روند. از این ویژگی می­توان در تعیین گروههای هتروتیک و پیش­بینی هتروزیس در تولید بذر ذرت هیبرید استفاده نمود.

واژه های کلیدی: تنوع ژنتیکی، ذرت، نشانگر ISSR، AMOVA

* نویسنده مسئول، تلفن: 09149734458، پست الکترونیکی: r.darvishzadeh@urmia.ac.ir

مقدمه

 

ذرت (Zea mays L.) گیاهی تک لپه و یکساله، از خانواده گرامینه و قبیله Maydeae می­باشد. این گیاه دیپلوئید بوده و تعداد کروموزومهای آن 10 جفت (20n=2) می باشد (14). منشأ اولیه ذرت، آمریکای مرکزی است و اگرچه این گیاه با اقلیم گرم سازش دارد ولی به دلیل عملکرد بالقوه بالا و تنوع فرآورده­های حاصل از آن و نیز با توجه به قدرت سازگاری با شرایط اقلیمی گوناگون، بسیار زود در سراسر دنیا گسترش یافت و مکان سوم را پس از گندم و برنج از نظر سطح زیرکشت، میزان تولید و عملکرد در واحد سطح به خود اختصاص داد (29). ذرت سرشار از انواع مواد مغذی، ویتامینها و مواد معدنی است که منجر به پیشگیری از ابتلاء به بیماریهایی چون: دیابت، بیماریهای قلبی، بیماریهای گوارشی و سرطان می‌شود (30). ذرت مانند سیب‌زمینی یکی از گیاهان نشاسته‌ای می‌باشد و در بسیاری از کشورها یکی از منابع اصلی تأمین کننده نیازهای غذایی است. اهمیت ارزیابی تنوع ژنتیکی در تولید ارقام جدید سازگار با شرایط محیطی متفاوت و دیگر برنامه­های اصلاحی غیر قابل انکار است. در ذرت، ارزیابی تنوع ژنتیکی برای تولید لاینهای خالص متنوع و توسعه هیبریدهای قوی یک نیاز اساسی به شمار می­آید، و همچنین برای بهبود ژرم پلاسم و توسعه ارقام سنتتیک ذرت با استفاده از ژنهای پیوسته با صفات مطلوب از جمله تحمل به تنشهای زیستی و غیر زیستی از اهمیت بالایی برخوردار می­باشد (18). ارزیابی تنوع ژنتیکی و گروه بندی افراد می تواند بر پایه نشانگرهای مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی DNA انجام گیرد (18 و 31). نشانگرهای مولکولی DNA به دلیل عدم تاثیر پذیری از شرایط محیطی، اثرات پلیوتروپی و اپیستازی، وراثت پذیری و فراوانی بالا ابزار مؤثری می­باشند (3).

بین توالیهای تکراری ساده (ISSR) نواحی در ژنوم هستند که توسط توالیهای ریز ماهواره احاطه شده­اند. نشانگرهای ISSR به علت استفاده آسان، هزینه پایین، تکرار پذیری خوب، عدم نیاز به توالی یابی DNA، توزیع تصادفی، گستردگی، پوشش ژنومی بالا و چند شکلی بالا از نشانگرهای مولکولی پرکاربرد در مطالعات انگشت نگاری ژنومی، تنوع ژنتیکی، تجزیه­های فیلوژنتیکی و نقشه­یابی ژنومی هستند (7، 9 و 25). تاکنون مطالعات گسترده­ای برای ارزیابی تنوع ژنتیکی جمعیتها (12) و لاینهای خالص ذرت (13) انجام شده است. محمد و همکاران (2017) در مطالعه تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای ذرت بر اساس نشانگرهای ISSR گزارش کردند که نشانگرهای مورد استفاده به خوبی می­توانند ژنوتیپهای مورد نظر را از یکدیگر متمایز نمایند (20). الصادیق ایدریس و همکاران (2012) به منظور مطالعه تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای ذرت از نشانگرهای ISSR استفاده نمودند. نشانگرهای مورد نظر توانستند سطح بالایی از چندشکلی (69 درصد) را در بین ژنوتیپهای مورد مطالعه آشکار نمایند (15). نتایج حاصل از ارزیابی تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای ذرت بومی برزیل نیز نشان داد که نشانگرهای ISSR ابزار مناسبی جهت شناسایی تنوع موجود در ژنوتیپهای مورد بررسی می­باشند (5).

مطالعه تنوع ژنتیکی در ذرت به چند دلیل دارای اهمیت می باشد: 1- تهیه و استخراج لاین از منابع ژنتیکی موجود که یکی از مهم­ترین و اساسی­ترین پایه­های تحقیقاتی مؤسسات تولید کننده بذر است، 2- حفظ و گسترش تنوع در منابع ژرم پلاسم، 3- ارزیابی لاینها و شناسایی ترکیبهای برتر، 4- شناسایی نشانگرهای آگاهی بخش جهت بهبود عملکرد و کاهش حساسیت به تنشهای زنده و غیرزنده محیطی. با توجه به اینکه نشانگر ISSR در هر تلاش باندهای زیادی تولید می کند به عبارتی تکثیرپذیری بالایی دارد، کاربرد آن سریع و آسان است و در مقایسه با RAPD تکرارپذیرتر می­باشد؛ از این­رو در مطالعات بررسی تنوع ژنتیکی بین افراد خویشاوند نسبت به سایر نشانگرها بیشتر استفاده می شود. این بررسی برای اولین بار در ژرم پلاسم مورد مطالعه به منظور بررسی روابط خویشاوندی و میزان شباهت یا تفاوت ژنوتیپها و تعیین گروههای بالقوه هتروتیک با استفاده از 16 ترکیب آغازگری ISSR انجام گرفت.

مواد و روشها

مواد گیاهی: در پژوهش حاضر 100 لاین خالص ذرت از دانشگاه رازی کرمانشاه، مرکز تحقیقات کشاورزی خراسان رضوی و مؤسسه نهال و بذر کرج تهیه شده و به منظور ارزیابی تنوع ژنتیکی، مورد مطالعه قرار گرفتند (جدول 1). از هر لاین خالص 6 تکرار در گلدانهای بزرگ با قطر دهانه 30 و ارتفاع 26 سانتیمتر کشت و در مزرعه تحقیقاتی گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی دانشگاه ارومیه در قالب طرح کاملاً تصادفی چیده شدند. فاصله گلدانها در روی ردیفها 40 و بین دو ردیف 60 سانتیمتر در نظر گرفته شد. آبیاری گلدانها در طول فصل رشد با سیستم قطره­ای انجام گرفت. در طول دوره رشد رویشی هر 10 روز یکبار کوددهی با کود 20-20-20 (NPK) انجام گرفت.

 

جدول 1- کد، نام، محل جمع­آوری و شماره کلاستر لاینهای ذرت مورد مطالعه

کد

نام لاین

محل

جمع­آوری

کلاستر

کد

نام لاین

محل

جمع­آوری

کلاستر

1

Tenptato (White- Grade 1)

مشهد

1

34

A679/420N89

مشهد

1

2

K1263-1388

مشهد

2

35

K18-B /1392 (Indonesia-Colombia)

مشهد

1

4

36-N/M-K3653/2

مشهد

1

36

66*1388

مشهد

1

5

89-4*

مشهد

1

37

70*1388

مشهد

1

6

9/K1911

مشهد

1

38

14*/89

مشهد

1

7

74*/1388

مشهد

1

39

6*/88

مشهد

1

8

8/K1911

مشهد

1

40

3K19/1

مشهد

1

9

25*/89

مشهد

1

41

K1263/1 (Sterilized)

مشهد

2

10

K1264 /1

مشهد

1

42

1387/193/Chase*

مشهد

1

11

48*1390

مشهد

1

43

K615/1

مشهد

3

12

13/K19/1

مشهد

1

44

39*/89 (Sibcer)

مشهد

3

13

11K1910

مشهد

1

45

16*/89

مشهد

3

14

5/K1911

مشهد

1

46

115*13981 (White cob corn)

مشهد

3

15

4/K1911

مشهد

1

47

138*/89

مشهد

3

16

7/K1911

مشهد

1

48

K19*/1392 (Isolate)

مشهد

3

17

6/K19/1

مشهد

1

49

P13L2

مشهد

3

18

2K1911

مشهد

1

50

P19L17 Kahia

کرمانشاه

3

19

55-N- K3640/S

مشهد

1

51

P15L16

کرمانشاه

3

20

43*89 (Red cob corn)

مشهد

1

52

P6L1

کرمانشاه

3

21

172*/89

مشهد

1

53

P3L2

کرمانشاه

3

22

67*/88

مشهد

1

54

P14L1 Kahia

کرمانشاه

3

23

23*89

مشهد

1

55

P19l3

کرمانشاه

3

24

10/K 19/1

مشهد

1

56

P9L3 Kahia

کرمانشاه

2

25

1*/89 (Red cob corn)

مشهد

1

57

P15 L16 Kahia

کرمانشاه

3

26

34*/1399

مشهد

3

58

P11L7

کرمانشاه

3

27

20*1399

مشهد

3

59

P14L2

کرمانشاه

3

28

S2/QPM/SUKMA (Indonesia)

مشهد

2

60

P14L2

کرمانشاه

3

29

K19/1

مشهد

2

61

P10L5

کرمانشاه

3

30

K166 B/89

مشهد

2

62

P16L6 Kahia

کرمانشاه

3

31

163*/6/15

مشهد

2

63

P16L4 Kahia

کرمانشاه

3

32

KE70012/ 1-12 -1388

مشهد

1

64

P15L4

کرمانشاه

3

33

75*/1388

مشهد

3

65

P1L4 (Dialell- Karaj)

کرمانشاه

3

 

ادامه جدول 1-

66

P11L9

کرمانشاه

3

85

R59 (Paternal)

کرج

1

67

P11L6

کرمانشاه

3

86

Super sweet-1387 Basin

مشهد

2

68

P9L6

کرمانشاه

3

87

197/ Power Hense-S2

مشهد

3

69

P13L3

کرمانشاه

3

88

Challenged 1389/st

مشهد

3

70

P3L11

کرمانشاه

3

89

Sweet white/ 1390

مشهد

3

71

P3L1

کرمانشاه

3

90

1390 Sweet 3151*

مشهد

3

72

P10L7

کرمانشاه

3

91

52*Sweet

مشهد

3

73

P16L12 Kahia

کرمانشاه

3

92

Popcorn-53 or 54 (Linear)

مشهد

1

74

p1L15 Kahia

کرمانشاه

3

93

W37a

کرج

3

75

P19L5 Kahia

کرمانشاه

3

94

KS13

کرج

1

76

P10L9

کرج

3

95

R319

کرج

3

77

K615/1

کرج

3

96

R59 (Paternal)

کرج

1

78

Mo17

کرج

3

97

W153R

کرج

3

79

OH43/1-42

کرج

3

98

K1533 Popcorn

کرج

3

80

K12264/ 5-1

کرج

3

99

R59*R (Double cross- maternal)

کرج

3

81

R=59

کرج

3

100

B73(RFC or CMS)

کرج

3

82

K615/1

کرج

3

101

1264/ 1

کرج

3

83

B73

کرج

3

102

MO17

کرج

3

84

OH43/1042 (Paternal)

کرج

3

103

ZK472221

کرج

3

 

 

ارزیابی ژنوتیپی: پس از رسیدن گیاهچه‌ها به مرحله ‌چهار برگی از 6 تکرار هر لاین یک نمونه برگی مخلوط تهیه شد. DNA نمونه‌های برگی به روش CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) (22) استخراج گردید. ارزیابی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده و آگاهی از میزان خلوص و غلظت آن با استفاده از اسپکتروفتومتری با طول موج 260 نانومتر و الکتروفورز ژل آگارز 1 درصد انجام گرفت (شکل 1).

 

 

 

شکل 1- کیفیت سنجی DNA استخراج شده از برخی از لاینهای ذرت مورد مطالعه با استفاده از ژل آگارز 1 درصد

 

ارزیابی ژنتیکی ژنوتیپها با 16 ترکیب آغازگری ISSR انجام شد (جدول 2).

جدول 2- نام و توالی آغازگرهای ISSR مورد استفاده

نام آغازگر

توالی (′3 à ′5)

UBC890

VHV(GT)7

B9

(GGT)2CAAG

A12

(GA)6CC

UBC807

(AG)8T

UBC 811

(GA)8C

UBC812

(GA)8A

UBC820

(GT)8C

UBC825

(AC)7T

UBC827

(AC)8G

UBC835

(AG)8YC

UBC841

(GA)8YC

UBC 848

(CA)8RG

UBC867

(GGC)6

UBC884

HBH(AG)7

UBC885

(AC)8YT

A7

(AG)10T

R = A/T, Y = G/C, B = T/G/C; D = A/T/G, H = A/TIC, V = A/G/C

برای انجام واکنشهای تکثیر در حجم نهایی lµ25، lµ5/0 dNTP (mM 50)، lµ7/0 کلرید منیزیم (mM 10)، lµ5/2 بافر PCR (X10)، pmol10 از هر کدام از آغازگرها، 28/0 واحد آنزیم Taq DNA Polymerase، آب دوبار تقطیر شده و ng25 DNA پایه استفاده شد. واکنش تکثیر در 94 درجه سانتی گراد به مدت 4 دقیقه برای شروع واشرست سازی DNA، سپس 36 چرخه شامل: 30 ثانیه در 94 درجه سانتی گراد، 30 ثانیه در 55-35 درجه سانتی گراد (بسته به ترکیب آغازگری)، 2 دقیقه در 72 درجه و بسط نهایی در 72 درجه به مدت 10 دقیقه در دستگاه ترموسایکلر ABI (Applied Biosystem) انجام گرفت. محصولات تکثیر شده بر روی ژل آگارز 7/1 درصد و بافر TBE 0.5X (Tris base- Boric acid- EDTA) الکتروفورز شدند. برای مشاهده باندها از اتیدیوم بروماید و اشعه UV استفاده گردید (شکل 2).

 

 

شکل 2- چندشکلی تکثیر شده توسط آغازگر UBC827 در برخی از لاینهای ذرت مورد مطالعه. نشانگر اندازه 1kb Gene ruler (Fermentas)

 

تجزیه و تحلیل داده­ها: قطعات تکثیر شده حاصل از PCR بر اساس حضور یا عدم حضور قطعه مورد نظر در نشانگر به ترتیب به صورت یک و صفر امتیازدهی شدند و ماتریس حاصل در تجزیه های آماری مورد استفاده قرار گرفت. تعداد و درصد مکانهای چند شکل با استفاده از نرم افزار PopGen32 محاسبه گردید. خصوصیات مکانهای تکثیر شده مانند Ne، I، He، Na و H در لاینهای مورد مطالعه با استفاده از نرم افزار GenAlEx6/051 (23) وPopGen32  (35) محاسبه گردید. برای ترسیم دندروگرام از ضریب تشابه جاکارد بر پایه الگوی Complete linkage در نرم افزار NTSYS2.1 (28) استفاده شد. تجزیه به مختصات اصلی (PcoA) با استفاده از ماتریس Dcenter حاصل از ماتریس تشابه در نرم افزار NTSYS2.1 انجام شد. فاصله ژنتیکی Nei بین گروههای مورد مطالعه (کرمانشاه، خراسان رضوی و کرج) با استفاده از نرم افزار GenAlEx6/051 و PopGen32 محاسبه شد. برای بررسی تنوع بین و درون گروهها از تجزیه واریانس مولکولی و نرم افزار GenAlEx6/051 استفاده شد. سطوح تمایز ژنتیکی (PhiPT) و همچنین میزان اطلاعات چند شکلی (Polymorphism information content;PIC) بر اساس فرمول زیر و با استفاده از نرم افزار GenAlEx6/051 محاسبه شد (6):

 

در این فرمول Pi فراوانی آلل iام می‌باشد.

نتایج و بحث

اطلاعات نشانگرها: در این پژوهش از 16 ترکیب آغازگری ISSR بر روی 100 لاین خالص ذرت به منظور ارزیابی تنوع ژنتیکی استفاده شد. ترکیبات آغازگری مورد استفاده توانستند 81 مکان ژنی را تکثیر کنند. از بین مکانهای تکثیری، 78 مکان ژنی (12/95 درصد) چندشکل بودند. آغازگرهای UBC825 و UBC811 به ترتیب بیشترین 8 و کمترین 2 تعداد مکان چند شکل را تولید نمودند. بالا بودن چند شکلی به دست آمده در این پژوهش (3/96 درصد) را می‌توان به کارآیی بالای نشانگرهای مورد استفاده و همچنین تعداد زیاد ژنوتیپهای مورد بررسی نسبت داد (19). با توجه به اینکه نشانگرهای ISSR بسیار متنوع‌اند و در سراسر ژنوم پخش هستند، بنابراین استفاده از این نشانگرها می‌تواند سطح بالایی از چند شکلی را آشکار سازد (32 و 33). در مطالعه تنوع ژنتیکی لاینهای زودرس ذرت با استفاده از نشانگرهای SSR (Simple sequence repeat)، 46 نشانگر 137 باند چند شکل تولید کردند (4). تعداد آللها برای هر مکان بین 2 تا 5 متغیر و میانگین آن نیز 96/2 بود. میانگین تعداد آلل هر نشانگر مولکولی در هر مکان ژنی مناسب بودن آن در تخمین تنوع ژنتیکی را نشان می­دهد. بنابراین آغازگرهایی که تعداد آلل بیشتری تکثیر می نمایند، برای بررسی تنوع ژنتیکی مناسب تر هستند (27). دامنه تعداد آلل مؤثر از 16/1 برای آغازگر UBC867 تا 62/1 برای آغازگر A12 متغیر بود، میانگین آلل مؤثر 34/1 برآورد شد (جدول 3). تعداد آلل مؤثر از محاسبه تعداد آللها و فراوانی آنها به دست می‌آید. تعداد آلل مؤثر 1 در مکانهای ژنی UBC807(2500)، UBC807(300) و B9(1000) بیانگر وجود یک آلل با حداکثر اثر و ویژگی منحصر به فرد می‌باشد. آلل مؤثر 06/1 برای مکان ژنی UBC825(500) نشان‌دهنده دو آلل با فراوانی آللی کاملاً متفاوت و وجود یک آلل نادر برای این مکان است.

با توجه به اینکه نشانگر ISSR، یک نشانگر غالب است با نرم افزارهای تجزیه تنوع ژنتیکی مانند PopGene32 و GenAlEx 6/051 نمی توان هتروزیگوسیتی مشاهده را محاسبه کرد. بنابراین محاسبه سایر شاخصهای تنوع از جمله Fst و Chisq امکان پذیر نبود. دامنه ‌PIC در لاینهای مورد مطالعه از 152/0 برای آغازگر UBC867 تا 365/0 برای مکان A12 متغیر بود. میانگین PIC در لاینهای مورد مطالعه 213/0 بود (جدول 3). در مطالعات مختلفی از شاخص PIC برای ارزیابی تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای ذرت استفاده شده است (4، 5 و 20). میزان اطلاعات چند شکل، یکی از شاخصهای مهم جهت مقایسه نشانگرهای مختلف از لحاظ قدرت تمایز آنها می‌باشد. مقادیر بالای PIC دلالت بر چندشکلی بالا و وجود آلل یا آللهای نادر در یک جایگاه نشانگری است که در تفکیک و تمایز افراد نقش به سزایی دارد (8). با توجه به میزان PIC می‌توان بیان نمود که آغازگر A12 مناسب ترین آغازگر برای بررسی تنوع ژنتیکی و تمایز ژنوتیپها می‌باشد. مقایسه دو شاخص هتروزیگوسیتی مورد انتظار تصحیح شده (uHe) و میزان اطلاعات چند شکلی نشان داد که همبستگی بالایی بین این دو شاخص وجود دارد به طوری­که نشانگرهایی با هتروزیگوسیتی بالا دارای میزان اطلاعات چند شکلی بالا نیز بودند.

 

 

جدول 3- پارامترهای تخمین تنوع ژنتیکی مربوط به آغازگرهای ISSR مورد استفاده در لاینهای ذرت

نام آغازگر

AT

TAL

PL

Ne

H

I

Nm

UHe

PIC

UBC807

56

5

3

26/1

17/0

27/0

24/50

18/0

18/0

B9

35

4

3

39/1

25/0

39/0

18/4

22/0

22/0

A12

42

5

5

62/1

37/0

55/0

30/28

36/0

36/0

UBC890

46

7

7

43/1

29/0

45/0

19/327

28/0

28/0

UBC884

58

3

3

41/1

24/0

37/0

68/43

23/0

23/0

UBC812

42

7

7

16/1

13/0

25/0

22/15

15/0

15/0

UBC811

52

2

2

41/1

24/0

45/0

28/205

27/0

27/0

UBC820

52

6

6

33/1

22/0

36/0

45/34

19/0

19/0

UBC825

54

8

8

38/1

25/0

39/0

89/15

21/0

21/0

UBC827

52

7

7

35/1

25/0

39/0

68/25

23/0

23/0

UBC835

41

3

3

48/1

27/0

42/0

29/9

15/0

15/0

UBC841

55

6

6

36/1

24/0

38/0

30/238

18/0

18/0

UBC848

40

7

7

38/1

25/0

33/0

06/25

19/0

19/0

UBC867

40

3

3

16/1

14/0

26/0

43/15

15/0

15/0

UBC88

40

4

4

36/1

23/0

37/0

81/17

121/0

21/0

A7

52

4

4

15/1

13/0

25/0

39/19

14/0

138/0

Mean

-

-

-

34/1

23/0

37/0

733/5

213/0

213/0

St.Dev

-

-

-

12/0

061/0

08/0

61/97

058/0

058/0

AT= دمای اتصال آغازگر، TAL= تعداد کل مکانهای تکثیری، PL= تعداد مکان چندشکل، Ne= تعداد آلل مؤثر، I= شاخص شانون، uHe= هتروزیگوسیتی مورد انتظار تصحیح شده، H= فاصله ژنتیکی Nei، Nm= میزان تمایز ژنتیکی، PIC= میزان اطلاعات چندشکل.

 

بالاترین مقدار Nm (19/327) مربوط به آغازگر UBC890 و کمترین مقدار آن (189/4) مربوط به آغازگر B9 بود. میانگین Nm 7/5 برآورد شد (جدول 3). به طور کلی اگر Nm کمتر از یک باشد تمایز بین لاینها بیشتر خواهد بود و اگر مقدار آن بیشتر از یک باشد تمایز کمی بین لاینها وجود خواهد داشت (34). شاخص شانون (I) از 25/0 برای آغازگر UBC812 تا 55/0 برای آغازگرA12  متغیر بود و میانگین آن 37/0به دست آمد (جدول 3). میزان PIC و شاخص شانون بیانگر میزان چندشکلی در بین ژنوتیپهاست. تنوع ژنتیکی بالا می­تواند به دلایل فعالیت بالای عناصر ترنسپوزونی، نوترکیبی میوزی، رانش ژنتیکی، انتخاب طبیعی و مصنوعی باشد (11). فاصله ژنتیکی Nei بین لاینهای مربوط به گروههای مشهد و کرمانشاه، 049/0، کرج و مشهد 034/0 و کرمانشاه و کرج 022/0 برآورد شد. در گیاهان زراعی، یکی از معیارهای انتخاب والدین برای تلاقی و بهره­مندی از پدیده هتروزیس، فاصله ژنتیکی می­باشد. هرچند مکانیسمهای ژنتیکی دخیل در فرآیند هتروزیس به­خوبی درک نشده­اند ولی مشخص شده است که هیبریدهای حاصل از تلاقی بین والدین با روابط ژنتیکی کمتر و فاصله ژنتیکی بیشتر قدرت بیشتری را نسبت به هیبریدهای حاصل از والدین با فاصله ژنتیکی کمتر از خود نشان می­دهند. بنابراین افراد متعلق به گروههای مشهد و کرمانشاه (جدول 1) می­توانند به طور بالقوه به عنوان والدین تلاقی در برنامه­های اصلاحی ذرت استفاده شوند.

تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA): به منظور تمایز و تفکیک لاینهای مختلف ذرت، تجزیه واریانس مولکولی با در نظر گرفتن محل تهیه لاینها به عنوان گروه با استفاده از نرم افزار GenAlEx6.501 انجام گردید. تجزیه واریانس مولکولی با استفاده از نشانگرهای ISSR نشان داد که 9 درصد تنوع محاسبه شده به تنوع بین گروهی (Among pops) و 91 درصد به تنوع درون گروهی (Within pops) مربوط می‌شود. مقدار PhiPT برابر 089/0 بود (جدول 4). این نتایج نشان می‌دهد که تمایز بین گروههای مختلف (محل تهیه لاینها) کم می‌باشد. بنابراین در گزینش جهت رسیدن به هتروزیس بهتر است که انتخاب از لاینهای درون گروهها انجام گیرد. تنوع کم بین گروههای لاینهای خالص ذرت می‌تواند نشان دهنده جریان ژنی بالا در بین گروهها و همچنین وجود روش گزینشی متفاوت در هر گروه باشد. (24). بالا بودن تنوع درون گروهی نسبت به تنوع بین گروهی نشان می‌دهد که در بین گروههای مختلف ساختار ژنتیکی بارزی وجود ندارد (10).

جدول 4- تجزیه واریانس مولکولی ژرم پلاسم ذرت مورد مطالعه با استفاده از نشانگرهای ISSR

منابع

df

SS

MS

Est.Var

%

بین جمعیت

2

4/108

2/54

34/1

9

درون جمعیت

97

8/1335

7/13

77/13

91

کل

99

3/1444

 

11/15

100

تجزیه خوشه­ای: یکی از بهترین راهکارهای طبقه بندی ذخایر ژنتیکی و تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی بین افراد، استفاده از الگوریتمهای آماری چند متغیره است. تجزیه خوشه ای از تکنیکهای آماری چند متغیره است که هدف آن گروه بندی افراد بر اساس مجموعه صفات آنهاست. به طوری که افراد با صفات مشابه در یک خوشه قرار می‌گیرند. در تجزیه خوشه‌ای افراد داخل یک خوشه دارای بیشترین یکنواختی بوده و در بین خوشه‌ها بیشترین تفاوت وجود دارد. بنابراین اگر گروه بندی درست انجام گرفته باشد اجزا یا افراد داخل خوشه از لحاظ ژنتیکی به هم نزدیکتر و افراد خوشه‌های متفاوت از هم دورترند (17).

گروه بندی لاینهای ذرت با سه ضریب تشابه تطابق ساده، دایس و جاکارد و الگوریتمهای مختلف انجام شد. تجزیه کلاستر با استفاده از ضریب تشابه ژنتیکی جاکارد و الگوریتم پیوستگی کامل لاینهای مورد بررسی را در 3 گروه اصلی قرار داد (شکل 3). گروه سوم و دوم به ترتیب بیشترین 56 و کمترین 7 تعداد لاین را به خود اختصاص دادند. در این گروه بندی، لاینهایی از مرکز تحقیقاتی خاص در کنار هم قرار نگرفتند که می­تواند ناشی از یکی بودن منشأ بذری لاینهای مختلف باشد که در اثر تبادل مواد ژنتیکی بین مراکز تحقیقاتی مختلف صورت گرفته است (26). مروتو و همکاران (2014) نیز در ارزیابی تنوع ژنتیکی 12 هیبرید و لاین خالص ذرت (از هر کدام 6 نمونه) با استفاده از نشانگر RAPD (Random amplified polymorphic DNA) نتایج مشابهی را به دست آوردند (21). در مطالعه دیگری که توسط کاروالهو و همکاران (2002) به منظور ارزیابی تنوع ژنتیکی 79 توده بومی برزیل و دو رقم اصلاح شده ذرت انجام شد، نشانگرهای ISSR ژنوتیپهای مورد بررسی را در 3 گروه اصلی قرار دادند. در این گروه بندی ژنوتیپهایی با منشأ جغرافیایی متفاوت در کنار یکدیگر قرار گرفتند (8). ضریب همبستگی کوفنتیک 59/0 بود که نشان دهنده مطابقت خوب بین ماتریس تشابه حاصل از دندروگرام و ماتریس تشابه اولیه است. به منظور توجیه پراکنش نشانگرهای مولکولی در سطح ژنوم از تجزیه به مولفه­های اصلی استفاده شد. دو مولفه اول و دوم به ترتیب 15/9 و 52/7 درصد از تغییرات داده­ها را توجیه نمودند. توجیه درصد کمی از تغییرات توسط هر مؤلفه در این مطالعه، بیانگر این است که نشانگرهای استفاده شده مستقل از هم هستند و نماینده نقاط مختلفی از ژنوم هستند. در واقع نشانگرهای انتخاب شده پراکنش مناسبی را در ژنوم ذرت دارند.

با توجه به نیاز کشور برای ذرت دانه ای (16) تحقیقات مختلف به زراعی و به نژادی در راستای افزایش تولید در جریان است (1 و 2). در این مطالعه به منظور ارزیابی تنوع ژنتیکی 100 لاین خالص ذرت از 16 آغازگر ISSR استفاده شد. ترکیبات آغازگری مورد استفاده توانستند 81 مکان ژنی را تکثیر کنند.

 

       
   
     
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


  Group III
 

 

  Group III
 

شکل 3- دندروگرام حاصل از تجزیه خوشه­ای 100 لاین ذرت بر اساس داده های حاصل از نشانگرهای ISSR

 

از بین مکانهای تکثیری، 78 مکان ژنی چندشکل بودند. با توجه به چندشکلی بالا می توان نتیجه گرفت نشانگرهای ISSR ابزار مفیدی برای انگشت نگاری و دسته­بندی ژنوتیپهای ذرت در گروههای بالقوه هتروتیک به شمار می‍روند. در گام بعدی تحقیق می توان از گروههای حاصل تعدادی فرد را انتخاب و تلاقی داده و عملکرد هیبرید های حاصل را بررسی کرد. بدین ترتیب می توان با استفاده از عملکرد هیبرید های بررسی شده و ضریب خویشاوندی ژنوتیپها، عملکرد هیبریدهای تولید نشده را با روش BLUP (Best linear unbiased prediction) پیش­بینی کرد.

1- ده یادگاری، م.، قلمبران، م.ر. و برنارد، ف. (1396). بررسی تاثیر غلظت های مختلف آلژینات بر برخی از شاخصهای فیزیولوژیکی رشد گیاهچه ذرت (.Zea mays L) در محیط آلوده به ترکیبات نفتی (گازوئیل). مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)، 30، 788-776.
2- ملازم، د. و بشیرزاده، ع. (1396). بررسی فعالیت آنزیم‌های آنتی اکسیدان و پرولین در ارقام ذرت (Zea mays L.) تحت تنش شوری. مجله پژوهش های سلولی و مولکولی (زیست شناسی ایران)، جلد 30 ، 90-77.
 
3- Agarwal, M., Shrivastava, N. and Padh, H. (2008). Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences. Plant Cell Reports, 27: 617-631.
4- Akinwale, R.O., Badu-Apraku, B., Fakorede, M.A.B. and Vroh-Bi, I. (2014). Heterotic grouping of tropical early-maturing maize inbred lines based on combining ability in Striga-infested and Striga-free environments and the use of SSR markers for genotyping. Field Crops Research, 156: 48-62.
5- Amaral Júnior, A.T., Oliveira, E.C., Azeredo Gonçalves, L.S., Alberto Scapim, C., Silvia Candido, L., Conceição Silva, T.R., Vittorazzi, C. and Cunha, K.S. (2011). Assessment of genetic diversity among maize accessions using inter simple sequence repeats (ISSR) markers. African Journal of Biotechnology, 10(69): 15462-15469.
6- Anderson, A., Churchill, G.A., Autrique, J.E., Tanksley, S.D. and Sorrells, M.E. (1993). Optimizing parental selection for genetic linkage maps. Genome, 36(1): 181-186.
7- Archak, S., Gaikwad, A.B., Gautam, D., Rao, E.V.V.B. and Swamy, K.R.M. (2003) Comparative assessment of DNA fingerprinting techniques (RAPD, ISSR and AFLP) for genetic analysis of Cashew (Anacardium occidentale L.) accessions of India. Genome, 46: 362-369.
8- Carvalho, V.P., Ruas, P.M., Ruas, C.F., Ferreira, J.M. and Moreira, R.M.P. (2002). Assessment of genetic diversity in maize (Zea mays L.) landraces using inter simple sequence repeat (ISSR) markers. Crop Breeding and Applied Biotechnology, 2(4): 557-568.
9- Dalamu Behera, T.K., Gaikwad, A.B., Saxena, S. and Bharadwaj, C. (2012). Morphological and molecular analyses define the genetic diversity of Asian bitter gourd (Momordica charantia L.). Australian Journal of Crop Science, 6: 261-267.
10- Diz, A.P. and Presa, P. (2009). The genetic diversity pattern of Mytilus galloprovincialis in Galician Rias (NW Iberian estuaries). Aquaculture, 287(3): 278-285.
11- Doebley, J.F. (2004). The genetics of maize evolution. Annual Review of Genetics, 38: 37-59.
12- Dubreuil, P. and Charcosset, A. (1998). Genetic diversity within and among maize populations: a comparison between isozyme and nuclear RFLP loci. Theoretical and Applied Genetics, 96: 577-587.
13- Dubreuil, P. and Charcosset, A. (1999). Relationships among maize inbred lines and populations from European and North American origins as estimated using RFLP markers. Theoretical and Applied Genetics, 99: 473-480.
14- Ellneskog-Staam, P., Henry Loaisiga, C. and Merker, A. (2007). Chromosome C-banding of the Teosinte Zea nicaraguensis and comparison to other Zea species. Hereditas, 144: 96-101.
15- Elsadig Idris, A., Babiker Hamza, N., Osman Yagoub, S., Ibrahim, A. and El-Amin, H. (2012). Maize (Zea mays L.) genotypes diversity study by utilization of inter-simple sequence repeat (ISSR) markers. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 6(10): 42-47.
16- Emam, Y. (2009). Cereal crop. ShirazUniversity Press.
17- Hair, J. F., Anderson, R.E., Tatham, R.L. and William, C. (1995). Black (1995), Multivariate data analysis with readings. New Jersy: Prentice Hall.
18- Hoxha, S., Shariflou, M.R. and Sharp, P. (2004). Evaluation of genetic diversity in Albanian maize using SSR markers. Maydica, 49: 97-103.
19- Mokrani, L., Gentzbittel, L., Azanza, F., Fitamant, L., Al-Chaarani, G. and Sarrafi, A. (2002). Mapping and analysis of quantitative trait loci for grain oil content and agronomic traits using AFLP and SSR in sunflower (Helianthus annuus L.). Theoretical and Applied Genetics, 106(1): 149-156.
20- Muhammad, R.W., Qayyum, A.A., hmad, M.Q., Hamza, A., Yousaf, M., Ahmad, B., Younas, M., Malik, W., Liaqat, S. and Noor, E. (2017). Characterization of maize genotypes for genetic diversity on the basis of inter simple sequence repeats. Genetics and Molecular Research, 16(1): 1-9.
21- Mrutu, B.A., Feyissa, T. and Ndunguru, J. (2014). Assessment of genetic diversity of maize inbred lines and hybrids in Southern Highlands of Tanzania by using random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. American Journal of Research Communication, 2(4): 84-99.
22- Murray, M.G. and Thompson, W.F. (1980). Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research, 8(19): 4321-4326.
23- Peakall, R.O.D. and Smouse, P.E. (2006). GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Molecular Ecology Notes, 6(1): 288-295.
24- Pinera, J.A., Blanco, G., Vázquez, E. and Sánchez, J.A. (2007). Genetic diversity of blackspot seabream (Pagellus bogaraveo) populations of Spanish Coasts: a preliminary study. Marine Biology, 151(6): 2153-2158.
25- Reddy, M.P., Sarla, N. and Siddiq, E.A. (2002). Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding. Euphytica, 128: 9-17.
26- Rincon Sanchez, F., Johnson, B., Crossa, J. and Taba, S. (1996). Cluster analysis, an approach to sampling variability in maize accessions. Maydica, 41: 307-316.
27- Röder, M.S., Korzun, V., Wendehake, K., Plaschke, J., Tixier, M.H., Leroy, P. and Ganal, M.W. (1998). A microsatellite map of wheat. Genetics, 149: 2007-2023.
28- Rohlf, F.J. (2006). Ntsys version v. 2.21. New York: Exeter Software.
29- Sandhu, K.S., Singh, N. and Malhi, N.S. (2007). Some properties of corn grains and their flours I: Physicochemical, functional and chapati-making properties of flours. Food Chemistry, 101: 938-946.
30- Rouf Shah, T., Prasad, K. and Kumar, P. (2016). Maize- A potential source of human nutrition and health: A review. Cogent Food & Agriculture, 2: 1-9.
31- Sajjad, M., Khan, S.H. and Khan, A.S. (2011). Exploitation of germplasm for grain yield improvement in spring wheat (Triticum aestivum). International Journal of Agriculture and Biology, 13: 695-700.
32- Shafiei-Astani, B., Ong, A.H.K., Valdiani, A., Tan, S.G., Yong, C.S.Y., Ahmady, F., Alitheen, N.B., Ng, W.L. and Kaur, T. (2015). Molecular genetic variation and structure of Southeast Asian crocodile (Tomistoma schlegelii): comparative potentials of SSRs versus ISSRs. Gene, 571: 107-116.
33- Wang, X., Yang, R., Feng, S., Hou, X., Zhang, Y., Li, Y. and Ren, Y. (2012). Genetic variation in Rheum palmatumand and Rheum tanguticum (Polygonaceae), two medicinally and endemic species in China using ISSR markers. PLOS ONE, 7: e51667.
34- Wright, S. (1951). The genetical structure of populations. Annals of Eugenics, 15: 323-354.
35- Yeh, F.C., Yang, R., Boyle, T.J., Ye, Z. and Xiyan, J.M. (2000). PopGene32, microsoft windows-based freeware for population genetic analysis, version 1.32. Molecular Biology and Biotechnology Centre, University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada.
پژوهش‌های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)
دوره 32، شماره 2
مرداد 1398
صفحه 230-241
  • تاریخ دریافت: 30 مرداد 1396
  • تاریخ بازنگری: 01 دی 1396
  • تاریخ پذیرش: 16 بهمن 1396