تأثیر وابسته به گلوکز متفورمین بر بیان دو microRNA دخیل در گذر از حالت اپیتلیالی به مزانشیمی در رده سلولی سرطان معده

شیوا ولایی¹، محمد مهدی یعقوبی¹ ، عباس جمشیدی زاد² و مهدی شمس آرا^2*

¹ ایران، کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی

² ایران، تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، گروه زیست فناوری دامی

تاریخ دریافت: 29/5/96                تاریخ پذیرش: 26/9/96

چکیده

سرطان معده چهارمین سرطان شایع و دومین سرطان منجر به مرگ در دنیاست که بالاترین مرگ و میر را در آسیا دارد. این سرطان یک بدخیمی پیشرونده می باشد که در 79درصد موارد در مرحله متاستاز تشخیص داده می شود. سلولهای سرطانی برای افزایش قابلیت تهاجم تحت فرآیندی به نام گذر از حالت اپیتلیال به مزانشیم (EMT) قرار می گیرند. در سطح اپی ژنتیکی microRNAها (miRها) نقش به سزایی در سرکوب یا فعال سازی EMT ایفاء می کنند. خانواده miR-200 در سرکوب EMT نقش دارند و بیان آنها در بافت سرطانی معده کاهش نشان می دهد. شاید بتوان از این خانواده برای تشخیص بیماری و درمان استفاده نمود. هدف از این مطالعه بررسی اثر متفورمین در دو محیط با غلظت متفاوت گلوکز بر بیان دو miR-141 و miR-200a در رده سلولی AGS سرطان معده بود. بدین منظور، پس از تعیین دز موثر متفورمین  mM) 10) با روش MTT،  سلولها به مدت 72 ساعت تحت تیمار با متفورمین قرار گرفته و سپس به روش Real-time PCR میزان بیان دو miR ارزیابی شد. نتایج بیانگر افزایش معنی دار وابسته به دز هر دو miR-14 و miR-200a بود. این افزایش بیان تحت تأثیر گلوکز در دو خوشه ژنی مرتبط با خانواده miR-200 میزان متفاوتی را نشان داد. از آنجا که کاهش بیان خانواده miR-200 با کاهش بقای بیماران مرتبط شناخته شده است، امید می رود استفاده از متفورمین در کنار سایر روشهای درمان سرطان معده گامی موثر در جهت بهبود روشهای معمول درمان این بیماری باشد.

واژه های کلیدی: سرطان معده؛ miR -141؛ miR -200a؛ متفورمین

* نویسنده مسئول، تلفن: 02144787414 ، پست الکترونیکی: shamsa@nigeb.ac.ir

مقدمه

سرطان معده، مشابه تمامی سرطانها بیماری پیچیده ای می باشد که در آن بسیاری از عوامل مستعدکننده اپی ژنتیکی و ژنتیکی نقش دارند. در میان علل اپی ژنتیکی که در فرآیندهای بالینی سرطان معده نقش دارند،  microRNAها (miRها) به عنوان تنظیم کننده های مهم، پس از رونویسی ایفای نقش می کنند. ویژگیهای خاص آنها، از جمله اختصاصی بودنشان برای بافت و حتی سلول و نیز پایداری آنها در مایعات مختلف بیولوژیکی و تنظیم مجدد آنها در طی تومور زایی، باعث شده است که miR ها به عنوان نشانگرهای بالقوه و اهداف درمانی در سرطانها مورد توجه قرار بگیرند(6). در سالهای اخیر، بسیاری از مقالات نشان داده اند که miR ها می توانند به عنوان انکوژنها یا سرکوب گرهای تومور در توسعه و پیشرفت سرطان عمل کنند (12, 17 و 32).

خانواده miR -200 شاملmiR -200a ، miR -200b، miR -200c، miR -141 وmiR-429  می باشد که به صورت دو خوشه ژنی مجزا در ژنوم قرار گرفته اند(14). در انسان یکی از خوشه ها شامل miR-200a، miR-429 و miR-200b می باشد که در منطقه بین ژنی روی کروموزوم یک واقع شده است و خوشه دوم شاملmiR-200c  و miR-141 است که روی کروموزوم 12 قرار دارد(3, 25). Gregory و همکارانش اولین بار با استفاده از سنجش مهاجرت اثر مهاری خانواده miR-200 را در مهاجرت سلولی گزارش کردند(14). این گروه نشان دادند که مهار این خانواده از miR، مهاجرت سلولهای اپیتلیال بافت کلیه سگ را افزایش می دهد. به طور مشابه، Park و همکارانش نشان دادند که بیان miR-200a/c در سلولهای سرطان پستان بسیار متاستاتیک MDA-MB-231 به طور قابل توجهی تحرک و مهاجرت آنها را کاهش می دهد(28). کاهش بیان اعضای خانوادهmiR-200  در سرطان تهاجمی پستان که فاقد بیان E-cadherin بوده و دارای فنوتیپ مزانشیمی می باشد، مشاهده شده است(14). بر اساس مطالعه Tang و همکارانش بررسی بیان دو miR از این خانواده (miR-200b/c) می تواند به عنوان نشانگر پیش آگهی در سرطان معده مورد استفاده قرار گیرد(33).

با توجه به تحقیقات می توان گفت خانواده miR-200 مهار کننده قوی گذر از حالت اپیتلیال به مزانشیم (EMT) (Epithelial to mesenchymal transition) است و عدم بیان آن همزمان با افزایش بیان  ZEB1و یا  ZEB2از عوامل منجر به  EMT می باشد. بنابراین خانواده miR-200 با هدف قرار دادن ZEB1/ZEB2 منجر به حفظ حالت اپیتلیالی سلول شده و از مهاجرت سلولها جلوگیری می کند. به نوبه خود، ZEB1، ZEB2 و نیز Snail1 می توانند با اتصال به جعبه E در نزدیکی محل شروع رونویسی خوشه های miR-200، رونویسی آن را مهار کنند، در نتیجه دو چرخه منفی شکل می گیرد که حفظ سلولها در هر دو حالت اپیتلیال یا مزانشیمی را باعث می شود(11). Cong و همکارانش دریافتند که miR-200a از طریق برهمکنش با β-catenin مسیر پیام رسانβ-catenin /Wnt را مهار کرده و در نتیجه مهاجرت، تهاجم و تکثیر را سرکوب می کند (10).

از طرف دیگر، این حقیقت که سلولهای سرطان معده که miR-200 را بیان می کنند، حساسیت بیشتری نسبت به شیمی درمانی دارند می تواند تأثیر مستقیمی روی نتایج بالینی داشته باشد؛ زیرا نشان داده شده است که بیمارانی که miR-200 را بیش از حد بیان می کنند نسبت به درمان حساس تر بوده، و شانس بقای بیشتری دارند. مهم تر از همه، این یافته ها نشان دهنده امکان استفاده از خانواده miR-200 به عنوان نشانگرهای پیش آگهی وجود دارد (37).

اهمیت پیش آگهی ضعیف مرتبط با کاهش بیان خانواده miR-200 در تومورهای اولیه گوارشی تأیید شده است (31). علاوه بر نقش miRهای خانواده miR-200 در ارزیابی پیش آگهی، ممکن است این خانواده به مقاومت در برابر درمان سیستمیک سرطان معده مرتبط باشند(6).

در دهه گذشته، به خواص ضد سرطانی متفورمین توجه گسترده ای شده است(20). مطالعات متعدد نشان داده اند که تیمار سلولهای سرطانی با متفورمین در شرایط برون تنی (In vitro) (آزمایشگاهی) رشد آنها را مهار می‍کند(22، 24، 29، 36، 38 و 39). از مدلهای متنوع شرایط درون تنی (In vivo) نیز برای نشان دادن تواناییهای ضد توموری متفورمین استفاده شده است. یکی از گزارشها توسطSchneider  و همکارانش ارائه شده است(30) که برای اولین بار نشان دادند متفورمین سرطان لوزالمعده را در هامستر با رژیم غذایی پرچرب مهار می کند. مطالعه دیگر بر روی مدل موش مبتلا به سرطان پستان نشان داد که درمان با متفورمین به طور قابل توجهی باعث کاهش رشد تومور و کاهش تجمع آدنوکارسینوم پستان و نیز افزایش طول عمر موش تراریخته HER-2/neu می شود (4).

اخیراً متفورمین به عنوان یک درمان کمکی بالقوه در درمان سرطان مورد توجه قرار گرفته است. فعالیت بالقوه ضدسرطانی متفورمین در مقابل داروهای دیگر کنترل گلوکز خون،  با بروز کمتر سرطان در دیابت نوع دو مرتبط است (19). این اثر ابتدا به تنظیم سیستمیک گلوکز و انسولین نسبت داده شد. فعالیت ضد سرطانی متفورمین به احتمال زیاد ترکیبی از کنترل اثرات سازمان یافته انسولین و اثر مستقیم بر سلولهاست. چندین مطالعه عملکرد متفورمین را در شرایط آزمایشگاهی در انواع مختلف سرطانها نشان داده اند (13, 15, 35 و 40). با این حال، برای مشاهده اثرات متفورمین در شرایط آزمایشگاهی مشابه آنچه در داخل بدن قرار است اتفاق بیفتد، غلظت بالایی از متفورمین (معمولاً 20-5 میلی مولار) لازم است. مطالعات اخیر پیشنهاد می دهند که موضوع ممکن است به دلیل استفاده از گلوکز بالا در محیط کشت باشد، و هنگامی که گلوکز کاهش می یابد، سمیت سلولی متفورمین به طور فزاینده برای سلولهای سرطانی افزایش می یابد(23 و 27). علاوه بر این، منبع کربن سلولهای سرطانی هنگامی که گلوکز را با گلوتامین جایگزین کردند، به طور قابل توجهی اثرات ضد سرطانی متفورمین را تحت تأثیر قرار داد. در مطالعه آنها سلولهای سرطانی در غیاب گلوکز و در حضور گلوتامین بالا حساسیت بیشتری به متفورمین داشتند (18).

اگر چه ثابت شده است که miR ها در تهاجم تومور و متاستاز دخالت می کنند، تاکنون در بسیاری از مطالعات ارتباط miR ها و EMT در سرطان معده موضوع بحث باقی مانده است(6). خانواده miR-200 به طور گسترده در سرطان تحقیق می شود، این مقاله به طور خاص بر نقش متفورمین بر بیان خانواده miR-200 در سرطان معده متمرکز خواهد بود. هدف از این مطالعه بررسی اثر متفورمین روی بیان دو miR-141 و miR-200a  در رده سلولی آدنوکارسینومای معده انسان می باشد.

مواد و روشها

رده سلولی: سلولهای رده AGS سرطان معده در محیط DMEM / F12 با دو غلظت گلوکز 8/7 و 5/17 میلی مولار و FBS 10درصد و پنی سیلین-استرپتومایسین 1 درصد در دمای 37 درجه سانتی گراد در رطوبت 95 درصد و 5درصد CO2 کشت داده شدند. تأثیر متفورمین بر بیان miRهای هدف، در دو غلظت متفاوت گلوکز محیط کشت مورد بررسی قرار گرفت.

آزمون MTT: براساس نتایج به دست آمده از آنچه در مطالعه گذشته مربوط به این تحقیق انجام شده بود (34).

تهاجم سلولی: یک روز قبل از آغاز آزمایش، سلولهای AGS در یک محیط بدون سرم قرار گرفتند. تهاجم سلولی به روش trans-well و با استفاده از کیت تهاجم سلولی Culturex 96 well BME انجام شد. به طور خلاصه، محفظه بالا با محلولx  5/0 BME پوشانیده شد و به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد در انکوباتور CO2 قرار گرفت. سپس BME از چاهک خارج شد و تعداد
10⁴ × 5 سلول در محیط DMEM / F12 بدون سرم با 10 میلی مولار متفورمین قرار گرفت. محفظه پایین با محیط حاوی FBS 10درصد پر شده و در دمای 37 درجه سانتی گراد با CO2 5درصد به مدت 24 ساعت انکوبه شد. بعد از شستن محفظه ها، محلول رقیق شده Calcein-AM به داخل چاهکها افزوده شد و با میکروسکوپ فلورسانس از سه منطقه از هر چاهک عکس برداری شد. تعداد کل سلولهای مهاجم توسط نرم افزار (NCBI) ImageJ شمارش شد. میانگین تعداد سلولهای شمارش شده در نمونه تیمار با میانگین تعداد سلولهای مهاجم در نمونه کنترل مقایسه شد. تمام آزمایشها به طور مستقل حداقل سه بار تکرار شد(34).

استخراج RNA و Real-time PCR: سلولهای AGS به مدت سه روز در دو محیط با غلظت متفاوت گلوکز با متفورمین تیمار شدند. RNA کل سلول هر 24 ساعت به مدت سه روز با استفاده از محلول TriPure (Roche) مطابق با دستورالعمل شرکت تولید کننده استخراج شد. تمامیت RNA استخراج شده به کمک الکتروفورز بر ژل آگارز تأیید شد. غلظت RNA با استفاده از اسپکتروفتومتر (nm260) اندازه گیری شد. 1 میکروگرم از RNA کل در کنار پرایمر stem-loop اختصاصی هر miR برای سنتز cDNA با استفاده از کیت PrimeScriptTM RT (Clontech) مورد استفاده قرار گرفت. آغازگرهای خاص برای تجزیه و تحلیل miR های بالغ طراحی شد (جدول 1).  واکنش در حجم 10 میکرولیتر آماده شد و تحت شرایط دمایی 37 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه و سپس 85 درجه سانتیگراد برای 5 ثانیه قرار گرفت. برای سنجش کمی miRها، PCR real-time در دستگاه Rotor Gene 6000 (Corbett) توسط کیت SYBR® Premix Ex TaqTM II با استفاده از چرخه های حرارتی، یک مرحله 95 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، 40 دوره 95 درجه سانتی گراد به مدت 5 ثانیه و 58 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه انجام شد. از ژن  RNU44به عنوان ژن مرجع استفاده شد و سطح بیان miRها با روش ^–ΔΔC 2 تعیین گردید.

جدول 1- توالی آغازگرهای استفاده شده در این پژوهش

^* بخشی از توالی پرایمری که مکمل توالی انتهای َ3 miR است

محاسبات آماری: همه آزمایشها سه بار تکرار شد و تجزیه و تحلیل آماری به کمک آزمون T-test انجام شد. مقدار 05/0p≤ به عنوان تفاوت آماری معنی دار در نظر گرفته شد.

نتایج

اثر مهاری متفورمین بر رشد سلول: کمترین دز متفورمین مهارکننده رشد سلولهای AGS با استفاده از آزمون MTT محاسبه شد(34). MIC (Minimum Inhibitory Concentration) متفورمین بر رشد سلولی 10 میلی مولار و پس از 48 ساعت در محیط کم گلوکز و گلوکز بالا تعیین شد.

اثر مهاری متفورمین بر تهاجم سلولی: تهاجم سلولی در حضور و عدم حضور متفورمین و در دو محیط گلوکزی متفاوت پس از 24 ساعت انکوباسیون با استفاده از شمارش تعداد سلولها در هر میدان دید به کمک میکروسکوپ فلورسانس انجام شد.  میانگین تعداد سلولها در دو گروه آزمایشی و گروه کنترل مقایسه شد که نتایج آن در (شکل1) آورده شده است. همان طور که در شکل 1 نشان داده شده، تیمار با متفورمین باعث کاهش قابل توجهی در قدرت تهاجم سلولهایAGS  شده است.

شکل 1- اثر مهاری متفورمین بر تهاجم سلولهای سرطانیAGS. سلولهایAGS  با متفورمین به مدت 24 ساعت تحت درمان قرار گرفتند و تهاجم سلول به روش trans-well و با شمارش سلولهای مهاجم به چاهک زیرین اندازه گیری شد (*p≤0.01، **p≤0.001 و ***p≤ 0.0001)(34).

تغییرات بیان نسبی miR-141 و miR-200a تحت تیمار با متفورمین در شرایط متفاوت غلظتی گلوکز: تغییر بیانmiR  های خانواده miR-200 در سلولهای تیمار شده با متفورمین با RT-qPCR اندازه گیری شد. همان طور که در شکل 2 نشان داده شده است، miR-141 به میزان 3/1، 5/1 و 2/2 برابر در محیط با گلوکز بالا، و 5،5/6 و7/8 برابر در محیط کم گلوکز به ترتیب پس از 24، 48 و 72 ساعت تیمار با متفورمین، افزایش بیان داشت. در مقابل،miR-200a  به میزان 15/3،8/5 و35/17 برابر در محیط با گلوکز بالا، و 6/0، 95/0و 2/2 برابر در محیط کم گلوکز در همان دوره زمانی افزایش بیان نشان داد. (شکلهای 2 و 3). این داده ها یک الگوی تغییر بیان ژن وابسته به زمان در تیمار با متفورمین را نشان می دهند.

شکل 2- نتیجه بررسی بیان رونوشت miR-141 در نمونه­های تیمار شده با غلظت mM10 متفورمین با PCR کمی. سلولها تا 72 ساعت در دو غلظت گلوکز با متفورمین تحت تیمار قرار گرفتند و میزان بیان ژنهای مورد نظر با RT- qPCR نسبت به نمونه کنترل اندازه گیری شد. افزایش بیان در هر دو محیط مشاهده شده و میزان افزایش در محیط با غلظت پایین گلوکز بیشتر بود. هر ستون میانگینها و انحراف را در سه تکرار نشان می دهد. (آزمونT، *p≤0.01، **p≤0.001 و***p≤ 0.0001)

شکل 3- نتیجه بررسی بیان رونوشت miR-200a در نمونه­های تیمار شده با غلظت mM10 متفورمین با PCR کمی. سلولها تا 72 ساعت در دو غلظت گلوکز با متفورمین تحت تیمار قرار گرفتند و میزان بیان ژنهای مورد نظر با RT- qPCR نسبت به نمونه کنترل اندازه گیری شد. افزلیش بیان در هر دو محیط مشاهده شده و میزان افزایش در محیط با غلظت بالا گلوکز بیشتر بود. هر ستون میانگینها و انحراف را در سه تکرار نشان می دهد. (آزمونT، *p≤0.01، **p≤0.001 و***p≤ 0.0001)

بحث

سرطان معده به دلیل تأخیر در تشخیص و متاستاز، یکی از مهم ترین مشکلات سلامتی در سراسر جهان است (1، 2 و 7). مطالعات گذشته نشان داده است که خانوادهmiR-200  جزء سرکوب گرهای تومور می باشند که با هدف قرار دادن ZEB1/2 (که به عنوان یک نشانگر EMT شناخته می‍شود) ویژگیهایEMT  را مهار می کنند. Chang و همکارانش نشان دادند که کاهش معنی داری در میزان بیان خانواده miR-200 در بافت توموری سرطان معده در مقایسه با بافت سالم وجود دارد، آنها اظهار کردند که این خانواده پتانسیل تشخیص بیماری و درمان را دارد(9).

این مطالعه بر روی سلولهای سرطان معده موافق با بررسیهایBao  و همکارانش بود که نشان دادند، در سلولهای سرطانی لوزالمعده، تحت تیمار با متفورمین بیان نسبی miR-200c وmiR-200b  در حالت وابسته به دز افزایش می یابد (5).

اگرچه تیمار با متفورمین باعث افزایش معنی دار وابسته به زمان دو miR-141 و miR-200a در هر دو محیط گلوکزی شد، اما میزان افزایش در این دو محیط الگوی متفاوتی داشت. در مقایسه بیان دو محیط گلوکزی، miR-200a در محیط با گلوکز بالا افزایش بیان بیشتری را نشان داد، در حالی که miR-141 در محیط با گلوکز پایین افزایش بیان بیشتری داشت. از آنجایی که این دو miR هر یک بر روی خوشه ژنی جداگانه ای روی کروموزومهای متفاوت قرار دارند، به نظر می رسد الگوی بیان این دو خوشه ژنی واکنش متفاوتی نسبت به میزان گلوکز محیط نشان می دهند.

مطالعات اخیر نشان می دهد که تغییر در مناطق پروموتر هر یک از خوشه های miR-200 می تواند موجب از دست رفتن آنها در سرطان شود(16). منطقه پروموتری خوشه miR-200c / -141 ازطریق افزایش متیلاسیون (8 و 27)، و خوشه miR-200b / -200a / -429 به طور عمده  از طریق تغییر هیستونها خاموش می شود(21). در ابتدا یک فرضیه درموردmiR-141  مطرح شد که آنزیم DNA متیل ترنسفراز برای فعالیت خود نیاز به کوفاکتور، SAM (S-Adenosyl methionine) دارد. از آنجا که سنتز SAM نیازمند ATP است، کاهش گلوکز باعث کاهش نسبت ATP/AMP شده و بر روی متیلاسیون ژنهای مربوطه تأثیرگذار خواهد بود، از طرفی دیگر این نتیجه برای تأثیر متیلاسیون هیستون در مورد miR-200a اثر عکس داشت، پس دلیل دیگری باید مطرح باشد که در تحقیقات آینده جای بررسی دارد.

Blanco وهمکارانش پیشنهاد کرده اند که راه حل بالقوه درمانی برای بیماران مبتلا به سرطان معده که با کاهش بیان miR-200 پاسخ ضعیفی به درمان می دهند می تواند تجویز هر عامل دمتیله کننده در ترکیب با درمان استاندارد باشد(6). این روش درمانی ممکن است بتواند بیان مهارکننده های اصلی تومور(26)، از جمله خانواده miR-200 را بازگرداند، بنابراین باعث به حداقل رساندن ظرفیت تهاجمی سلولهای سرطانی معده و افزایش حساسیت به شیمی درمانی معمول می شود(6). از آنجا که دمتیلاسیون تصادفی همچنین می تواند باعث بیان ژنهای ناخواسته و عوارض متعاقب آن شود، این روش مناسب به نظر نمی رسد. در حالی که متفورمین از جمله داروهایی است که تا کنون عوارض شناخته شده ای بر بیان ناخواسته ژنها نداشته و در عین حال باعث افزایش بیان خانواده miR-200 می شود. تحقیقات بیشتر بر باقی اعضا خانواده miR-200 و نیز بررسی درون تنی اثرات متفورمین بر بیان این خانواده می تواند نوید بخش راه کارهای جدید درمانی در سرطان معده باشد.