نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه بیماری شناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات، تهران، ایران

2 موسسه تحقیقات گیاهپزشکی کشور

3 انرزیهای نو- دانشگاه شهید بهشتی

4 دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران

چکیده

سیتوکروم اکسیدازc، کمپلکس پروتئینی در غشاء داخلی میتوکندری یوکاریوت ها و غشاء پلاسمایی پروکاریوت های هوازی است که به عنوان آخرین آنزیم در چرخه انتقال الکترون به اکسیژن ایفای نقش می‌کند. سیتوکرم اکسیدازc در ساختار خود 3 زیر واحد (2،1 و 3) دارد. در این مطالعه زیر واحد 1 سیتوکروم سی اکسیداز متعلق به پرتقال Citrus sciences بررسی شد. به این منظور پس از طراحی آغازگرهای اختصاصی بر اساس توالی‌های حاصل از مطالعه قبلی cDNA-AFLP بر روی گریپ-فروت، پرتقال، لیمو ترش، نارنگی و سلطان مرکبات، ژن مورد نظر با روش PCR تکثیر شد و در پلاسمید pGEM-T همسانه شد. انتخاب نوترکیب ها از طریق سیستم گزینش آبی- سفید صورت گرفت. قطعات همسانه شده برای تایید نهایی توالی یابی شدند. بررسی نرم‌افزارهای بیوانفورماتیکی نشان داد که این ژن پروتئینی با وزن مولکولی34/23059 کیلودالتون را کد کرده و دارای 217 اسیدآمینه بوده و نقطه ایزوالکتریک آن 94/4 می‌باشد. هدف این مطالعه جداسازی و همسانه سازی ژن سیتوکروم اکسیدازاز ژنوم گیاه پرتقال و تعیین مشخصات آن است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Isolation, cloning and bioinformatic analysis of cytochrom oxidase C subunit I in Citrus

نویسندگان [English]

  • Ali Abasi 1
  • Masoud Tohidfar 3
  • nader hasanzadeh 4

1 plant disease, science and research branch of Azad university, Tehran, Iran

3 new energy deparment, SBU

4 Plant diseases, Islamic Azad university

چکیده [English]

Cytochrome oxidase is one of a superfamily of proteins which act as the terminal enzymes of respiratory chains. The two main classes are cytochrome c oxidases, and quinol oxidases. There are two catalytic subunits, I and II. Subunit I contains two heme centers. In this study we have isolated the cytochrom oxidase (COX) gene from orange by PCR and clone it by ligation of this product to pGEM-T vector transformed E. coli bacteria. Sequencing analysis shows that open reading frame for this gene that encode a protein with 217 amino acids. Results of phylogenetic analysis showed that this gene in orange has related to Chondrostoma cytochrom oxidase gene (COX). cytochrom oxidase gene protein secrete in membrane and it’s extracellular secretion is little. The aim of this study was isolation and cloning of cytochrom oxidase gene genes from citrus genome and determining of it’s characterizations to practical use in the plants.

کلیدواژه‌ها [English]

  • "cloning"
  • "cytochrome oxidase C"
  • "Mitochondria genome"
  • "orange"

جداسازی ، همسانه‌سازی و آنالیزهای  بیوانفورماتیکی زیر واحد I ژن سیتوکروم اکسیداز C در مرکبات

علی عباسی1،مریم غایب زمهریر2*، مسعود توحیدفر3و نادر حسن زاده1

1 ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه بیماری شناسی گیاهی

2 ایران، تهران، سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی، مؤسسه تحقیقات گیاهپزشکی کشور، بخش تحقیقات بیماریهای گیاهی

3 ایران، تهران، دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده علوم زیستی و زیست فنآوری، گروه بیوتکنولوژی

تاریخ دریافت: 3/4/96                  تاریخ پذیرش: 16/11/96

چکیده

سیتوکروم اکسیدازc، کمپلکس پروتئینی در غشای داخلی میتوکندری یوکاریوتها و غشای پلاسمایی پروکاریوتهای هوازی است که به عنوان آخرین آنزیم در چرخه انتقال الکترون به اکسیژن ایفای نقش می­کند. سیتوکرم اکسیدازc در ساختار خود 3 زیر واحد (2،1 و 3) دارد. در این مطالعه زیر واحد 1 سیتوکروم سی اکسیداز متعلق به پرتقال  Citrus sciences بررسی شد. به این منظور پس از طراحی آغازگرهای اختصاصی بر اساس توالیهای حاصل از مطالعه قبلی  cDNA-AFLP بر روی گریپ­فروت، پرتقال، لیمو ترش، نارنگی و سلطان مرکبات، ژن مورد نظر با روش PCR تکثیر شد و در  پلاسمید pGEM-T  همسانه شد. انتخاب نوترکیبها از طریق سیستم گزینش آبی- سفید صورت گرفت. قطعات همسانه شده برای تأیید نهایی توالی یابی شدند. بررسی نرم­افزارهای بیوانفورماتیکی نشان داد که این ژن پروتئینی با وزن مولکولی34/23059 کیلودالتون را کد کرده و دارای 217 اسیدآمینه بوده و نقطه ایزوالکتریک آن 94/4  می­باشد. هدف این مطالعه  جداسازی  و همسانه سازی ژن  سیتوکروم اکسیدازاز ژنوم گیاه پرتقال و تعیین مشخصات آن است.

واژه های کلیدی: همسانه‌سازی، سیتوکروم c، پرتقال، ژنوم میتوکندری

* نویسنده مسئول، تلفن: 09123708128 ، پست الکترونیکی: zamharir2005@yahoo.com

مقدمه

 

در طول دهه‌های اخیر ژنتیک دانان از ژن سیتوکروم اکسیداز برای بررسی تنوع بین گونه‌ای و درون گونه‌ای موجودات زنده استفاده کرده‌اند. سیتوکروم اکسیداز آخرین آنزیم زنجیره تنفسی میتوکندری است و وظیفه انتقال الکترون از سیتوکروم احیاء شده به اکسیژن را برعهده دارد. سیتوکروم اکسیداز خود یک کمپلکس پروتئینی در غشای داخلی میتوکندری است. این کمپلکس از ۱۳ زیر واحد پروتئینی تشکیل شده که ۱۰ عدد آن توسط ژنوم هسته و ۳ عدد باقیمانده توسط ژنوم میتوکندری کد می‌شود (22). زیر واحدهای کد شده توسط ژنوم میتوکندری نقش اساسی در فعالیت آن دارند. وزن این کمپلکس kD 200 است. آنزیم سیتوکروم C اکسیداز آنزیمی است که به طور عمومی در کلیه موجودات زنده وجود دارد (13 و 22). این حقیقت بیانگر آن است که آنزیم مذکور از تکامل قدیمی برخوردار است و احتمالاً در یک موجود قدیمی ابتدا به وجود آمده و طی تکامل و ایجاد نسلهای بعدی به همه موجودات انتقال یافته است (17). این ژن با توجه به اینکه در داخل میتوکندری قرار دارد دارای جایگاه اختصاصی خوبی برای بررسی روابط فیلوژنتیکی بین راسته های مختلف موجودات است. اکسیدازها (oxidase) به عنوان آنزیم پایانی در پمپ پروتئینی آهن- مس اکسیداز و در زنجیره انتقال تنفسی در یوکاریوتها و پروکاریوتها (6) حضور دارد. این کمپلکس آنزیمی در زیرواحد کاتالیک خود شامل 4- 3 زیرواحد در پروکاریوتها و 13 واحد در یوکاریوتها می­باشد. زیرواحدهای متنوع اکسیداز تنفسی اجازه رشد در شرایط مختلف محیطی را به موجودات می­دهد . نتایج تحقیقات گذشته نشان داده است که Cytochrome c oxidase در یوباکتریها از باکتریهای گرم مثبت و آرکئی باکتریها مشتق شده است و پیشنهاد شده است یوباکتریها از طریق انتقال ژن این آنزیم را از باکتریهای گرم مثبت دریافت کرده­اند (6). زیرواحد 1 آنزیم سیتوکروم اکسیداز سی (CO1)  648 جفت باز طول دارد و به تنهایی این ظرفیت را دارد که تا حدود 98 درصد از گونه های جانوری را در تاکسونهای مختلف شناسایی کند (23).

تنوع ژن سیتوکروم C اکسیداز در گیاهان نسبت به جانوران بسیار اندک است و برای گیاهان از دو ژن کلروپلاستی rbcL و matK برای مطالعه تنوع ژنتیکی بیشتر استفاده می شود (25 و 33). لذا خصوصیات این آنزیم در گیاهان کمتر مورد توجه قرار گرفت و در حال حاضر اطلاعات کمی از خصوصیات این آنزیم که آنزیم کلیدی در تولید انرژی در میتوکندری است در گیاهان وجود دارد (24، 25 و 32). علاوه بر این تحقیقات اخیر نشان می دهد  این آنزیم نه تنها یک  آنزیم کلیدی در تولید انرژی در میتوکندری است، بلکه نقش مهمی در اکسیداز جایگزین در طی تنشهای زیستی و غیرزیستی دارد (11 و 23). اکسیداز جایگزین (AOX) یک واکنش اکسیداز پایانی بدون ذخیره انرژی در چرخه انتقال الکترون در میتوکندری گیاهان است که با استراحت دادن به چرخه تنفس کربن و انتقال الکترون فعال می شود و واکنش احیای چهار الکترونی اکسیژن به آب را کاتالیز می کند (23 و 31). مطالعات اخیر نشان داد که بیان این ژن در گیاهان در واکنشهای مختلف حساسیت یا مقاومت به یک پاتوژن تغییر می کند (23؛ 26؛ 27 و 31).

نتایج تحقیقی که به تازگی انجام پذیرفته است نشان می‍دهد بیان این ژن در مرکبات در طی آلودگی به بیماری میوه سبز مرکبات تغییر می کند (7). همچنین این آنزیم در مقاومت القایی و اکتسابی سیستمیک گیاهان به پاتوژنها عمل می کند (20 و 32). با توجه به اهمیت این آنزیم در انتقال سیگنال در بیماریهای مختلف گیاهی هنوز اطلاعات زیادی در مورد خصوصیات پروتئینی آن در گیاهان مختلف از جمله پرتقال وجود ندارد. به این منظور در این مطالعه برای اولین بار به جداسازی، همسانه سازی، و بررسی خصوصیات پروتئین این آنزیم در پرتقال پرداخته شده است.

مواد و روشها

تهیه نمونه های گیاهی و استخراج دی ان ای: نمونه­های برگی از  پرتقال Citrus sinensis (L.) Osbeck از باغات جنوب کرمان (جیرفت) تهیه شد. نمونه ها پس از جمع آوری بر روی یخ به آزمایشگاه منتقل شدند و تا زمان استخراج DNA در یخچال نگهداری شدند. استخراج DNA کل از برگ نمونه های جمع­آوری شده به روش CTAB (3) انجام شد.

طراحی آغازگر و انجام PCR: بر اساس مطالعات cDNA-AFLP بر روی گریپ­فروت، پرتقال، لیمو ترش، نارنگی (6) و سلطان مرکبات (5 و 18) آغازگرهای مختلف به منظور جداسازی ژن سیتوکروم اکسیداز CO1 از روی پرتقال  با استفاده از نرم افزار Vector NTI طراحی شـد. از جملــه منـاسب­ترین آنها، آغـازگــر 5'-CGGGGCGTCTAACTCATAGA-3' به عنوان آغازگر روبه­جلو و توالی 5'-GGGGAAAGACAACCTTGGA-3' به عنوان آغازگر برگشتی در نظر گرفته شدند. واکنــش زنجیرهای پلیمـراز در حجم نهایی 25 میکرولیتر انجام پذیرفت. آنزیم DNA پلیمراز Taq با حجم 2 یونیت، آغازگرهای رو به جلو و برگشتی 5/0 میکرومولار، DNA الگو 500 نانوگرم، دو میلی مولارMgCl2، 8/0 میکرومولار dNTP و 5/2 میکرولیتر بافر واکنش و آب مقطر تا حجم نهایی 25 میکرولیتر تنظیـم گردیـد.  برنامه انجام PCR شامل واسرشتگی اولیه به مدت 4 دقیقه در 94 درجه سانتی گراد و انجام 35 سیکل متوالی (94 درجه به مدت یک دقیقه، 58 درجه به مدت 50 ثانیه، 72 درجه به مدت 60 ثانیه) انجام شد. این آغازگر قطعه ای به طول bp 450 را در واکنش زنجیره­ای پلیمراز تکثیر نمود.

همسانه سازی در ناقل ژنی pGEM-T: خالص سازی محصول PCR با استفاده  از کیتAgarose Gel DNA Extraction (Vivantis, Malasia)  انجام شد.  عمل همسانه سازی در پلاسمید (Promega,  Cat number A3600) pGEM-T easy vector system pGEM-T easy vector system I، به روش سمبروک و همکاران 2001 صورت گرفت. انتخاب نوترکیبها به روش کلونی سفید و آبی انجام شد. تکثیر نوترکیبها در  E. coli نژاد Top10 صورت گرفت. باکتریهای نوترکیب  روی محیط  LBجامد حاوی آنتی‌بیوتیک آمپی‌سیلین، IPTG و X-GAL کشت داده شدند. پس از 16 ساعت تیمار در دمای 37 درجه سانتی گراد، تعدادی کلنی سفید به عنوان کلنیهای نوترکیب انتخاب و در نهایت استخراج پلاسمیدهای نوترکیب  با استفاده از کیت Plasmid Extraction Kit (Vivantis, Malasia) انجام گرفته و کلنیهای نوترکیب با استفاده از تکنیک PCR برای تأیید حضور قطعه ژنتیکی وارد شده مورد بررسی قرار گرفتند. توالی­یابی با دو پرایمر T7 و SP6   در شرکت ماکروژن (کره جنوبی) انجام شد.

آنالیزهای تعیین توالی و رسم درخت فیلوژنی: با استفاده از بانک ژن بین­المللی NCBI و موتور جستجوگر BLAST، توالیهای نوکلئوتیدی و اسید آمینه‌ای ژن CO1 به همراه ویژگیهای آن در پرتقال و چندین گونه دیگر مورد مقایسه قرار گرفتند. برنامه T-Coffee به آدرس (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/) برای همردیفی چندگانه توالیها به کار رفت و برای رسم درخت فیلوژنتیکی از نرم‌افزار MEGA6 به روش UPGMA انجام شد.

عملکرد و هدف­گیری پروتئین به ترتیب در بانک Blocks، و TargetP انجام شد. تعیین قسمتهای درون، خارج سلولی و غشایی پروتئین با استفاده از برنامه TMHMM (Prediction of transmembrane helices in proteins) صورت گرفت.

با استفاده از بانک swissprot مشخصات پروتئین بررسی شد. از سرور Interproscan دومینهای موجود در پروتئینها و کارکرد آنها به دست آمد. دامنه­های محافظت شده ژن مورد مطالعه در این تحقیق با استفاده از نرم افزار Interproscan (Protein sequence analysis & classification) بررسی شد. همچنین محتوی GC با استفاده از نرم افزار protparam که زیر مجموعه  بانک اطلاعاتی UniProtKB است، به دست آمد. خصوصیات فیزیکوشیمیایی شامل تعداد آمینواسید پروتئین، وزن مولکولی، نقطه ایزوالکتریک، درصد چربی و درصد آبگریزی در این مطالعه با protparam  صورت گرفت. الگوی جانشینی، مدل جایگزینی و D- Tajima توالی پروتئین نیز تعیین گردید. برای پیش­بینی ساختار ثانویه پروتئینها از نرم­افزار PSIPRED و سرور GoRI استفاده شد.

نتایج

پس از استخراج DNA از گیاهان مرکبات، PCR به منظور تکثیر ژن CO1 با استفاده از آغازگرهای طراحی شده در مرحله قبل صورت گرفت. اندازه محصول PCR  یک قطعه 450 جفت بازی بود (شکل1).

آنالیز بلاست نشان داد که توالی مورد نظر بیشترین شباهت (90 درصد) را با ژن اکسیداز میتوکندریایی Chondrostoma spکه جزء یوکاریوت است دارد. عدم شباهت آن با Citrus به­علت نبود ژنوم میتو کندریایی در بانکهای اطلاعاتی است که تاکنون ژنوم آن در دسترس عموم قرار نگرفته است و در بانکهای اطلاعاتی موجود نیست.

 

شکل 1-  تکثیر ژن CO1از روی DNA حاصل از گیاهان پرتقال (راهک 1) نارنگی (راهک 2) و گریپفروت (راهک 3و4) کنترل منفی (راهک C-) و M سایز مارکر bp 100 (فرمنتاز).

آنالیز های بیشتر نشان داد که توالی جداسازی شده جزء قسمتی از توالی کد کننده (Coding sequence (CDS)) است که به طور کامل توالی یابی نشده است. آنالیز های همردیفی چند تایی با استفاده از نرم افزار T-coffee نشان داد  که کل توالی، حفاظت شدگی بالایی در موجودات مختلف دارد که  نشان از نقش مؤثر این ژن در عملکردهای حیاتی در طول تکامل دارد.  به منظور بررسی روابط تکاملی بین مرکبات مختلف مورد مطالعه در این تحقیق درخت فیلوژنی رسم شد، تا میزان شباهت آنها با سایر گیاهان موجود در پایگاه بررسی شود. در این آنالیز سعی شد از توالیهایی استفاده شود  که در گونه­های نظیر مشابه باشند.  آنالیز فیلوژنی 6 گروه ایجاد گردید و فقط در یگ گروه توالی موردنظر با یک نوع ماهی Chondrostoma با هم قرار گرفتند که نشان می دهد توالی جدا سازی شده بیشترین شباهت را با  Chondrostomaدارد. اگر چه این دو مربوط به موجودات مختلف هستند، ولی این ژن در آنها وجود دارد. در بقیه گروهها موجودات یک نوع با هم قرار دارند. فقط دوگروه که شامل Achondrostoma arcasii با کد پذیرش  KJ552537وC. colchicum با کد پذیرشKU729241  است، به طور جداگانه از بقیه گروهها قرار گرفته اند که کمترین شباهت را و دورترین فاصله را با بقیه گروهها در ماتریس تشابه  با بقیه گروهها نشان دادند. نکته مهم این است که وجود  ژن مورد نظر در موجودات مختلف نشان دهنده نقش کلیدی آن است که توانست به صورت حفاظت شده در موجودات مختلف ظاهر شود.

 

 

شکل 2- درخت فیلوژنتیکی زیر واحد I ژن سیتوکروم اکسیداز با همتای خود در  بانک اطلاعاتی NCBI با استفاده از نرم‌افزار MEGA6. گونه های نام برده در شاخه به ترتیب Chondrostoma kinzelbachi (KJ553146)، C. kinzelbachi  (KJ553200)، C. colchicum (KU729241)، C. ohridanus (KJ552832)، C. prespense (KJ552842)، Achondrostoma arcasii (KJ552537)، Pseudochondrostoma polylepis (KJ554190)، P. polylepis isolate Ex38G8 (KJ554113).

 

بررسی ساختار دوم پروتئین ژن مورد نظر نشان داد که زنجیره α این پروتئین کمتر از زنجیره بتای آن است. آنالیز دامنه­ها نشان داد که این پروتئین دارای سه دامنه غشایی، داخل سلولی و خارج سلولی است که به صورت متوالی در طول پروتئین قرار دارند.

آنالیز در پایگاه Blocks نشان داد که پروتئین این ژن با2.4e-142  e-value= متعلق به خانواده   سیتوکروم اکسیداز c است که این خانواده  8 بلوک حفاظت شده دارد.  نتایج مربوط به هدف­گیری  نشان داد که پروتئین این ژن  با احتمال بالا به صورت ترشحی عمل می کند. 

درصد GC این ژن 65/46 درصد تخمین زده شد. آنالیز محتوی GC مشخص کرد که ژنهایی با محتوی GC بالا پایداری بیشتری در برابر حرارت نسبت به ژنهایی با محتوی GC کمتر دارند.

وزن مولکولی این پروتئین 34/23059 دالتون و تعداد اسیدآمینه­های آن 217 عدد تخمین زده شد. مقدار دامنه ایزوالکتریک این پروتئین 94/4 است. بعلاوه GRAVY (خاصیت آبگریزی پروتئین) 917/0 می­باشد. شاخص ناپایداری پروتئین 94/24 و Aliphatic Index آن 98/124 تعیین گردید. این نتایج نشان می دهد که این پروتئین، جزء پروتئینهای پایدار و قطبی می­باشد.

آزمون فرضیه خنثی نشان داد که ژن مورد بررسیهمولوژی بالایی با همه گونه­های مورد بررسی دارد. این الگوی جانشینی نشان می­دهد در طول تکامل این گونه­ها از یکدیگر جدا نشده­اند (شک 2). بر اساس آنالیز انتخاب مدل جایگزینی، بهترین مدل جایگزینی برای آنالیز فیلوژنی، مدل JTT است. آنالیز تنوع ژنتیکی ژن مورد بررسی نشان داد که حدود 22 درصد از طول توالی ژن  اسید فسفاتاز ( ACP)جهشهای نوع جایگزینی رخ داده که در این میان حدود 8 درصد از طول توالی ژن دارای چندشکلیهای قابل فهم و کاربردی می­باشد. تنوع نوکلوتیدی در جمعیت مورد مطالعه در حدود 9 درصد می­باشد. نتایج نشان داد تاجیما D که به منظور بررسی اثر فشار انتخاب بر روی یک ژن به کار برده می­شود، در ژن مورد بررسی 36/0 است. با استفاده از تاجیما D که برای آزمون تئوری خنثی به کار برده می شود مشخص شد ژنهایی که تنوع فراوانی آللی آنها بالاست تاجیما D مثبت (بزرگتر از صفر) دارند و با انتخاب متعادل در جمعیت همراه هستند.

بحث

داده‌های به دست آمده در مطالعات اخیر نشان داده­اند که بیان  ژن سیتوکروم اکسیداز در برهمکنش مرکبات با  باکتری عامل میوه سبز مرکبات تغییر می کند (3، 7 و8). مطالعه دیگر نشان داد بیان این ژن در واکنش گیاهان حساس گوجه فرنگی به ویروس سر کوپه ای افزایش می یابد (6 ؛ 9 و 22). این ژن برای اولین بار از گیاه پرتقال جدا شد. شماره دسترسی به این ژن در بانک جهانی ژن  K775596 است. این اولین گزارش از جداسازی و همسانه سازی این ژن می باشد. 

آنالیز محتوی GC با استفاده از سرور ProtParam نشان داد درصد GC در ژن سیتوکروم اکسیداز پرتقال بالاست. هر چه درصد GC در ژن بیشتر باشد، پایداری ژن و در نتیجه پایداری پروتئین تولید شده از آن بیشتر خواهد بود، زیرا بین سیتوزین و گوانین سه پیوند هیدروژنی و بین آدنین و تیمین دو پیوند هیدروژنی برقرار است (14). باند هیدروژنی بیشتر باعث پایداری بیشتر ژن و پروتئین در برابر حرارت می­شود (12و 14).

تعیین خصوصیات فیزیکوشیمیایی پروتئینها می­تواند برای شناخت بهتر پروتئینها و شناسایی آنها بسیار سودمند باشد. با توجه به وزن مولکولی تخمین زده شده، این پروتئین جزء پروتئینهای با وزن مولکولی بالا می­باشد  (28). در نقطه pH ایزوالکتریک، آمینواسید و پروتئین بار خود را از دست می­دهد. یکی از کاربردهای نقطه ایزوالکتریک انتخاب روش مناسب برای خالص­سازی پروتئین مانند تبادل یونی و الکتروفروز ایزوالکتریک فوکوسینگ می­باشد (28 و 29). پروتئینهایی که در محدوده pH ایزوالکتریک قرار دارند مجموع بار مثبت و منفی رشته پپتیدی با یکدیگر برابر بوده و پروتئین توانایی نگهداری آب را ندارد و ناگزیر رسوب می­کند. شاخص ناپایداری پروتئینها بیانگر میزان پایداری آنها در لوله آزمایش در برابر حرارت است و این به نوع اسید آمینه­های موجود در آن بستگی دارد. شاخص ناپایداری محاسبه شده برای پروتئینها تعیین کرد پروتئینهایی که شاخص ناپایداری آنها کوچکتر از 40 باشند با ثبات و در غیر این صورت بی­ثبات خواهند بود (15). بر اساس نتایج این تحقیق پروتئین مورد بررسی جزء پروتئینهای پایدار می­باشد. پایدار بودن پروتئینها باعث حفظ ساختار آن در شرایط تنش مثل تنش حرارتی، حفظ ساختار سوم خود و در نتیجه حفظ عملکردشان در شرایط تنش می­شود (28 و 29). شاخص آلیفاتیک عبارت است از حجم نسبی پروتئین که از زنجیره­های آلیفاتیک (L و ، I، V،A) تشکیل شده­اند و به عنوان یک فاکتور مثبت در افزایش ثبات حرارتی پروتئینها به حساب می­آید و به همین دلیل در باکتریهای مقاوم به گرما، پروتئینها دارای شاخص آلیفاتیک بالایی می­باشند. پروتئینهایی با شاخص آلیفاتیک بسیار بالا (بالاتر از 100) در دامنه دمایی بسیار بالا از خود ثبات نشان می­دهند. در بررسی حاضر شاخص آلیفاتیک پروتئین مورد نظر پایداری نسبتاً بالایی را در برابر حرارت نشان داد، در نتیجه این پروتئین در دماهای بالا قادر به حفظ ساختار سوم و عملکرد خود می­باشد. متوسط هیدروپاتی کل (GRAVY) نشان­دهنده شاخص آبگریزی پروتئین است. در صورتی که GRAVY محاسبه شده برای یک پروتئین منفی باشد آن پروتئین غیر قطبی و در صورت مثبت بودن آن قطبی محسوب می­شود (27 و 28). پروتئین مورد بررسی در این تحقیق دارای GRAVY مثبت و قطبی می­باشد. حلالیت پروتئینهای قطبی بیشتر از حلالیت پروتئینهای غیرقطبی در مواد حلال بوده و در برابر حلالهای ویژه هر پروتئین، پروتئینهای غیر قطبی در وسط و پروتئینهای قطبی در قسمت بیرونی تجمع پیدا می­کنند (11 و 12).

بررسی فرضیه خنثی به منظور اندازه­گیری اختلاف مشاهده شده برای یک جفت توالی که با الگوی جایگزینی مشابه تکامل­یافته­اند، کاربرد دارد. پایه این تئوری مقایسه فرکانس نوکلئوتید یا آمینواسید در توالی جفتی و تعداد تفاوت مشاهده شده بین آنها می­باشد. این مدل جایگزینی فرآیندی را که در آن تغییر یک صفت بر اثر فشار انتخاب در یک دوره زمانی نشان می­دهد توصیف می­کند. این مدل در تفسیر درخت تکاملی در فیلوژنتیک و شاخه­بندی و شبیه­سازی توالی با تست روشها و الگوریتمهای دیگر کاربرد دارد. یکی از آزمونهایی که برای بررسی اثر فشار انتخاب بر روی یک ژن به کار برده می­شود تاجیما D D) (Tajima است. این آزمون بر اساس مقایسه تنوع نوکلئوتیدی حاصل از فراوانی آللی جایگاههای چند شکلی است (4 و 21). با استفاده از تاجیما D که برای آزمون تئوری خنثی به کار برده می شود مشخص شد ژنهایی که تنوع فراوانی آللی آنها بالاست تاجیما D مثبت (بزرگتر از صفر) دارند و با انتخاب متعادل در جمعیت همراه هستند، در حالی که، ژنهایی که تنوع فراوانی آللی آنها پایین است تاجیمای D منفی دارند و با فشار انتخابی همراه هستند که یک واریانت سودمند را در جمعیت جایگزین سایر واریانتها کرده است. ژنهایی که به تازگی در معرض انتخاب قرار گرفته­اند و آلل سودمند هنوز آلل اصلی در جمعیت نشده است، به سادگی با استفاده از تاجیما D قابل مطالعه نیستند (10 و 21).  مثبت بودن تاجیما D ژن مورد بررسی در بررسی تکامل آن مشخص کرد که هر جمعیت تحت تأثیر انتخاب متعادل قرار دارند و تنوع آللی در آن بالا می­باشد و فشار انتخابی بر روی آن مؤثر نبوده است .

معمول‌ترین مکان برای مارپیچ آلفا سطح هسته‌های پروتئین است که یک رابط را برای تعامل با محیط آبی بیرون ایجاد می‌کند. قسمت داخلی مارپیچ تمایل به داشتن آمینواسیدهای آب‌گریز و قسمت بیرون تمایل به داشتن آمینواسیدهای آب‌دوست دارد؛ بنابراین در طول مارپیچ از هر چهار آمینواسید، سه آمینواسید آب‌گریز خواهند بود. سایر آمینواسیدهای موجود در هسته پروتئین و یا داخل غشای سلولی خاصیت آب‌گریزی دارند (2، 14 و 18). به طور کلی مارپیچهای قرار گرفته در سطح، تعداد کمتری آمینواسید آب‌گریز دارند. از این ویژگی می‌توان در پیش‌بینی ساختار پروتئینها کمک گرفت. برای مثال نواحی با مقادیر بیشتر از آلانین، گلوتامین اسید، لوسین و متیونین و مقادیر کمتر از پرولین، گلیسین، تیروزین و سرین تمایل به تشکیل مارپیچ آلفا دارند (1 و 14). ساختار صفحه‌های بتا، ساختار دوم بسیارکشیده و چین‌دار می‌باشد. یکی از تفاوتهای مهم صفحه‌های بتا با مارپیچ آلفا این است که اسیدآمینه‌هایی که معمولاً در ساختار اول زنجیره پروتئینی با فاصله زیاد از هم قرارگرفته‌اند، برای تشکیل این ساختار در مجاورت یکدیگر قرار می‌گیرند، بنابراین صفحه‌های بتا تمایل به سختی داشته و انعطاف‌پذیری ناچیزی دارند (18 و 29). پیوندهای هیدروژنی بین‌رشته‌ای که میان گروههای CO یک رشته بتا و NH رشته بتای مجاور ایجاد می‌شوند، به صفحات بتا پایداری می‌بخشند و باعث می­شوند که این صفحات ظاهری زیگزاگ داشته باشند (16 و 19). بررسی ساختار دوم پروتئین مورد بررسی نشان داد زنجیره α این پروتئین کمتر از زنجیره بتای آن است و این پروتئین دارای انعطاف کمتر بوده و حلالیت کمتری دارد. انعطاف­پذیری کمتر باعث پایداری بیشتر پروتئین می­شود، در نتیجه می‍توان گفت که این پروتئین دارای پایداری می­باشد (30، 33 و 34). این خصوصیات با خصوصیات پروتئینهایی که در مقاومت نقش دارند سازگار است (12؛ 19 و 25).

1- خلیلی سعید، جهانگیری ابولفضل، امانی جعفر، هاتف سلمانیان علی  (1393) کاربرد بیوانفورماتیک در مطالعات ایمنی‌شناسی. پژوهشهای سلولی مولکولی، 27 (2): 192-210.

2- وهابی مهرو، صفریان شاهرخ، زرگر سید جلال،  علی اصغری لعیا  (1393) مطالعه‌ی کمی بیان ژن‌های دخیل در مسیر‌‌های بقاء سلولی و اتوفاژی در رده‌ی سلولی T-47D با ﺗﺄکید بر اعمال مقاومت سرمایی در سلول‌ها در حضور DMSO. پژوهشهای سلولی مولکولی، 27 (3): 438-452.

 

3- Alexandre G, Bally R, Taylor B L and Zhulin IB, 1999. Loss of Cytochrome c Oxidase Activity and Acquisition of Resistance to Quinone Analogs in a Laccase-Positive Variant of Azospirillum lipoferum. J. Bacteriol.  181 (21): 6730-6738.

4- Carlson CS, Thomas DJ, Eberle MA, Swanson JE, Livingston RJ, Rieder MJ, Nickerson DA, 2005. Genomic regions exhibiting positive selection identified from dense genotype data. Genome Research, 15 (11): 1553-1565.

5- Doyle JJ and Doyle JL, 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12:13–15.

6- Garcia-Horsman JA, Barquera B, Rumbley J, Ma J, Gennis RB, 1994. The superfamily of heme-copper respiratory oxidases. J. Bacteriol. 176: 5587-600.

7- Ghayeb Zamharir M, 2014. Study of host- pathogen interaction in citrus Infection by citrus greening. Final report of project No. 45548.

8- Gholampour H, Ghayeb Zamharir M, Karimi J, Farrokhi N, Alizadeh A and Taheri P,2015. Identification of genes differentially expressed during interaction of Grapefruit infected with Candidatus Liberibacter asiaticus in disease late stage. J. phytopathology, 162 (11-12): 811-819.

9-  Hafez EE, Moustafa MFM, 2011. Differential expression of cytochrome oxidase and ALY-family genes in resistant and susceptible tomato cultivars (Solanum lycopersicum) inoculated with Tomato bushy stunt virus. JGEB, 9(1): 43-49.

10- Hamblin MT, Thompson EE and Rienzo D, 2002. Complex signatures of natural selection at the Duffy blood group locus. A. Am. J. Hum. Genet., 70 (2): 369-383.

11- Huang G, Zhang L and Birch RG, 2000. Characterization of the acyl carrier protein gene and the fab gene locus in Xanthomonas albilineans. FEMS Microbiol. Lett., 193 1: 129-136.

12- Juszczuk IM and Rychter AM, 2003. Alternative oxidase in higher plants. Acta Biochemica polonica, 50 (4):1257-1271.

13- Kosakyan A, Heger TJ, Leander BS, Todorov M, Mitchell EA and Lara E, 2012. "COI barcoding of Nebelid testate amoebae (Amoebozoa: Arcellinida): extensive cryptic diversity and redefinition of the Hyalospheniidae Schultze". Protist. 163 (3): 415–34.

14- Kyte J, Doolittle RF, 1982. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. mol. Biology, 157:105–132.

15- Pettersen EF, Goddard TD, Huang CC, Couch GS, Greenblatt DM, Meng EC, Ferrin TE, 2004. UCSF Chimera a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of computational chemistry. 25(13): 1605-1612.

16-  Quesada, A, Guijo M I , Merchán F,  Blázquez B, Igeño M I  and Blasco R , 2007. Essential Role of Cytochrome bd-Related Oxidase in Cyanide Resistance of Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344. Appl. Environ. Microbiol.,  73 (16): 5118-5124.

17- Saraste M, Castresana J, Higgins DG, Lubben M (1994). "Evolution of cytochrome oxidase, an enzyme older than atmospheric oxygen". EMBO J., 13 (11): 2516–2525. 

18- Slabinski L, 2007. The challenge of protein structure determination--lessons from structural genomics. Protein Sci.,16:2472–2482.

19-  Sluse FE  and Jarmuszkiewicz W, 1998.  Alternative oxidase in the branched mitochondrial respiratory network: an overview on structure, function, regulation, and role.  Braz. J. Med. Biol. Res., 31(6): 733-747.

20-  Taheri P, Ghayeb Zamharir M, Karimi J, Farrokhi N, Alizadeh A and Gholampour H,2015.Study of gene expression pattern in Citrus grandis plants infected by Candidatus Liberibacter asiaticus at symptoms developing in sensitive host. J. Ent. and phytopathol., 83 (1): 15-26.

21- Tajima F, 1989. "Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism"Genetics. 123 (3): 585–95.

22- Tsukihara T, Aoyama H, Yamashita E, 1996. "The whole structure of the 13-subunit oxidized cytochrome c oxidase at 2.8 A". Science., 272 (5265): 1136–44.

23- Vanlerberghe  GC, 2013. Alternative Oxidase: A Mitochondrial Respiratory Pathway to Maintain Metabolic and Signaling Homeostasis during Abiotic and Biotic Stress in Plants. Int. J. Mol. Sci., 14: 6805-6847.

24-  Wagner AM and Krab K. 1995. The alternative respiration pathway in plants: role and regulation. Physiol. Plant, 95: 318 – 325.

25-  Wagner AM, 1995. A role for active oxygen species as second messengers in the induction of alternative oxidase gene expression in Petunia hybrida cells. FEBS Lett., 368: 339– 342.

26- Wang H, Huang J, Liang X and Bi Y, 2012. Involvement of hydrogen peroxide, calcium, and ethylene in the induction of the alternative pathway in chillingstressed Arabidopsis callus. Planta, 235: 53 – 67.

27- Wang J and Vanlerberghe GC, 2013. A lack of mitochondrial alternative oxidase compromises capacity to recover from severe drought stress. Physiol. Plant, doi: 10.1111/ppl.12059.

28- Volkamer A, Kuhn D, Rippmann F, Rarey M, 2013. Predicting enzymatic function from global binding site descriptors. Proteins, 81: 479–489.

29- Yang G X, Li X, Snyder M, 2012. Investigating metabolite-protein interactions: an overview of available techniques. Methods, 57: 459–466. 

30- Yabuuchi H, Niijima S, Takematsu H, Ida T, Hirokawa T, Hara T, 2011. Analysis of multiple compound-protein interactions reveals novel bioactive molecules. Mol. Syst. Biol., 7: 472–472.

31- Zsigmond L, Rigo´ G, Szarka A, Sze´kely G, Otvo¨s K, Darula Z and Medzihradszky KF, 2008. Arabidopsis PPR40 connects abiotic stress responses to mitochondrial electron transport. Plant Physiol., 146: 1721–1737.

32- Zhao J, 2007. Interplay among nitric oxide and reactive oxygen species. A complex network determining cell survival or death. Plant Signal Behav., 2: 544– 547.

33-  Zhou GP, 2011. "The disposition of the LZCC protein residues in wenxiang diagram provides new insights into the protein-protein interaction mechanism".   J. Theor. Biology, 284 (1): 142–8. 

34-  Zhou GP, 2011. "The Structural Determinations of the Leucine Zipper Coiled-Coil Domains of the cGMP-Dependent Protein Kinase I alpha and its Interaction with the Myosin Binding Subunit of the Myosin Light Chains Phosphase". Protein and  Peptide Lett., 18 (10): 966–978.