نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه مهندسی مکانیک، دانشکده فنی و مهندسی، دانشگاه حکیم سبزواری، سبزوار

2 دانشگاه حکیم سبزواری دانشکده فنی و مهندسی

چکیده

تایتین طویل‌ترین پروتئین بدن است که در میوفیبریل‌های عضله‌ها‌ی قلبی و اسکلتی یافت می‌شود. این پروتئین با طولی حدود یک میکرومتر شامل ناحیه‌های PEVK(دربردارنده‌ی آمینو اسیدهای پرولین، گلوتامیک اسید، والین و لیزین)، قلمروهای ایمونوگلوبولین و فیبرونکتین است. در عضلات، تایتین دارای خاصیت الاستیک منحصر به فردی در ناحیه‌ی باند I در سارکومر بوده واز این رو مسئول بازگرداندن عضله به طول استراحت خود در حین انقباض‌های برون گرا است.I27 (بیست و هفتمین قلمروی ایمونوگلوبولین) به عنوان یکی از ناحیه‌های پر اهمیت تایتین معرفی شده و از ویژگی‌های مهم این ناحیه اتصال با یون کلسیم است. حضور یون کلسیم در I27، این ناحیه را باردار کرده و سبب تغییر پی اچ می شود. در این پژوهش با استفاده از شبیه سازی دینامیک مولکولی هدایت شده، تغییرات نیروی باز شدگی برای قلمروی I27 با در نظر گرفتن پی اچ‌های مختلف در سه حالت خنثی، اسیدی و بازی بررسی شده است. نتایج نشان دادند که نیروی بازشدگی قلمرو I27 به صورت قابل توجهی وابسته به تغییرات پی اچ بوده و از این رو با افزایش و یا کاهش مقدار پی اچ و فاصله گرفتن از حالت خنثی مقدار آن کاهش می یابد. بدین ترتیب که در حالت خنثی بیشترین نیرو برای شکستن پیوندهای هیدروژنی و آغاز فرآیند بازشدگی مورد نیاز است. با توجه به نتیجه حاصله از این پژوهش، می توان در صورت سخت‌تر شدن بیش از حد تایتین و بروز مشکل در باز شدگی، با تغییرات پی اچ در محدوده‌ی موردنظر عملکرد مناسب‌تری برای تایتین ایجاد نمود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The effect of pH changes on the unfolding force of titin immunoglobulin domain I27 using steered molecular dynamic simulation

نویسنده [English]

  • Mohaddese Abidi 1

1 Department of Mechanical Engineering, Hakim Sabzevari University, Sabzevar, Iran

چکیده [English]

Titin is the longest protein found in striated skeletal and cardiac muscle myofibrils. This protein with a length of about 1µm, has multiple domains consisting of PEVK region (proline, glutamic acid, valine, and lysine residues), and immunoglobulin-like (Ig) and fibronectin domains. In muscles, titin owns unique elastic properties in the I-band region and it is responsible for restoration of muscle to its slack length during the passive contractions. I27 (27th immunoglobulin domain) is one of the important regions of titin which has been studied extensively by researchers. An important feature of this region is the connection with calcium ion which charges the region and causes pH to change. In this paper the unfolding force of I27 domain has been investigated by considering various pHs in three states of neutral, acidic and basic, using steered molecular dynamic simulations. The results showed that unfolding stiffness of I27 domain depends significantly on pH changes. It decreases by increasing or decreasing pH value and getting away from the neutral state. In the neutral state the highest value of force is needed to break the hydrogen bonds and start the unfolding process. According to the results, titin’s performance can be improved by changing pH. This proves useful in cases where titin is stiffer than usual or there is a malfunction in the unfolding process.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Titin
  • pH changes
  • Steered molecular dynamic simulation
  • Unfolding force

بررسی تأثیر تغییرات پی اچ بر نیروی بازشدگی بیست و هفتمین قلمروی ایمونوگلوبولین پروتئین تایتین با استفاده از شبیه سازی دینامیک مولکولی هدایت شده

محدثه عبیدی و رضا سهیلی­فرد*

ایران، سبزوار، دانشگاه حکیم سبزواری، دانشکده فنی و مهندسی، گروه مهندسی مکانیک

تایخ دریافت: 12/7/96                   تاریخ پذیرش: 28/8/96

چکیده

تایتین طویل­ترین پروتئین بدن است که در میوفیبریلهای عضله­ها­ی قلبی و اسکلتی یافت می­شود. این پروتئین با طولی حدود یک میکرومتر شامل ناحیه­های  PEVK(دربردارنده آمینو اسیدهای پرولین، گلوتامیک اسید، والین و لیزین)، قلمروهای ایمونوگلوبولین و فیبرونکتین است. در عضلات، تایتین دارای خاصیت الاستیک منحصر به فردی در ناحیه باند I در سارکومر بوده واز این رو مسئول بازگرداندن عضله به طول استراحت خود در حین انقباضهای برون گراست. I27 (بیست و هفتمین قلمروی ایمونوگلوبولین) به عنوان یکی از ناحیه­های پر اهمیت تایتین معرفی شده و از ویژگیهای مهم این ناحیه اتصال با یون کلسیم است. حضور یون کلسیم در I27، این ناحیه را باردار کرده و  سبب تغییر پی اچ می شود. در این پژوهش با استفاده از شبیه سازی دینامیک مولکولی هدایت شده، تغییرات نیروی باز شدگی برای قلمروی I27 با در نظر گرفتن پی اچ­های مختلف در سه حالت خنثی،  اسیدی و بازی بررسی شده است. نتایج نشان دادند که نیروی بازشدگی قلمرو I27 به صورت قابل توجهی وابسته به تغییرات پی اچ بوده و از این رو با افزایش و یا کاهش مقدار پی اچ و فاصله گرفتن از حالت خنثی مقدار آن کاهش می یابد. بدین ترتیب که در حالت خنثی بیشترین نیرو برای شکستن پیوندهای هیدروژنی و آغاز فرآیند بازشدگی مورد نیاز است. با توجه به نتیجه حاصله از این پژوهش، می توان در صورت سخت­تر شدن بیش از حد تایتین و بروز مشکل در باز شدگی، با تغییرات پی اچ در محدوده موردنظر عملکرد مناسب­تری برای تایتین ایجاد نمود.

واژه­های کلیدی: تایتین، تغییرات پی اچ، شبیه سازی دینامیک مولکولی هدایت شده، نیروی باز شدگی

* نویسنده مسئول، تلفن05144012817 ، پست الکترونیکی: r.soheilifard@hsu.ac.ir

مقدمه

 

کوچکترین واحد انقباضی عضله سارکومر است که می­توان از آن به عنوان عامل اصلی حرکت تمام بدن یاد کرد. رشته­های ضخیم و نازک (اکتین و میوزین) که بخشی از ساختار سارکومر را تشکیل می­دهند به طور مؤثری در عمل انقباض ایفای نقش می­کنند (شکل1). علاوه بر دو رشته ذکر شده، پروتئین دیگری به نام تایتین در سارکومر وجود دارد که با خاصیت الاستیکی که به عضله می­بخشد می­تواند در عمل انقباض بسیار مفید باشد(6). تایتین( در برخی مقالات از آن به عنوان کانکتین یاد شده است) یک پروتئین فنر مانند قابل تنظیم غول پیکری است که در سارکومر عضلات قلبی و اسکلتی مخطط یافت می­شود. در حقیقت زمانی عملکرد تایتین آشکار می­شود که عضله کشیده شده و طول آن افزایش می­یابد؛ در این زمان نیروی غیر فعال عضله توسط تایتین توسعه یافته تا بتواند عضله را به طول استراحت خود بازگرداند(10). این پروتئین طویل بیش از 30000 آمینو اسید دارد و در نیمی از طول سارکومر بین خطوط M و صفحات Z جای گرفته است. هنگامی که عضله کشیده می­شود، تایتین که بین صفحه Z و خط M نگه داشته شده با اعمال یک نیروی غیر فعال اجزای سارکومر را به صورت یکنواختی ثابت و پایدار نگه می­دارد(16).

 

شکل1- ساختار سارکومر و قسمت­های تشکیل دهنده­ی آن. محل رشته­های اکتین و میوزین( رشته­های نازک وضخیم) و نواحی باندI وA

همچنین تایتین در برخی از ناحیه­های خود قادر به برقراری اتصال با یون کلسیم است. مشاهدات انجام شده توسط لبیت و همکارانش در سال 2003 نشان داد که اتصال یون کلسیم به ناحیه ناشناخته PEVK شامل آمینو اسیدهای پرولین، گلوتامیک اسید، والین و لیزین، مقاومت خمشی این ناحیه را کاهش داده، در نتیجه سبب خم شدن راحت­تر آن و پیچیدگی به دور رشته نازک و انعطاف پذیر اکتین با شعاعی حدود 7 نانومتر شده است(4 و 14). شکل 2 محل قرار گیری تایتین در سارکومر و اجزای تشکیل دهنده آن را نشان می­دهد.

 

شکل2-  شماتیکی از پروتئین تایتین و محل قرار گرفتن آن در سارکومر. ناحیه­های PEVK و ایمونوگلوبولین(Ig) به ترتیب با فنرهای روشن و تیره نشان داده شده که نمایانگر الاستیک بودن ساختار تایتین هستند. با وجود این بخشی از تایتین که در باند I قرار گرفته به علت عدم حضور فیلامنت ضخیم از کشسانی بیشتری برخوردار است.

به سبب نقش مهم تایتین در عملکرد عضله­، بررسی این پروتئین شمار زیادی از تحقیقات در زمینه­های مختلف از سال 1998 تا 2016 را به خود اختصاص می­دهد که به طور کلی این پژوهشها می­توانند در دو دسته مشاهدات آزمایشگاهی (به وسیله میکروسکوپ نیروی اتمی و لیزر نوری) (23) و پژوهشهای محاسباتی با استفاده از روش دینامیک مولکولی طبقه بندی شوند. از جمله برخی از آنها می­توان به مطالعه نیروی بیشینه بازشدگی  قلمروها و نواحی مختلف تاخورده تایتین(9،11،16و17)، تأثیر قرار گرفتن در معرض دماهای مختلف(5و19)، انتخاب جهتهای مختلف برای بازشدگی تاخوردگی قلمروها و تأثیر آن روی سختی(20و21) اشاره کرد.

با وجود تعدد قلمروها و نواحی تشکیل دهنده این پروتئین عظیم، برخی از نواحی به سبب عملکرد ویژه و یا اهمیت مکانی که در آن واقع شده­اند مورد توجه بسیاری از محققان قرار گرفته و از جهات مختلف بررسی شدند. به عنوان مثال می­توان از ناحیه PEVK یاد کرد. این ناحیه در قسمت باند  Iسارکومر واقع است و در مقایسه با سایر قلمروهای تایتین بیشترین خاصیت الاستیک را ایجاد می­کند. به علت ناشناخته بودن ساختار PEVK، مطالعاتی که تاکنون روی این ناحیه صورت گرفته به صورت آزمایشگاهی بوده است.

این ناحیه می­تواند به مقدار زیادی باردار شود و این خصیصه سبب افزایش یا کاهش پی اچ و فاصله گرفتن مقدار آن از حالت خنثی شده و آن را به حالت اسیدی یا بازی سوق می­دهد. با توجه به این امر تلاشهای زیادی برای بررسی تأثیر پی اچ روی سختی مکانیکی آن انجام شده است. نتایج حاصل از آزمایشها نشان دادند که سختی مکانیکی PEVK با کم و زیاد شدن مقدار پی اچ کاهش می­یابد(15). بررسی دیگری مرتبط با تغییرات پی اچ به صورت تئوری روی قلمروی فیبرونکتین3 توسط کرایگ و همکارانش در سال 2004 انجام شده است (7). در این مورد با استفاده از شبیه سازی دینامیک مولکولی هدایت شده مقاومت مکانیکی این ناحیه در طی باز شدن قلمرو مورد بررسی قرار گرفت. در ابتدا برای کاهش پی اچ و ایجاد حالت اسیدی، آمینو اسیدهای آسپارتیک اسید 7 و23 و گلوتامیک اسید 9 طبق مقدار لگاریتم منفی ثابت تفکیک اسیدی خود پروتون دار شده و سپس تحت شبیه سازی دینامیک مولکولی هدایت شده قرار گرفتند. نتایج حاصل از شبیه سازیها نشان دادند که این بار بر خلاف ناحیه PEVK با کاهش پی اچ میزان سختی باز شدگی افزایش یافته و در پی اچ­های پایین­تر نیروی بیشتری برای شروع شکسته شدن پیوندهای هیدروژنی نیاز است(7).

ناحیه دیگری از پروتئین غول پیکر تایتین که مورد توجه بسیاری از محققین بوده و همواره در راستای مطالعات تایتین استفاده شده قلمرو  I27(27 امین قلمروی ایمونوگلوبولین) تایتین است که در انتهای باند I سارکومر، در قسمت پایینی قلمروهای ایمونوگلوبولین و در مجاورت ناحیه PEVK جای می­گیرد. علت انتخاب این ناحیه برای تجزیه و تحلیلهای مرتبط با تایتین موقعیت مکانی است که در آن قرار گرفته است(22).  به طور کلی می­توان گفت اکثر مطالعات صورت گرفته در رابطه با پروتئین تایتین مربوط به قلمرو I27 می­باشد. از جمله این بررسیها می­توان به محاسبه نیرو در آغاز فرآیند باز شدگی جهت شکستن اولین پیوندهای هیدروژنی در سرعتهای متفاوت بازشدگی که برای اولین بار توسط لو و همکارانش در سال 1998  صورت گرفت (16) اشاره کرد. سایر مواردی که در آنها به مطالعه I27 پرداخته شده شامل بررسی تأثیر عوامل گوناگون بر سختی و عملکرد آن می­شود. در سالهای 2008 و 2011 بررسی تأثیر دما بر بازشدن مکانیکی این قلمرو به ترتیب به وسیله تنیقوچی و همکارانش و بانگ و همکارانش صورت پذیرفت (5و19) همچنین تأثیر جهت اعمال نیرو در فرآیند بازشدگی I27 به هر دو روش محاسباتی و آزمایشگاهی به ترتیب به وسیله طوفانی و همکاران و تنیقوچی و همکاران در سالهای 2006 و 2012 انجام گرفت که بر اساس این مطالعات I27 در اثر اعمال نیرو در راستای دو انتهای زنجیره دارای مقاومت کمتری برای آغاز فرآیند بازشدگی است(20و21).

با توجه به بررسی انجام شده به وسیله دووال و همکارانش در سال 2013 تأثیر حضور یون کلسیم روی سختی ناحیه I27 به صورت آزمایشگاهی تحلیل شد (8) که با توجه به این امر یعنی امکان حضور یون کلسیم این نظریه وجود دارد که به طریقی سبب بار دار شدن I27 شده و در نتیجه مقدار پی اچ تغییر می­کند. همچنین این ناحیه شامل تعدادی از آمینو اسیدهای گلوتامیک اسید، آسپارتیک اسید، هیستیدین، لیزین و سیستئین با بارهای منفی و مثبت است و بنابراین قابلیت باردار شدن را خواهد داشت.

در پژوهش حاضر به منظور یافتن تأثیر تغییر پی اچ بر روی نیروی باز شدگی قلمرو I27، شبیه سازی دینامیک مولکولی هدایت شده برای حالات مختلف انجام گرفته است. در این شبیه سازی علاوه بر در نظر گرفتن دو حالت اسیدی و خنثی، حالت بازی که احتمال دارد در اثر باردار شدن آمینو اسید لیزین و سیستئین صورت گیرد نیز بررسی شده است. مورد دیگری که این مطالعه را حائز اهمیت می­کند بررسی تأثیر همزمان تغییر پی­ اچ و سرعت کشیدگی است. به طور کلی هدف از انجام این پژوهش بررسی بیشینه نیروی لازم برای باز شدن قلمروی I27 در مقایسه با ناحیه PEVK در پی اچ­های متفاوت است به گونه­ای که بتوان گفت قلمروهای مجاور ناحیه PEVK دارای خواص و ویژگیهای مشابهی با این ناحیه هستند یا خیر؟

مواد و روشها

در این مطالعه نیروی باز شدگی قلمرو I27 در پی اچ­های متفاوت با استفاده از روش دینامیک مولکولی هدایت شده مورد بررسی قرار گرفته است. دینامیک مولکولی هدایت شده روشی است که نخستین بار در سال 1997 معرفی شده و در ابتدا به عنوان یک ابزار با ارزش در آشکار سازی جزئیات جدا شدن پروتئین از زیرلایه و به دنبال آن مطالعه بازشدگی پروتئینها در سطح اتمی مورد استفاده قرار گرفته است(12 و 13).

در این پژوهش، کلیه شبیه­سازیها به روش دینامیک مولکولی هدایت شده در فضای نرم افزار GROMACS نسخه 4.6.5 و با استفاده از میدان نیروی CHARMM27 صورت گرفته است. بدین منظور ساختار کریستالی مورد نیاز قلمروی I27 از بانک داده پروتئین (PDB code: 1TIT) استخراج شد. شکل 3، ساختار این قلمرو را که از نرم افزارChem Office  به دست آمده نشان می­دهد. به منظور سهولت در انجام شبیه سازی دینامیک مولکولی هدایت شده، با استفاده از نرم افزار PYMOL ابتدا پروتئین به صورتی چرخانده شد که دو انتهای زنجیره در راستای محور طولی قرار گیرند و پس از آن فرآیند بازشدگی و کشیدگی پروتئین در این راستا انجام پذیرفت.

 

شکل3- ساختار قلمرو I27 پروتئین تایتین به دست آمده از کریستالوگرافی اشعه­ی ایکس با استفاده از نرم افزار Chem Office

به طور کلی از بین 20 آمینو اسید موجود در ساختار پروتئینها، برخی به سبب داشتن قابلیت باردار شدن می‍توانند خاصیتهای اسیدی و بازی را به پروتئین دهند. آمینو اسیدهای آسپارتیک اسید، گلوتامیک اسید و هیستیدین دارای بار منفی بوده و با جذب پروتون با توجه به مقدار لگاریتم منفی ثابت تفکیک اسیدی خود(pKa) سبب ایجاد خاصیت اسیدی می­شوند. همچنین آمینو اسیدهای لیزین و آرجینین نیز دارای بار مثبت بوده و خاصیت بازی ایجاد می­کنند(18). با توجه به این امر که قلمروی I27 دارای تمامی این آمینو اسیدها بجز آرجنین است با مراجعه به سرور PROPKA ( واقع در سایت http://nbcr-222.ucsd.edu/pdb2pqr_2.0.0/) و مشاهده مقادیر pKa ، هر کدام از این آمینو اسیدها متناسب با مقدار پی اچ مورد نظر برای شبیه سازی در نرم افزار گرومکس پروتون­دار شدند (شکل 4).

در این بررسی تمامی آمینواسیدهای آسپارتیک ، گلوتامیک و هیستیدین که مقدار pKa برای آنها بزرگ­تر از 3 و 4 بوده برای رسیدن به حالت اسیدی به ترتیب با پی اچ 3 و 4، پروتون­دار شدند. برای شبیه سازی حالت بازی نیز ، تعدادی از آمینو اسیدهای لیزین با مقدار pKa کمتر از 12به منظور ایجاد خاصیت بازی پروتون از دست دادند( در این حالت به علت کم بودن تعداد آمینواسیدهای سیستئین از باردار کردن آنها صرف نظر شده است).

به منظور دقت بیشتر در رسیدن به پی اچ مورد نظر در شبیه سازی، آمینو اسیدهای پایانه­های N و C نیز با توجه به مقادیر لگاریتم منفی ثابت تفکیک اسیدی مورد ارزیابی قرار گرفته و باردار و یا خنثی شدند. پس از آن هر سه مدل( خنثی، اسیدی و بازی) در سلولی به ابعاد 6´8´40 نانومتر قرارگرفته و در مدل آب Tip3p به صورت محلول درآمدند و محلول با اضافه کردن یونهای سدیم و کلر کاملاً بدون بار شد. سپس انرژی هر سه شبیه سازی به منظور حذف کرنشهای اضافی با استفاده از الگوریتم Steepest decent کمینه شدند. در مرحله بعد هر سه سیستم با شرایط یکسان به مدت 110 پیکوثانیه با وجود ترموستات دما و فشار برندسن به روش NPT و ثابت بودن تمام اتمهای سنگین در دمای 300 کلوین متعادل شدند.

گام دوم متعادل سازی به مدت 5/1 نانوثانیه و با برداشتن تمام قیود و تنها با ثابت کردن اتمهای آلفا کربن آمینو اسیدهای اول و آخر زنجیره صورت گرفت. این مرحله به منظور اطمینان از صحت تعادل برای چند مورد از شبیه سازیها صورت گرفت که با توجه به متعادل شدن سیستم در زمانی کمتر و حجم بالای محاسبات برای حالتهای بعدی شبیه سازی به جای 5/1 نانوثانیه گام دوم نیز در 110 پیکوثانیه انجام شد.

 

 

 

شکل4-  نمودارهای لگاریتم منفی ثابت تفکیک اسیدی(pKa) بر حسب شماره آمینواسید برای I27 به وسیله سرور PROPKA

 

شکلهای 5 و 6 و 7 به ترتیب نمودارهای دما، فشار و تغییرات انحراف معیار جذر میانگین مربعات بر حسب زمان را برای حالت خنثی نشان می­دهند. همان­طور که در شکل 5 مشاهده می­شود دما پس از گذشت مدت زمان حدوداً 2 پیکو ثانیه به مقدار ثابت 300 کلوین رسیده و در همین دما باقی می­ماند. با توجه به شکل 6 نیز فشار پس از گذشت زمان کوتاهی حول مقدار ثابتی نوسان می­کند. با مشاهده شکل 7 نیز می­توان تغییرات ساختاری I27 را قبل و بعد از متعادل سازی مشاهده کرد. بدین ترتیب که در زمانی بسیار کوتاه­تر از 5/1 نانو ثانیه تعادل مورد نظر به دست می­آید. این نتیجه کاهش زمان متعادل سازی را توجیه می­کند.

 

شکل5-  نمودار دما بر حسب زمان در گام متعادل سازی برای 1610 پیکوثانیه برای حالت خنثی

پس از اطمینان از صحت تعادل سیستمها، شبیه سازی دینامیک مولکولی هدایت شده با به کارگیری روش Umbrella، الگوریتم LINCS برای مقید کردن تمامی پیوندها، شعاع قطع 3/1 نانومتر برای پیوندهای واندروالس و به کارگیری روش PME برای برهم کنشهای الکترواستاتیکی انجام شد. گام زمانی برای کلیه شبیه سازیها 1 فمتوثانیه در نظر گرفته شد و شبیه سازی با ثابت کردن اتم آلفا کربن آمینو اسید یک انتهای زنجیره I27 (Leu1) در ابتدای زنجیره و کشیدن اتم آلفا کربن آمینو اسید دیگری در انتهای زنجیره (Leu89)  با نیروی حاصل از یک فنر هارمونیک با سختی  10 kBT/ 14أ…2">   صورت گرفت (16). همچنین در این شبیه سازیها تأثیر سرعتهای کشش 5، 2و 5/0 آنگستروم بر پیکوثانیه بر هر 4 حالت (پی اچ:3، 4، 7و 12) مورد ارزیابی قرار گرفت. 

 

شکل6- نمودار فشار بر حسب زمان در گام متعادل سازی برای 1610 پیکوثانیه برای حالت خنثی

 

شکل7-  نمودار تغییرات انحراف معیار جذر میانگین مربعات(RMSD) بر حسب زمان برای گام متعادل سازی در زمان 1610 پیکوثانیه برای حالت خنثی

نتایج

به منظور یافتن تأثیر تغییرات مقدار پی اچ روی میزان نیروی بازشدگی 27 امین قلمرو پروتئین تایتین در یک باز شدگی کامل و در نرخهای مختلف کشیدگی 12 شبیه سازی هدایت شده صورت گرفت که شرایط آنها به اختصار در جدول 1 نشان داده شده است. در تمامی این شبیه سازیها فنر هارمونیک به یک انتها متصل بوده و انتهای دیگر زنجیره تا خورده ثابت نگه داشته شده است (شکل 8).  

جدول 1- شرایط و ویژگیهای شبیه سازی

سرعت کشیدگی(*)

پی اچ

شبیه سازی

0.5

3

I27

2

3

I27

5

3

I27

0.5

4

I27

2

4

I27

5

4

I27

0.5

7

I27

2

7

I27

5

7

I27

0.5

12

I27

2

12

I27

5

12

I27

(*) بر حسب آنگستروم بر پیکوثانیه

 

شکل8- ساختار قلمرو I27 پروتئین تایتین. مکانهای کشیدگی و ثابت شدن به ترتیب با فلش و خطوط مورب در سمت چپ مشخص شده­اند.

قلمروی I27 دارای ساختار تاخورده­ای است که از کنار هم قرار گرفتن صفحات بتا ایجاد شده است(14). صفحه بتا دومین حالت برای ساختار دوم پروتئینهاست که از تعدادی رشته‌های بتا که به طور جانبی به وسیله ۳ یا تعداد بیش‌تری پیوند هیدروژنی به هم وصل شده‌اند تشکیل شده اند. عموماً این صفحات حالتی تابیده و چین‌دار دارند(3).

در ابتدای فرآیند کشیدگی نیروی ایجاد شده در I27 به منظور غلبه بر نیروی ناشی از فنر متصل به آمینو اسید لیوسین 89، همراه با افزایش نیروی اعمالی فنر افزایش یافته تا سرانجام به بیشترین مقدار خود می­رسد. پس از آن نیرو کاهش یافته و حدوداً در مقدار ثابتی نوسان می­کند. با این حال مسئله­ای که در این­جا حائز اهمیت است بررسی میزان بیشینه نیروی مورد نیاز در هنگام آغاز فرآیند باز شدگی در 12 شبیه سازی انجام شده است. بدین منظور نمودارهای نیرو بر حسب جا به جایی برای هر 12 حالت رسم شده است. شکل 9 نمودارهای نیرو بر حسب جابه جایی را برای پی اچ 7 ( حالت خنثی) در سرعتهای مختلف کشیدگی نشان می­دهد.

 

شکل9- نمودارهای نیرو بر حسب جابه جایی در سرعتهای مختلف کشیدگی برای پی اچ 7

با  توجه به رفتار نمودارها در سرعتهای متفاوت در شکل 9 به راحتی روند افزایش بیشینه نیرو در اثر افزایش سرعت مشاهده می­شود. در حقیقت این امر به سبب وجود خاصیت ویسکوالاستیک در قلمروهای تایتین به خصوص در نواحی PEVK و I27 که در مجاورت آن قرار گرفته است، می­باشد(16). با افزایش سرعت کشیدگی سختی پروتئین  افزایش یافته و از این­ رو نیروی بیشتری برای شکستن اولین پیوندهای هیدروژنی مورد نیاز است. علاوه بر این بر افزایش نیروی بیشینه، شیب نمودارها نیز به ترتیب افزایش سرعت بیشتر شده و این نشانگر افزایش سختی پروتئین می­باشد.

شکل10 نمودار نیرو بر حسب جا به جایی برای چهار پی اچ 3، 4، 7 و 12 در سرعت کشیدگی 5/0 آنگستروم بر پیکوثانیه و برای طول باز شدگی 12 نانومتر را نشان می‍دهد. با توجه به این نمودار در هر 4 مورد میزان جا به جایی از یک نقطه مشترک که همان فاصله اولیه بین دو آمینو اسید ثابت و کشیده شده است آغاز شده و در یک شیب تقریباً ثابت به بیشینه نیروی خود می­رسند.

 

شکل10- نمودارهای نیرو بر حسب جابه جایی برای 4 پی اچ متفاوت در سرعت 5/0 آنگستروم بر پیکوثانیه

با توجه به شکل10، نمودارها دارای بیشینه نیروهای متفاوتی هستند. در پی اچ 7، که همان حالت خنثی است شاهد بیشترین بیشینه نیرو بوده و در پی اچ های اسیدی و بازی بیشینه نیرو مقدار کمتری را دارا هستند. این بررسی به لحاظ کیفی در تطابق با نتیجه­ای است که لینک و همکارانش در خصوص ناحیه PEVK در سال 1998 به آن دست یافتند(15).  بنابراین می­توان گفت قلمروی I27 و ناحیه PEVK، هنگام آغاز فرآیند باز شدگی خواص مشابهی را در اثر تغییرات پی اچ، از خود نشان می­دهند. علاوه بر این همان­طور که از نتایج حاصل از کشیدگی قلمرو فیبرونکتین3 به وسیله کرایگ و همکارانش در سال 2004 مشاهده می­شود به راحتی می­توان دریافت که همجواری دو ناحیه تأثیر زیادی بر خواص مشترک آنها می­گذارد. فیبرونکتین3 و I27 از این لحاظ دارای خواص غیر یکسانی چون بیشینه­ نیروی متفاوت بوده و این امر به سبب محل قرار گرفتن فیبرونکتین3 و ضعیف بودن پیوندهای هیدروژنی در این ناحیه است. از طرفی بررسیهایی که در خصوص تغییرات پی اچ در این ناحیه رخ داده حاکی از این امر هستند که با کاهش پی اچ و به عبارت دیگر افزایش خاصیت اسیدی، بیشینه نیروی باز شدگی مقدار بیشتری را به خود اختصاص می­دهد(7) که این مشاهده با نتایج حاصل از کشیدگی I27 مغایرت دارد. نمودارهای مربوط به پی اچ­های 3 و 4 همان­طور که مشاهده می­شود تقریباً بر هم منطبقند و تفاوت زیادی بین این دو پی اچ با این سرعت کشیدگی دیده نمی­شود. بیشینه نیروی مربوط به حالت بازی(پی اچ12) برای آغاز شکسته شدن پیوندهای هیدروژنی مقدار بیشتری را نسبت به حالتهای اسیدی نشان می­دهد. موارد دیگر شبیه سازی در سرعتهای بالاتر(4 برابر و 10 برابر حالت قبل) انجام شدند. شکلهای 11 و 12 به ترتیب نمودارهای نیرو بر حسب جابه جایی را در سرعتهای کشیدگی بالاتر نشان می­دهند.

در شکل 11 سرعت کشیدگی 2 آنگستروم بر پیکوثانیه یعنی 4 برابر سرعت قبل در نظر گرفته شده و با توجه به اهمیت نیروی بیشینه، نتایج تنها تا باز شدگی 5/7 نانومتر مورد بررسی قرار گرفتند. بیشینه نیرو برای هر 4 حالت در مقایسه با شکل 9 مقدار بیشتری را نشان می­دهند که می‍توان علت آن را ناشی از افزایش 4 برابری سرعت کشیدگی و در نتیجه سخت­تر شدن I27 دانست.

 

شکل11-  نمودارهای نیرو بر حسب جابه جایی برای 4 پی اچ

متفاوت در سرعت 2 آنگستروم بر پیکوثانیه

 

شکل12-  نمودارهای نیرو بر حسب جابه جایی در 4 پی اچ متفاوت در سرعت 5 آنگستروم بر پیکوثانیه

با وجود این، بیش­تر بودن قله نیرو در حالت خنثی باز هم قابل رؤیت است، با این تفاوت که نسبت به اعمال سرعت 5/0 آنگستروم بر پیکوثانیه نمودارها بی­نظم­تر شده و نیز اختلاف کمی بین بیشینه نیرو در پی اچ­های 4، 7 و 12 وجود دارد، به طوری که نمودارهای مربوط به پی اچ 7 و 12 تقریباً یک بیشینه نیرو را نشان می­دهند. با توجه به شکل 10 شیب اولیه در 4  حالت یکسان نبوده و در پی اچ 3 مقدار کم­تری را در مقایسه با بقیه حالات نشان می­دهد.

با در نظر گرفتن سرعت 5 آنگستروم بر پیکوثانیه برای پی اچ­های متفاوت نمودار شکل 12 به دست آمده است. در این شکل نیز مانند شکلهای 9 و 10، هر4 حالت از نقطه 31/4 نانومتر آغاز شده و با شیب یکسانی به بیشینه نیروی خود جهت شکستن پیوندهای هیدروژنی رسیده­اند، با این تفاوت که قله نیرو به سبب مقدار سرعت بیشتر در نظر گرفته شده نسبت به حالات قبل افزایش یافته است. در باز شدگی قلمروی I27 به طول 5/7 نانومتر در این سرعت، بر اساس نتایج حاصل می­توان مشاهده کرد که اختلاف بین نمودارهای مربوط به پی اچ­های 3، 4 و 7 بسیار کم بوده به صورتی که نمودارهای مربوط به پی اچ 4 و 7، تقریباً بر هم منطبق هستند. نمودار مربوط به حالت بازی( پی اچ 12) نیز بیشینه نیرویی بالاتر از تمام حالات یعنی حتی حالت خنثی را نشان می­دهد که بر خلاف نتایج حاصل از نمودارهای شکل 10  است. البته علت این امر را می­توان ناشی از سرعت بسیار بالای کشیدگی و عدم تطبیق آن با محدوده سرعتی که در بدن رخ می­دهد دانست.

بحث

در این پژوهش تأثیر عامل محیطی پی اچ در سرعتهای متفاوت کشیدگی بر نیروی بازشدگی پروتئین تایتین با استفاده از شبیه سازی دینامیک مولکولی که روشی قدرتمند در بررسی جزئیات ساختاری در پروتئینهاست(1)، مورد بررسی قرار گرفت. تاکنون پژوهشهای زیادی روی ناحیهI27 به سبب محبوبیتی که میان پژوهش­گران دارد صورت گرفته است.

نتایج و نمودارهای حاصل از شبیه سازی، نشان داد که مطابق انتظار قلمرو I27 بنا به محلی که در آن قرار گرفته(در نزدیکی و مجاورت PEVK) رفتاری مشابه رفتار ناحیه PEVK از خود نشان می­دهد. به عبارت دیگر بیشینه نیرو جهت بازشدگی این ناحیه به هنگام اسیدی و یا بازی شدن نسبت به حالت خنثی کاهش یافته است. با این وجود در هر سه نمودار پس از گسیختگی نخستین پیوندهای هیدروژنی روند مشابهی مشاهده می­شود.

علاوه بر این تأثیر سرعت کشیدگی در فرآیند باز شدن قلمروی تا خورده I27 نیز در پی اچ­های متفاوت مورد ارزیابی قرار گرفت. در حقیقت فرآیند باز شدن قلمروهای تا خورده تایتین در سیستم بیولوژیکی بدن به صورت بسیار آهسته­تر از سرعتی که برای شبیه سازیهای دینامیک مولکولی در نظر گرفته می­شود رخ می­دهد. با این وجود در نظر گرفتن چنین سرعتی برای انجام شبیه سازیهای رایانه­ای مستلزم وجود زمان طولانی و در اختیار داشتن سیستمهای بسیار قدرتمند برای تجزیه و تحلیل داده­ها است. از طرفی بررسی وقایع در سطح مولکولی و به وسیله تکنیکهای آزمایشگاهی بسیار پیچیده، پر هزینه و عمدتا غیر قابل انجام می­باشد(2). با توجه به این امر شبیه­سازیها همواره در سرعتهای بالاتری نسبت به حالت طبیعی خود انجام می­شوند. در این پژوهش از سرعتهای مختلف برای کشیدگی استفاده شد. در حالی که در سرعت 5/0 آنگستروم بر پیکوثانیه نتایج بسیار خوب و مشابه با نتایج آزمایشگاهی انجام شده توسط لینک و همکاران در سال 1998 در خصوص ناحیه PEVK(15)حاصل گردید، نشان داده شد با افزایش سرعت، نتایج از روند منطقی و مورد انتظار فاصله گرفته و نمی­توانند به خوبی مورد استناد قرار گیرند. نتایج حاصل از این پژوهش می­تواند گام نخستی جهت تحلیلهای کامل­تر و با در نظر گرفتن شرایط محیطی بر باز شدگی پروتئین تایتین در مقیاس بزرگ­تر باشد.

1-      صفرزاده. م.، پاژنگ. م.، مهرنژاد. ف.، دوستدار. ف.، چاپارزاده. ن.، ربیعی فرادنبه. د.، یاری خسروشاهی. ا.، محمدپور. ع.، 1394. بررسی نحوه تأثیر جهش­ها بر غیر فعال شدن آنزیم پیرازین آمیداز با شبیه سازی دینامیک مولکولی. مجله پژوهش­های سلولی مولکولی، جلد 28: 278-266

2-      گنجعلی خانی. م.، رنجبر. م.، 1391. مطالعه دینامیک مولکولی و حرکات عملکردی آنزیم لیپازA از گونه باسیلوس سوبتیلیس. مجله پژوهش­های سلولی و مولکولی، جلد 27: 296-307

3-      لینگر. آ.، کاکس. م.، نلسون. د.، ل.، 1385. رضا محمدی آییژ، اصول بیوشیمی لنینجر. شابک ‎۹۶۴-۸۳۹۷-۰۵-۸.

4-      مهرافروز. ب.، شاملو. آ.، فیروزبخش. ک.، 1395. مطالعه خواص مکانیکی پروتئین اکتین تحت بارگذاری کششی با استفاده از شبیه سازی دینامیک مولکولی. مجله مهندسی مکانیک مدرس، جلد 16: 383-375.

 

5- Bung, N., Priyakumar, U. D., 2012. Computational investigation of the effect of thermal perturbation on the mechanical unfolding of titin I27. Journal of molecular modeling, Vol. 18, No. 6, pp. 2823-2829.

6- Caldwell, T. A., Sumner, I., Wright, N. T., 2015. Mechanical dissociation of the M‐band titin/obscurin complex is directionally dependent, FEBS letters, Vol. 589, No. 15, pp. 1735-1739.

7- Craig, D., Gao, M., Schulten, K., Vogel, V., 2004.Tuning the mechanical stability of fibronectin type III modules through sequence variations, Structure, Vol. 12, No. 1, pp. 21-30.

8- DuVall, M. M., Gifford, J. L., Amrein, M., Herzog, W., 2013. Altered mechanical properties of titin immunoglobulin domain 27 in the presence of calcium, European Biophysics Journal, Vol. 42, No. 4, pp. 301-307.

9- Gao, M., Wilmanns, M., Schulten, K., 2002. Steered molecular dynamics studies of titin I1 domain unfolding, Biophysical journal, Vol. 83, No. 6, pp. 3435-3445.  

10- Granzier, H. L., Labeit, S., 2006.The giant muscle protein titin is an adjustable molecular spring, Exercise and sport sciences reviews, Vol. 34, No. 2, pp. 50-53.

11- Greene, D. N., Garcia, T., Sutton, R. B., K. M. Gernert, Benian, G. M., Oberhauser, A. F., 2008 .Single-molecule force spectroscopy reveals a stepwise unfolding of Caenorhabditis elegans giant protein kinase domains, Biophysical journal, Vol. 95, No. 3, pp. 1360-1370.

12- Gu, J., Wang, X., Yang, Y., 2013. A steered molecular dynamics method for receptor-ligand unbinding based on genetic algorithm, in Proceeding of, IEEE, pp. 698-703.

13- Klimov, D. K., Thirumalai, D., 2000. Native topology determines force-induced unfolding pathways in globular proteins,  Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 97, No. 13, pp. 7254-7259.

14- Labeit, D., Watanabe, K., Witt, C., Fujita, H., Wu, Y., Lahmers S., Funck, T., Labeit, S., Granzier, H., 2003. Calcium-dependent molecular spring elements in the giant protein titin, Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 100, No. 23, pp. 13716-13721.   

15- Linke, W. A., Ivemeyer, M., Mundel, P., Stockmeier, M. R., Kolmerer, B., 1998. Nature of PEVK-titin elasticity in skeletal muscle, Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 95, No. 14, pp. 8052-8057.

16- Lu, H., Isralewitz, B., Krammer, A., Vogel, V., Schulten, K., 1998 .Unfolding of titin immunoglobulin domains by steered molecular dynamics simulation, Biophysical journal, Vol. 75, No. 2, pp. 662-671.

17- Lu, H., Schulten, K., 2000.  The key event in force-induced unfolding of titin’s immunoglobulin domains, Biophysical journal, Vol. 79, No. 1, pp. 51-65.

18- Shokuhfar, A., Ghaffari, A., Ghasemi, R. H., 2012. Cavity control of Prefoldin nano actuator (PNA) by temperature and pH, Nano-Micro Letters, Vol. 4, No. 2, pp. 110-117.

19- Taniguchi, Y., Brockwell, D. J., Kawakami, M., 2008. The effect of temperature on mechanical resistance of the native and intermediate states of I27, Biophysical journal, Vol. 95, No. 11, pp. 5296-5305.

20- Taniguchi, Y., Kobayashi, A., Kawakami, M., 2012. Mechanical unfolding studies of protein molecules, Biophysics, Vol. 8, pp. 51-58.

21- Toofanny, R. D., Williams, P. M., 2006. Simulations of multi-directional forced unfolding of titin I27, Journal of Molecular Graphics and Modelling, Vol. 24, No. 5, pp. 396-403.

22- Tskhovrebova, L., Trinick, J., 2004. Properties of titin immunoglobulin and fibronectin-3 domains, Journal of Biological Chemistry, Vol. 279, No. 45, pp. 46351-46354.

23- Wang, K., Forbes, J. G., Jin, A. J., 2001. Single molecule measurements of titin elasticity, Progress in biophysics and molecular biology, Vol. 77, No. 1, pp. 1-44.