نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 Department of Biology, Faculty of Science, University Of Maragheh

2 گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه آزاد واحد مراغه

چکیده

گیاه تاتوره بعنوان یک گیاه دارویی مهم، غنی از تروپان آلکالوئیدهای هیوسیامین و اسکوپولامین بوده و پژوهش‌های گسترده‌ای در زمینه بهینه‌سازی شرایط تولید این ترکیبات با ارزش در دنیا در حال انجام می‌باشد. در این پژوهش اثر الیسیتور غیرزیستی ساکارز (15، 30 و 45 گرم در لیتر) بر میزان وزن تر، تولید تروپان آلکالوئیدهای اسکوپولامین و هیوسیامین، پروتئین کل و فعالیت آنزیم‌های آنتی اکسیداتیو کاتالاز و گایاکول پراکسیداز تاتوره بررسی شد. میزان هیوسیامین و اسکوپولامین بوسیله روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) و غلظت پروتئین کل و فعالیت آنزیم‌های کاتالاز و گایاکول پراکسیداز با روش اسپکتروفتومتری اندازه‌گیری شد. براساس نتایج، بیشترین میزان وزن تر (82/0 گرم)، تولید هیوسیامین (5 میلی گرم در گرم وزن تر)، اسکوپولامین (20 میلی گرم در گرم وزن تر) و فعالیت کاتالاز (5/0 واحد در میلی گرم پروتئین) در بخش ریشه گیاهچه‌های تیمار شده با ساکارز 45 گرم در لیتر اندازه-گیری شد اما بیشترین میزان پروتئین (24/0میلی گرم در گرم وزن تر) در بخش هوایی گیاهچه‌های تیمار شده با ساکارز 30 گرم در لیتر مشاهده شد. بعلاوه، بیشینه فعالیت گایاکول پراکسیداز (52/1 واحد در میلی گرم پروتئین) تعیین شد. در مجموع، ساکارز با غلظت 45 گرم در لیتر می‌تواند محرک خوبی برای افزایش تولید هیوسیامین و اسکوپولامین با ارزش دارویی بالا در گیاه تاتوره باشد و به احتمال ساکارز علاوه بر تأمین نیاز انرژی و منبع کربنی موجب تحریک مسیر سیگنالی سنتز تروپان آلکالوئیدها شده است.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Investigation of sucrose effect on tropane alkaloid production and several biochemical parameters of Datura under in vitro culture condition

نویسندگان [English]

  • Parisa Fathi Rezaei 1
  • Elmira Rakee 2

1 Department of Biology, Faculty of Science, University Of Maragheh

2 Agricultural Biotechnology Department, Islamic Azad University – Maragheh Branch, Maragheh, Iran

چکیده [English]

Datura stramonium as a well-known medicinal plant is rich in tropane alkaloids such as hyoscyamine and scopolamine and currently the vast majority of the studies have been focused on optimization of production conditions of these valuable materials in the world. In this research, the effect of sucrose (15, 30 and 45 g/L) as an abiotic elicitor was investigated on fresh weight (FW), hyoscyamine and scopolamine production, protein content, activity of catalase (CAT) and guaiacol peroxidase (GPX) of D. stramonium. The amount of hyoscumine and scopolamine were measured by high-performance liquid chromatography (HPLC) and spectrophotometery method was applied for studying of total protrin content and activity of CAT and GPX. According to the results, the highest amount of fresh weight (0.82 g), production of hyoscyamine (5 mg/g FW), scopolamine (20 mg/g FW) and CAT activity (0.5 U/mg protein) were recorded on the root of 45 g/L-treated plantlets but the highest amount of protein (0.24 mg/g FW) was observed on shoot of 30 g/L ones. In addition, the maximum GPX activity was determined on root of plantlests treated with 30 g/L sucrose (1.52 U/mg protein). In conclude, the concentration of 45 g/L of sucrose can be a good elicitor to increase production of hyoscyamine and scopolamine with high medicinal value in D. stramonium which probably due to the fact that sucrose does not only act as a carbon and energy source but also induces signaling pathway of tropane alkaloids synthesis.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Catalase
  • D. stramonium
  • Guaiacol peroxidase
  • Hyoscyamine
  • Scopolamine

بررسی اثر ساکارز بر میزان تولید تروپان آلکالوئیدها و چندین پارامتر بیوشیمیایی گیاه تاتوره (Datura stramonium) در شرایط کشت درون شیشه­ای 

پریسا فتحی رضایی1* و المیرا راکعی2 

1 مراغه، دانشگاه مراغه، دانشکده علوم پایه، گروه زیست­شناسی 

2 مراغه،دانشگاه آزاد اسلامی واحد مراغه، دانشکده کشاورزی،گروه بیوتکنولوژی کشاورزی 

تاریخ دریافت: 6/5/96                  تاریخ پذیرش: 22/7/96

چکیده

گیاه تاتوره بعنوان یک گیاه دارویی مهم، غنی از تروپان آلکالوئیدهای هیوسیامین و اسکوپولامین بوده و پژوهش­های گسترده­ای در زمینه بهینه­سازی شرایط تولید این ترکیبات با ارزش در دنیا در حال انجام می­باشد. در این پژوهش اثر الیسیتور غیرزیستی ساکارز (15، 30 و 45 گرم در لیتر) بر میزان وزن تر، تولید تروپان آلکالوئیدهای اسکوپولامین و هیوسیامین، پروتئین کل و فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیداتیو کاتالاز و گایاکول پراکسیداز تاتوره بررسی شد. میزان هیوسیامین و اسکوپولامین بوسیله روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) و غلظت پروتئین کل و فعالیت آنزیم­های کاتالاز و گایاکول پراکسیداز با روش اسپکتروفتومتری اندازه­گیری شد. براساس نتایج، بیشترین میزان وزن تر (82/0 گرم)، تولید هیوسیامین (5 میلی گرم در گرم وزن تر)، اسکوپولامین (20 میلی گرم در گرم وزن تر) و فعالیت کاتالاز (5/0 واحد در میلی گرم پروتئین) در بخش ریشه گیاهچه­های تیمار شده با ساکارز 45 گرم در لیتر اندازه­گیری شد اما بیشترین میزان پروتئین (24/0میلی گرم در گرم وزن تر) در بخش هوایی گیاهچه­های تیمار شده با ساکارز 30 گرم در لیتر مشاهده شد. بعلاوه، بیشینه فعالیت گایاکول پراکسیداز (52/1 واحد در میلی گرم پروتئین) تعیین شد. در مجموع، ساکارز با غلظت 45 گرم در لیتر می­تواند محرک خوبی برای افزایش تولید هیوسیامین و اسکوپولامین با ارزش دارویی بالا در گیاه تاتوره باشد و به احتمال ساکارز علاوه بر تأمین نیاز انرژی و منبع کربنی موجب تحریک مسیر سیگنالی سنتز تروپان آلکالوئیدها شده است.

واژه های کلیدی: اسکوپولامین، تاتوره، کاتالاز، گایاکول پراکسیداز، هیوسیامین

* نویسنده مسئول، تلفن: 09144211594، پست الکترونیکی: parisafathirezaei@gmail.com

مقدمه

 

تعداد کمی از جنس­های گیاهی متعلق به تیرۀ سیب­زمینی (Solanaceae) از جمله جنس­ تاتوره (Datura) قادر به تولید تروپان آلکالوئیدهایی مانند هیوسیامین و اسکوپولامین هستند. تروپان آلکالوئیدها به طور گسترده در صنایع دارویی مورد استفاده قرار می­گیرند، از جمله اثرات دارویی مهم آنها عمل به عنوان آنتاگونیست­های رقابتی استیل کولین می­باشد. بنابراین، با توجه به نیاز روزافزون جامعه پزشکی به این نوع از آلکالوئیدها، به ویژه ترکیب دارویی ارزشمند اسکوپولامین، افزایش میزان آنها در گیاهان دارویی تولید کننده ضرورت دارد (16، 21 و 25).

تاتوره گیاهی علفی، دو لپه، یکساله به ارتفاع 20 تا 150 سانتیمتر، از تیره سیب زمینی (سولاناسه) است. برگ­های تاتوره منبع مهمی از تروپان آلکالوئیدها هستند و در طب سنتی در کنار بذرها بیشترین قسمت مورد استفاده این گیاه را تشکیل می­دهند. از تروپان آلکالوئیدهای مهم در تاتوره میتوان به هیوسیامین و اسکوپولامین اشاره کرد. در این گیاه، در ساقه­ها بیشترین اسکوپولامین و در ریشه­ها بیشتر هیوسیامین یافت می­شود (16). برگ­های تاتوره منبع مهمی از تروپان آلکالوئیدهای: آتروپین، هیوسیامین و اسکوپولامین هستند که برخلاف سمیت زیاد، بدلیل کاربردهای دارویی قابل توجه دارای اهمیت اقتصادی بالایی می­باشند. این آلکالوئیدها دارای اثرات پاراسمپاتولایتیک و آنتی موسکارینیک می­باشند که فعالیت سیستم پاراسمپاتیک را مهار می­کنند. اسکوپولامین (هیوسین) در تخفیف اسپاسم­های عضلات صاف، مانند عضلات صاف دستگاه گوارش کاربرد دارد (22). این دو آلکالوئید عمدتاً در سلول­های جوان ریشه سنتز شده و به بخش­های هوایی گیاه انتقال می­یابند. استفاده از گیاهان دارویی در ایران و سایر نقاط دنیا بسیار رایج می­باشد. امروزه روند تولید متابولیت­های ثانویه از طریق زیست­فناوری افزایش یافته است و کشت سلول و اندام گیاهی جایگزینی مناسب برای استخراج کامل مواد گیاهی است. الیسیتور ممکن است هنگامی که به یک سیستم سلول زنده در غلظت­های کم اعمال می­شود، بیوسنتز ترکیبات خاص را آغاز و یا افزایش دهد (10).

سنتز شیمیایی آلکالوئیدها غالباً گران بوده و منابع طبیعی تنها منبع اقتصادی برای تولید انبوه این ترکیبات می­باشند. گونه­های متنوعی از تاتوره برای تولید تروپان آلکالوئیدها کشت می­شوند. دلایل استفاده از کشت بافت گیاهی به عنوان جایگزین کشت مزرعه عبارتند از کوتاه شدن دوره رشد، حذف نیاز به علف­کش­ها و حشره­کش­ها، حفظ شرایط رشد ثابت و میزان تولید (15).

گیاهان و سلول­های گیاهی پاسخ­های فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی به فاکتورهای میکروبی، شیمیایی و فیزیکی به عنوان الیسیتور (محرک) نشان می­دهند. تحریک کردن فرایندی است که موجب القاء یا افزایش سنتز متابولیت­های ثانویه به وسیله گیاهان برای حفظ بقاء، مقاومت و رقابت می­شود (17). آلکالوئیدها متابولیت­های ضروری برای تکمیل چرخه زندگی گیاه نیستند. غالباً فرض بر این است که متابولیت­های ثانویه به عنوان مولکول­های سیگنالی یا دفاع شیمیایی در مقابل شرایط تنش عمل می­کنند. هم­چنین فرض بر این است که متابولسیم ثانویه ممکن است به عنوان یک بخش کلی از توانایی گیاه برای تغییر فرایندهای متابولیک برای بقاء و رشد در شرایط سخت مثلاً حضور مقادیر زیاد فلزات باشد (23).

از سوی دیگر، کاربرد انواع مختلف الیسیتورها که در تنظیم بیان ژن­های متعلق به آنزیم­های کلیدی مسیر بیوسنتزی متابولیت­های ثانویه نقش دارند، می­تواند به عنوان راهکار مؤثری در افزایش تولید این دسته از ترکیبات مورد استفاده قرار گیرد (6). قندهایی مانند گلوکز، فروکتوز و ساکارز علاوه بر نقش­های معمول بعنوان منبع کربنی و انرژی، بعنوان مولکول­های سیگنالی در گیاهان شناخته شده­اند (14).

گیاهان برای حفاظت در برابر تنش­های اکسیداتیو از سیستم­های پاکسازی کننده رادیکال­های آزاد شامل آنزیم­های آنتی اکسیداتیو مانند سوپراکسید دیسموتاز، پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز و کاتالاز و هم چنین ترکیبات غیرآنزیمی مانند کارتنوئیدها استفاده می­نمایند. بنابراین هر تیماری که به کاهش میزان گونه­های واکنشگر اکسیژن کمک نماید در بهبود وضعیت گیاه می­تواند مؤثر باشد. این شبکه برای کنترل تولید مازاد گونه­های واکنشگر اکسیژن در طی تنش و هم­چنین در حفظ سطح مناسب و صحیح گونه­های واکنشگر اکسیژن برای رشد و پیام­رسانی مهم می­باشد (10).

بر همین اساس در این بررسی بهینه­سازی شرایط کشت درون شیشه­ای گیاه تاتوره با اعمال تیمار ساکارز بعنوان منبع کربنی و مطالعۀ اثر الیسیتور ساکارز بر میزان تولید تروپان آلکالوئیدها و پروتئین تام و سینتیک آنزیم­های آنتی اکسیداتیو گایاکول پراکسیداز و کاتالاز در گیاه تاتوره انجام شد. لازم به ذکر است با مرور منابع تا کنون گزارشی مبنی بر اثر ساکارز بر رشد و میزان تروپان آلکالوئیدهای گیاه تاتوره در محیط کشت موراشیگ و اسکوگ (MS) نیم برابر وجود ندارد.

مواد و روشها

کشت و آماده­سازی نمونه­های گیاهی و اعمال تیمارها: بذرهای گیاه تاتوره پس از جمع­آوری از استان آذربایجان­شرقی و ضدعفونی سطحی با Triton x100 و محلول هیپوکلریت سدیم 20% و الکل اتیلیک 70% به­ترتیب به مدت 20 و 10 دقیقه و شستشو با آب مقطر استریل، در محیط کشت پایه موراشیگ و اسکوگ (MS) (13) با غلظت نیم برابر حاوی ساکارز با غلظت­های مختلف (15، 30 و 45 ­گرم در لیتر) به تعداد 10-7 عدد کشت شدند. پس از گذشت تقریباً یک ماه هفته، اندام هوایی و ریشه گیاهچه­های تاتوره پس از برداشت و توزین جهت بررسی­های بعدی در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.

استخراج تروپان آلکالوئیدها از گیاهچه های تاتوره: برای استخراج تروپان آلکالوئیدها از گیاهچه­های تاتوره از روش کامادا و همکاران با اندکی تغییرات استفاده شد (11). مراحل استخراج به صورت خلاصه از این قرار است: یک گرم از بافت تر اندام هوایی و ریشه گیاهچه­ها به طور جدا­گانه در نیتروژن مایع سائیده، حلال استخراج (10 میلی لیتر حلال به ازاء 100 میلی گرم نمونه) حاوی کلروفرم، متانول و هیدروکسید آمونیوم 25% (15: 5: 1) به نمونه­ها اضافه و بمدت 30 دقیقه در دستگاه سونیکاتور قرار داده شدند. پس از انکوباسیون در دمای اتاق بمدت یک ساعت، محلول صاف و با 1 میلی لیتر کلروفرم دو مرتبه شستشو داده شد و با استفاده از دستگاه روتاری در دمای 40 درجه سانتیگراد خشک شد. در ادامه 5 میلی لیتر کلروفرم و 2 میلی لیتر اسید سولفوریک یک نرمال بر روی باقیمانده افزوده و کاملاً هم زده شد. فاز کلروفرمی حذف و pH فاز حاوی اسید سولفوریک با استفاده از هیدروکسید آمونیوم 28 درصد بر روی یخ به 10 رسانده شد. برای استخراج آلکالوئیدها 3 میلی لیتر کلروفرم به محلول اضافه شد. محلول حاصل پس از افزودن سولفات سدیم بدون آب صاف و باقیمانده با یک میلی لیتر کلروفرم شستشو داده شد. محلول حاصل در دمای 40 درجه سانتیگراد خشک و در 2-1 میلی لیتر متانول حل شد. میزان 20 میکرولیتر از عصاره متانولی حاصل پس از صاف کردن با فیلتر 45/0 میکرومتری به دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) تزریق شد.

سنجش تروپان آلکالوئیدها توسط HPLC: سنجش محتوای تروپان آلکالوئید (هیوسیامین و اسکوپولامین) نمونه­ها به روش HPLC و توسط ستون C18 در طول موج 215 نانومتر، سرعت جریان حلال یک میلی­لیتر بر دقیقه و فاز متحرک ایزوکراتیک، حاوی آب و استونیتریل (25: 75) انجام شد. در هر سنجش، 20 میکرولیتر عصاره به دستگاه تزریق شد. به منظور سنجش کمی، دو ترکیب استاندارد هیوسیامین سولفات و اسکوپولامین هیدروبروماید در سه غلظت (2/0، 5/0 و 1 میلی­گرم در میلی­لیتر) به دستگاه تزریق و بر اساس سطح زیر منحنی نسبت به غلظت، منحنی استاندارد رسم ­گردید. سپس محتوای دو آلکالوئید هیوسیامین و اسکوپولامین در نمونه­های مورد بررسی بر اساس زمان بازداری به دست آمده از ترکیبات استاندارد و سطح زیر منحنی پیک­های مربوط به هر نمونه، با استفاده از نمودار استاندارد محاسبه شد (4 و 11).

استخراج پروتئین از گیاهچه­های تاتوره: مقدار نیم گرم از بافت تر گیاهی در هاون چینی با افزودن 50 میلی گرم پلی وینیل پیرولیدن (Polyvinylpyrrolidone) و 5/1 میلی لیتر از بافر فسفات پتاسیم (pH=7) ساییده و با دور rpm 15000 در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه سانتریفوژ شد. سپس فاز رویی در ویال­های کوچکتر تقسیم و ویال­ها در فریزر 80- درجه سانتیگراد به منظور انجام مطالعات بعدی نگهداری شد.

سنجش پروتئین محلول کل: میزان پروتئین محلول کل در این بررسی به روش بردفورد (1976) تعیین شد (6). به این ترتیب که میزان 25 میکرولیتر از نمونه­های استخراج شده در قسمت قبل با 750 میکرو لیتر معرف بردفورد (X1) مخلوط و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. سپس میزان جذب نمونه­ها در طول موج 595 نانومتر بوسیله اسپکتروفتومتر اندازه­گیری شد. غلظت پروتئین محلول نمونه­ها با استفاده از منحنی استاندارد سرم آلبومین گاوی (Bovine Serum Albumin) بر حسب میلی گرم بر میلی لیتر تعیین شد.

سنجش آنزیم کاتالاز: فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT, EC: 1.11.1.6) به روش ابی اندازه­گیری شد (2). به این ترتیب که 20 میکرولیتر عصاره آنزیمی با بافر فسفات پتاسیم 100میلی مولار (PH=7) آب مقطر استریل و پراکسید هیدروژن 70 میلی مولار محلول در بافر فسفات پتاسیم 100 میلی مولار (PH=7) (750 میکرولیتر) مخلوط شدند. سینتیک آنزیم کاتالاز توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 240 نانومتر در مدت زمان 180 ثانیه اندازه­گیری شد. از مخلوط بدون عصاره آنزیمی بعنوان بلانک استفاده شد.

سنجش گایاکول پراکسیداز: فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز (POX, EC: 1.11.1.7) به روش چانس و مهلی اندازه­گیری شد (7). مخلوط واکنش شامل محلول­های بافر فسفات پتاسیم 100 میلی مولار (PH=7)، گایاکول ده میلی مولار محلول در آب دوبار تقطیر، پراکسید هیدروژن 70 میلی مولار محلول در فسفات پتاسیم 100 میلی مولار (PH=7)، آب دوبار تقطیر استریل و عصاره آنزیمی است. سینتیک آنزیم گایاکول پراکسیداز توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 470 نانومتر در مدت زمان 180 ثانیه اندازه­گیری شد. از مخلوط بدون عصاره آنزیمی بعنوان بلانک استفاده شد.

آنالیز آماری: به منظور مقایسه نتایج به­دست آمده و تعیین اهمیت تفاوت­های مشاهده شده در آزمایشات از نرم افزار SPSS (ویرایش 19) استفاده شد. رسم نمودارها به وسیله Microsoft Excel انجام گرفت. جهت تفسیر نتایج و تعیین تفاوت­های بین گروه کنترل و گروه­های آزمایش از آنالیز واریانس یک طرفه (one-way ANOVA) استفاده شد. نتایج آزمایش­ها به صورت .Mean±S.D ارائه و نتایج آنالیزهای آماری با مقدار P کوچک­تر از 05/0 معنی­دار در نظر گرفته شد.

نتایج 

تأثیر محرک ساکارز بر رشد گیاهچه­های تاتوره: یک ماه پس از اعمال تیمارهای ساکارز با غلظت­های مختلف (45 و 30، 15 گرم در لیتر) نمونه­های ریشه و اندام هوایی بطور جداگانه توزین شد که اثر اعمال الیسیتور بر رشد گیاهچه­ها در شکل شماره 1 آمده است. در تیمار ساکارز 45 گرم در لیتر میزان وزن تر اندام هوایی و ریشه افزایش معنی­دار به ترتیب 7/5 و 5/3 برابر در مقایسه با غلظت 15 گرم در لیتر مشاهده شد. تیمار ساکارز 30 گرم در لیتر موجب افزایش دو برابری میزان وزن تر بخش هوایی نسبت به تیمار 15 گرم در لیتر شد. در حالیکه میزان وزن تر ریشه و اندام هوایی در تیمار ساکارز 15 گرم در لیتر از همه تیمارها کمتر بود.

 

شکل 1- اثر ساکارز بر رشد گیاهچه­های تاتوره. وزن تر (FW) بخش ریشه و هوایی گیاهچه­ها. داده­های نمایش داده­شده میانگین ±S.D. داده­های حاصل از حداقل 3 بار آزمایش مجزاست. نشان دهندۀ وجود اختلاف معنی دار با: * 01/0p<  و ** 001/0p<  است که با آنالیز واریانس یک طرفه و پس آزمون Tukey بدست آمده است.

تأثیر محرک ساکارز بر میزان تروپان آلکالوئیدها در گیاهچه­های تاتوره: میزان اسکوپولامین و هیوسیامین در بافت­های مختلف یکماه بعد از تیمار با ساکارز اندازه­گیری شد. در شکل 2 کروماتوگرام مربوط به استاندارد اسکوپولامین (الف)، هیوسیامین (ب)، ریشه تیمار شده با ساکارز 15 گرم در لیتر (ج) و ریشه تیمار شده با ساکارز 45 گرم در لیتر (د) آمده است.

 

  

  

  

  

شکل 2- کروماتوگرام­های حاصل از آنالیز HPLC. الف) استاندارد اسکوپولامین، ب) استاندارد هیوسیامین، ج) ریشه تیمار شده با ساکارز 15 گرم در لیتر و د) ریشه تیمار شده با ساکارز 45 گرم در لیتر.

 

میزان اسکوپولامین در بخش ریشه گیاهچه­های تاتوره با افزایش غلظت ساکارز بطور معنی­داری افزایش یافت و در غلظت 45 گرم در لیتر به حدود 5/2 برابر غلظت 15 گرم در لیتر رسید. در مقابل میزان اسکوپولامین بخش هوایی گیاهچه­ها افزایش حدود 2/1 برابر تیمار 15 گرم در لیتر ساکارز نشان داد (شکل شماره 3). با افزایش غلظت ساکارز محتوای تروپان آلکالوئید هیوسیامین در بخش هوایی و ریشه گیاهچه­ها به طور معنی­داری افزایش یافت که در غلظت 45 گرم در لیتر افزایش 5 و 5/3 برابری به ترتیب در بخش ریشه و اندام هوایی نسبت به غلظت 15 گرم در لیتر ساکارز مشاهده شد (شکل شماره 4).

 

شکل 3- اثر ساکارز بر میزان اسکوپولامین بخش ریشه و اندام هوایی گیاهچه­های تاتوره. داده­های نمایش داده­شده میانگین ±S.D. داده­های حاصل از حداقل 3 بار آزمایش مجزاست. نشان دهندۀ وجود اختلاف معنی دار با: * 01/0p<  و ** 001/0p<  است که با آنالیز واریانس یک طرفه و پس آزمون Tukey بدست آمده است.

 

 

شکل 4- اثر ساکارز بر میزان هیوسیامین بخش ریشه و اندام هوایی گیاهچه­های تاتوره. داده­های نمایش داده­شده میانگین ±S.D. داده­های حاصل از حداقل 3 بار آزمایش مجزاست. نشان دهندۀ وجود اختلاف معنی دار با: * 01/0p<  و ** 001/0p<  است که با آنالیز واریانس یک طرفه و پس آزمون Tukey بدست آمده است.

 

تأثیر ساکارز بر میزان پروتئین تام در گیاهچه­های تاتوره: محتوای پروتئین تام در بخش هوایی گیاهان در معرض ساکارز 30 گرم در لیتر افزایش معنی­داری 5/2 برابری نسبت به ساکارز 15 گرم در لیتر نشان داد. غلظت ساکارز 45 گرم در لیتر در بخش هوایی گیاهان تیمار شده موجب افزایش 8/1 برابری پروتئین نسبت به غلظت 15 گرم در لیتر گردید. بیشترین میزان پروتئین در اندام هوایی گیاهچه­های تیمار شده با  ساکارز 30 گرم در لیتر اندازه­گیری شد (شکل شماره 5).

 

 

شکل 5- اثر ساکارز بر میزان پروتئین کل بخش ریشه و اندام هوایی گیاهچه­های تاتوره. داده­های نمایش داده­شده میانگین ±S.D. داده­های حاصل از حداقل 3 بار آزمایش مجزاست. نشان دهندۀ وجود اختلاف معنی دار با: * 01/0p<  و ** 001/0p<  است که با آنالیز واریانس یک طرفه و پس آزمون Tukey بدست آمده است.

تأثیر ساکارز بر سینتیک آنزیم کاتالاز در گیاهچه­های تاتوره: با توجه به نتایج بررسی سینتیک آنزیم کاتالاز (شکل شماره 6) غلظت ساکارز 45 گرم در لیتر موجب افزایش معنی­دار 20 درصدی میزان فعالیت این آنزیم در بخش ریشه گیاهان تیمار شده نسبت به گیاهان در معرض ساکارز 15 گرم در لیتر گردید.

 

شکل 6- اثر ساکارز بر فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) بخش ریشه و اندام هوایی گیاهچه­های تاتوره. داده­های نمایش داده­شده میانگین ±S.D. داده­های حاصل از حداقل 3 بار آزمایش مجزاست. نشان دهندۀ وجود اختلاف معنی دار با *01/0p<  است که با آنالیز واریانس یک طرفه و پس آزمون Tukey بدست آمده است.

تأثیر ساکارز بر سینتیک آنزیم گایاکول پراکسیداز در گیاهچه­های تاتوره: بر اساس شواهد بدست آمده از آنالیز سینتیک آنزیم گایاکول پراکسیداز (شکل شماره 7)، میزان فعالیت آنزیم در هر دو بخش ریشه و اندام هوایی گیاهان تیمار شده با غلظت 30 گرم در لیتر ساکارز به ترتیب به 5/5 و 8/1 برابر غلظت 15 گرم در لیتر افزایش یافت. میزان فعالیت آنزیم در هر دو بخش ریشه و اندام هوایی غلظت 45 گرم در لیتر ساکارز نسبت به غلظت 15 گرم در لیتر به ترتیب افزایش حدود 5/3 و 2/1 برابری نشان داد.

 

شکل 7- اثر ساکارز بر فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز (GPX) بخش ریشه و اندام هوایی گیاهچه­های تاتوره. داده­های نمایش داده­شده میانگین ±S.D. داده­های حاصل از حداقل 3 بار آزمایش مجزاست. نشان دهندۀ وجود اختلاف معنی دار با: * 01/0p<  و ** 001/0p<  است که با آنالیز واریانس یک طرفه و پس آزمون Tukey بدست آمده است.

بحث

ساکارز مهم­ترین منبع کربنی تولیدکننده انرژی در کشت گیاهان در سیستم­های کشت درون شیشه­ای به ویژه برای تولید متابولیت­های ثانویه می­باشد. ساکارز بهترین منبع کربن، در برابر گرما ناپایدار بوده و قسمت عمده آن بعد اتوکلاو به فروکتوز و گلوکز تجزیه شده و تنها قسمتی که تجزیه نشده جذب ریشه گیاه شده و مورد استفاده قرار می­گیرد. علاوه بر تأمین انرژی و اسکلت کربنی در تنظیم فشار اسمزی محیط کشت نیز نقش دارد (25).

در این تحقیق اثر غلظت­های مختلف ساکارز (15، 30 و 45 گرم در لیتر) بر میزان رشد ریشه و نیز غلظت هیوسیامین و اسکوپولامین مورد بررسی قرار گرفته است. بر اساس نتایج، بیشترین میزان رشد ریشه و محتوای تروپان آلکالوئیدها در غلظت 45 گرم در لیتر ساکارز مشاهده شد.

وکیلی و همکاران (1390) میزان افزایش ساخت تروپان آلکالوئیدها و بیان ژن H6H در گیاهچه­های شابیزک را در اثر تیمارهای کربوهیدراتی (سوربیتول، مانیتول و ساکارز) مورد مطالعه قرار داده­اند. تیمار با این کربوهیدرات­ها رشد گیاهچه­ها را کاهش داد، ولی موجب افزایش محتوای کلروفیل، هیوسیامین و اسکوپولامین در گیاهچه­ها شد (1). در مطالعه­ای روته و همکاران (2003) اثر ساکارز با غلظت 5 درصد را بر تولید آلکالوئیدها در ریشه­های گیاه شابیزک با بیان بالای ژن PMT مورد بررسی قرار دادند که ریشه­های تیمار شده با ساکارز 5 درصد، افزایش میزان کالیستژین را نشان دادند، در حالی که ریشه­های دارای بیان بالای PMT تحت تأثیر قرار نگرفتند (19). در بررسی اثر الیسیتوری سوربیتول بر رشد ریشه­ها و تولید تروپان آلکالوئیدها در گیاه بذرالبنج، افزودن سوربیتول هیچگونه اثری بر رشد ریشه­ها و تجمع هیوسیامین و اسکوپولامین نداشت (9). در بررسی اثر القایی ساکارز، پرولین و کلرید سدیم بر میزان تولید هیوسیامین و اسکوپولامین گیاه بذرالبنج، پرولین موجب افزایش هیوسیامین شده ولی سایر تیمارها بر میزان تولید این ترکیب اثر معنی­داری نداشتند. همچنین، هر سه الیسیتور موجب افزایش قابل توجه اسکوپولامین نسبت به کالوس­های شاهد شدند (3). افزایش میزان ساکارز (1-5 درصد) در محیط کشت B5 کامل و 2/1در دمای 25 و 30 درجه سانتیگراد موجب افزایش 8 برابری محتوای هیوسیامین ریشه­های تغییرشکل یافته تاتوره (رده سلولی DS1) شد. در دمای 20 درجه سانتیگراد و ساکارز تا 5 درصد میزان هیوسیامین بیشتر از دمای 25 و 30 درجه سانتیگراد بود. بیشترین میزان تولید هیوسیامین بوسیله رده سلولی DS1 در محیط کشت کامل B5 با 5% ساکارز در دمای 20 و 25 درجه سانتیگراد مشاهده شد. تحت این شرایط میزان تشکیل هیوسیامین تا 4/7 میلی گرم در لیتر در روز کشت توده­ای بدست آمد. میزان رها شدن هیوسیامین به محیط کشت در دمای 30 درجه سانتیگراد (14 درصد) بالاتر از دمای 20 و 25 درجه سانتیگراد (4 درصد) بود (8). در مطالعه اثر محرکی منابع کربن (ساکارز) و نیتروژن (نیترات و آمونیوم) بر میزان رشد سلول­ها و تولید تروپان آلکالوئیدها در کشت سوسپانسیون گیاه تاتوره، نسبت کربن به نیتروژن محیط کشت، شاخص مهمی در میزان رشد و تولید تروپان آلکالوئیدها بود. افزودن منابع کربن و نیتروژن در محیط کشت تا اندازه­ای که نسبت کربن به نیتروژن تا حد 70 برسد موجب مهار تولید تروپان آلکالوئیدها شده و افزایش نسبت به مقادیر بالاتر از 100 موجب افزایش صد درصدی میزان تولید تروپان آلکالوئیدها نسبت به گروه شاهد شد (5). در این بررسی نیز، افزایش میزان منبع کربن محیط کشت جامد به مقدار 45 گرم در لیتر موجب افزایش میزان رشد و غلظت تروپان آلکالوئیدها شد که احتمالاً در ارتباط با تغییرات نسبت کربن به نیتروژن محیط و اثر القایی آن می­باشد. احتمالاً ساکارز در زمان فاز سکون از مراحل سینتیک رشد گیاه تاتوره (یعنی حدوداً روز سی­اُم) به طور کامل به مونوساکاریدهای تشکیل­دهنده خود یعنی گلوکز و فروکتوز شکسته شده است. این موضوع در تحقیق انجام شده توسط پاولف و همکاران تأیید شده است (19). نتایج حاصل از بررسی اثر کربوهیدرات­های سوربیتول، مانیتول و ساکارز بر میزان تولید تروپان آلکالوئیدها در گیاه شابیزک بیانگر اثر القایی کربوهیدرات­های ذکر شده در افزایش میزان هیوسیامین و اسکوپولامین بود.  معمولاً در محیط­های مصنوعی کشت گیاهان ساکارز به عنوان منبع کربن و انرژی برای رشد بهینه گیاه به کار می­رود در حالی که مانیتول و سوربیتول برای افزایش­ پتانسیل اسمزی استفاده می­شوند. همچنین مطالعات نشان داده­اند که کربوهیدرات­ها علاوه بر نقش مولکول­های علامتی یا سیگنال، در سوخت و ساز آلکالوئیدها نقش دارند (1). نتایج بدست آمده از پژوهش حاضر در زمینه تأثیر افزایش­دهنده ساکارز در تولید تروپان آلکالوئیدها در اندام هوایی و ریشه گیاهچه­های تاتوره مشابه یافته­های وکیلی و همکاران (1390) است که نشان دادند کربوهیدرات­ها سبب افزایش تروپان آلکالوئیدها در کشت ریشه شابیزک می­شوند. از طرفی تنش اسمزی اعمال شده توسط ساکارز احتمالاً سبب افزایش سنتز پوترسین می­شود که یکی از پیش­سازهای مسیر بیوسنتز آلکالوئیدها است. کربوهیدرات­ها نه تنها به عنوان منابع کربن مورد نیاز برای رشد، بلکه با تأثیر بر سیستم­های حساس به میزان کربوهیدرات، سبب تغییر در بیان برخی ژن­ها می­شوند (1). در مطالعه اثر محیط­های کشت مختلف MS، B5 و WP با غلظت­های کامل و نیم برابر بر میزان رشد ریشه­های مویین گیاه تاتوره نتایج حاصله نشان داد که رشد ریشه تحت تأثیر محیط کشت قرار نگرفت و بیشینه رشد ریشه­ها در محیط کشت B5 نیم برابر مشاهده شد. از سوی دیگر، محیط کشت اثر معنی­داری بر میزان تولید آلکالوئیدها داشت. در تمامی محیط­های کشت استفاده شده، هیوسیامین آلکالوئید غالب بود. آنها همچنین اثر غلظت­های مختلف ساکارز (3 تا 8 درصد) در محیط کشت B5 را بر رشد ریشه­های مویین و میزان تولید تروپان آلکالوئیدهای گیاه تاتوره به مدت 4 هفته مورد مطالعه قرار دادند که رشد ریشه در محیط حاوی ساکارز 5 درصد بیشتر از سایر غلظت­ها بود. همچنین محیط کشت حاوی 3 درصد ساکارز، کمترین رشد ریشه را داشت. با این حال میزان تولید آلکالوئیدهای هیوسیامین و اسکوپولامین در هیچیک از غلظت­های ساکارز استفاده شده تفاوت معنی­داری مشاهده نشد (14). در بررسی­های انجام شده طی تحقیق حاضر، محیط کشت MS با غلظت­های کامل و نیم برابر جهت کشت گیاه تاتوره مورد استفاده قرار گرفت و بهترین محیط از نظر ریشه­زایی، محیط کشت MS بدون هورمون با غلظت نیم برابر بدست آمد.

تولید هایپرسین­ها در دانه­رست­های H. adenotrichum را تا غلظت 45 گرم در لیترساکارز افزایش و در غلظت­های بالاتر روند کاهشی داشت. هم چنین گزارش شده است ساکارز با غلظت 30-10 گرم در لیتر تولید هایپرسین و هایپرفورین را در بخش هوایی H. perforatum افزایش داد (20).

فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدان مانند پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز اغلب به عنوان نشانگر در بررسی تغییرات فیزیولوژیک و بیوشیمیایی پاسخ گیاهان به تنش­های زیستی و غیر زیستی استفاده می­شوند و میزان فعالیت این آنزیم­ها با افزایش سطح تنش افزایش می­یابد. بنابراین فعالیت آنزیم­های انتی اکسیدان و سنتز متابولیت ثانوی همیشه مرتبط است. در گیاه Euphorbia pekinensis افزایش فعالیت کاتالاز و سنتز آب اکسیژنه بعد از تیمار الیسیتور در بافت­های کشت شده گزارش شده است (12).

الیستورهای مختلف بسته به نوع، غلظت و نوع گیاه پاسخ­های متفاوتی را ایجاد می­نمایند. شایان ذکر است که در مطالعه حاضر ساکارز موجب افزایش میزان پروتئین، فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدان و تولید تروپان آلکالوئیدهای اسکوپولامین و هیوسیامین در گیاه تاتوره شده است.

نتیجه­گیری

در مجموع می­توان گفت ساکارز با غلظت 45 گرم در لیتر محرک خوبی برای افزایش تولید هیوسیامین و اسکوپولامین با ارزش دارویی بالا در گیاه تاتوره می­باشد. هم چنین با افزایش غلظت ساکارز میزان پروتئین و فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدان کاتالاز و گایاکول پراکسیداز افزایش یافت. به احتمال ساکارز علاوه بر تأمین نیاز انرژی و منبع کربنی موجب تحریک مسیر سیگنالی سنتز تروپان آلکالوئیدها شده است. مطالعات بیشتر در زمینه بررسی مکانیسم (های) عمل اثر ساکارز بر مسیر بیوسنتزی تروپان آلکالوئیدها در این گیاه ضروری به نظر می­رسد.

1-      وکیلی، ب.، کریمی، ف.، شریفی، م.، بهمنش، م.، 2011. افزایش ساخت تروپان آلکالوئیدها و بیان ژن h6h در گیاهچه های شابیزک توسط کربوهیدرات­ها. علوم و فناوری زیستی مدرس، دورة 2، شمارة 1، 18-5.

 

2-      Aebi, H., 1984. Catalase in vitro. Methods in enzymology, 105: 121-126. 

3-      Aljibouri, A. M. J., Al-samarraei, K. W., Abd, A. S., Mageed, D. M., Ali, A.-J. A., 2012. Alkaloids Production from Callus of Hyoscyamus niger L. in Vitro. Journal of Life Sciences, 6(8): 874.

4-      Bahmanzadegan, A., Sefidkon, F., Sonboli, A., 2009. Determination of hyoscyamine and scopolamine in four Hyoscyamus species from Iran. Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 8(1): 65-70.

5-      Ballica, R., Ryu, D. D., Powell, R. L., Owen, D., 1992. Rheological properties of plant cell suspensions. Biotechnology progress, 8(5): 413-420.

6-      Bradford, M. M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry, 72(1-2): 248-254.

7-      Chance, B., Maehly, A., 1955.  Assay of catalases and peroxidases. Methods in enzymology, 2: 764-775.

8-      Hilton, M., Rhodes, M., 1993. Factors affecting the growth and hyoscyamine production during batch culture of transformed roots of Datura stramonium. Planta medica, 59(04): 340-344.

9-      Hong, M. L. K., Bhatt, A., Ping, N. S., Keng, C. L., 2012. Detection of elicitation effect on Hyoscyamus niger L. root cultures for the root growth and production of tropane alkaloids. Romanian Biotechnological Letters, 17(3): 7341-7351.

10-   Hussain, M. S., Fareed, S., Ansari, S., Rahman, M. A., Ahmad, I. Z., Saeed, M., 2012. Current approaches toward production of secondary plant metabolites. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences, 4(1): 10-20.

11-   Kamada, H., Okamura, N., Satake, M., Harada, H., Shimomura, K., 1986. Alkaloid production by hairy root cultures in Atropa belladonna. Plant cell reports, 5(4): 239-242.

12-   Maqsood, M., Mujib, A., 2017. Yeast extract elicitation increases vinblastine and vincristine yield in protoplast derived tissues and plantlets in Catharanthus roseus. Revista Brasileira de Farmacognosia, 

13-   Murashige, T., Skoog, F., 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia plantarum, 15(3): 473-497.

14-   Nussbaumer, P., Kapétanidis, I., Christen, P., 1998. Hairy roots of Datura candida × D. aurea: effect of culture medium composition on growth and alkaloid biosynthesis. Plant cell reports, 17(5): 405-409.

15-   Oksman-Caldentey, K.-M., Hiltunen, R., 1996. Transgenic crops for improved pharmaceutical products. Field crops research, 45(1-3): 57-69.

16-   Palazón, J., Navarro-Ocaña, A., Hernandez-Vazquez, L., Mirjalili, M. H., 2008. Application of metabolic engineering to the production of scopolamine. Molecules, 13(8): 1722-1742.

17-   Patel, H., Krishnamurthy, R., 2013. Elicitors in plant tissue culture. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 2(2): 60-65.

18-   Rao, S. R., Ravishankar, G., 2002. Plant cell cultures: chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology advances, 20(2): 101-153.

19-   Rothe, G., Hachiya, A., Yamada, Y., Hashimoto, T., Dräger, B., 2003. Alkaloids in plants and root cultures of Atropa belladonna overexpressing putrescine N‐methyltransferase. Journal of Experimental Botany, 54(390): 2065-2070.

20-   Shakya, P., Marslin, G., Siram, K., Beerhues, L., Franklin, G., 2017. Elicitation as a tool to improve the profiles of high‐value secondary metabolites and pharmacological properties of Hypericum perforatum. Journal of Pharmacy and Pharmacology, **(): **-**.

21-   Ullrich, S.F., Hagels, H., Kayser, O., 2017. Scopolamine: a journey from the field to clinics. Phytochemistry Reviews, 16(2): 333-53.

22-   Vaillant, N., Monnet, F., Hitmi, A., Sallanon, H., Coudret, A., 2005. Comparative study of responses in four Datura species to a zinc stress. Chemosphere, 59(7): 1005-1013.

23-   Vernay, P., Gauthier-Moussard, C., Jean, L., Bordas, F., Faure, O., Ledoigt, G., Hitmi, A., 2008. Effect of chromium species on phytochemical and physiological parameters in Datura innoxia. Chemosphere, 72(5): 763-771.

24-   Wang, J., Li, J. L., Li, J., Li, J. X., Liu, S. J., Huang, L. Q., Gao1, W. Y., 2017. Production of Active Compounds in Medicinal Plants: From Plant Tissue Culture to Biosynthesis. Chinese Herbal Medicines, 9(2): 115-125.

25-   Ziegler, J., Facchini, P. J., 2008. Alkaloid biosynthesis: metabolism and trafficking. Annu. Rev. Plant Biol., 59: 735-769.