حضور و جایگاه تکاملی سه گروه ژنی پلی­کتاید سنتازهای تیپ I و II و پپتید سنتتاز غیرریبوزومی در سه سویه استرپتومایسس  Iz8،F9  و  F6

سارا قشقایی، زهرا اعتمادی فر^* و منوچهر توسلی

ایران، اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 2/1/96                  تاریخ پذیرش: 10/4/96

چکیده

غربال­گری پلی­کتاید سنتازها و پپتید سنتتازهای غیرریبوزومی راهی سریع برای اثبات پتانسیل تولید عامل ضدمیکروبی و کشف عوامل دارویی جدید می­باشد. در این راستا حضور و جایگاه تکاملی این خوشه­های ژنی در سه سویه استرپتومایسس مطالعه شد.

حضور احتمالی سه گروه ژنی پلی­کتاید سنتازهای تیپ I و II و پپتید سنتتازهای غیرریبوزومی به ترتیب در سه سویه استرپتومایسس Iz8،F9  و F6 با استفاده از پرایمرهای لغزشی بررسی و اثبات شد. برای تفکیک قطعات مختلف با اندازه یکسان و توالی متفاوت، محصولات PCR با اندازه مربوطه به وکتور pTG19-T پیوند و سپس در سلولهای اشرشیا کلی سویه TOP10  ترانسفورم شدند. برای بررسی دقیق­تر تنوع قطعات، از ژل پلی­آکریل آمید استفاده شد. از هر گروه ژنی چند کلون تعببن توالی و درخت فیلوژنی در نرم­افزار مستربیز رسم شد. کلونهای 3 و 8 از پلی­کتاید سنتاز تیپ I، کلون 4 از پلی­کتاید سنتاز تیپ II و کلون 5 از پپتید سنتتازهای غیرریبوزومی در پایگاه داده GenBank در سایت NCBI ثبت شدند. درختهای فیلوژنی با همردیفی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی نشان دهنده قرارگیری کلون 8 از پلی­کتاید سنتاز تیپ I و کلون 4 از پلی­کتاید سنتاز تیپ II در کلادهای جداگانه و احتمال تولید عوامل ضدمیکروبی جدید می­باشد.

با رسم درخت فیلوژنی و تعیین رابطه تکاملی احتمال حضور خوشه­های ژنی با ترکیب بندی جدید و بنابراین تولید محصول جدید در سویه­های Iz8 و F9 نشان داده شد.

واژه های کلیدی: پلی­کتاید سنتاز، پپتید سنتتازهای غیرریبوزومی، پلی آکریل­آمید، مشابه سازی، درخت فیلوژنی

* نویسنده مسئول، تلفن: 37932367-031، پست الکترونیکی: z.etemadifar@sci.ui.ac.ir  و zetemadifar@gmail.com

مقدمه

اکتینومیستها گروه بزرگی از باکتریهای ساکن خاک هستند. تاکنون بیش از 22 هزار ترکیب فعال­زیستی میکروبی شناخته شده است که نیمی از آنها توسط اکتینومیستها تولید می­شوند (7). پروژه­های ژنومی اخیر اکتینومیستها نشان داده است که هر ژنوم اکتینومیست مسیرهای بیوسنتتیک مختلفی را کد می­کند که یک دوم تا سه چهارم آنها با مسیرهای مربوط به پپتید سنتتازهای غیرریبوزومی (NRPSs) و پلی­کتاید سنتازها (PKSs) مرتبط هستند. در نتیجه این دو گروه از ترکیبات متابولیتهای ثانویه اصلی اکتینومیستها هستند. پلی­کتاید­ها (PK)، پپتید­های غیرریبوزومی (NRP) و هیبرید آنها اغلب فعالیتهای زیستی مفید دارویی نشان می­دهند (10).

PKها خانواده بزرگی از محصولات طبیعی در باکتریها، قارچها و گیاهان با ویژگی ضدباکتریایی، ضدقارچی، ضدکلسترول، ضدانگل، ضدسرطان و سرکوب­گر سیستم ایمنی هستند (4). آنها از پیش­ ماده­های اسیل کوآنزیم A به وسیله PKSها سنتز می­شوند (21). سه تیپ از PKSهای باکتریایی تا به امروز شناخته شده است: 1) PKSهای تیپ I (PKS-I) که به طور کلی به دو گروه مودولار (غیرتکرار شونده) و تکرار شونده تقسیم می­شوند. PKS-I مودولار مشابه با اسید چرب سنتازهای (FAS) تیپ I آنزیمهای بزرگ چند کاره با سازماندهی مودولار هستند (20، 21 و 23). هر مودول شامل 3 دومین کاتالیتیک ضروری برای طویل شدن زنجیره به نامهای کتوسنتاز(KS) ، اسیل ترانسفراز (AT) و پروتئین حامل اسیل(ACP)  می­باشد (25). در حالی­که در ابتدا تصور بر این بود که PKS-Iهای تکرار شونده محدود به سیستم قارچی هستند اما در سالهای اخیر در تعداد زیادی از باکتریها نیز پیدا شده­اند (26)؛ 2) PKSهای تیپ II  (PKS-II)که به دو گروه تکرار شونده و غیرتکرار شونده تقسیم می­شوند. PKSهای تکرار شونده مشابه با FASهای تیپ II کمپلکسهای چند آنزیمی عمل کننده در یک رفتار تکرار شونده، هستند (4 و 25). آنها شامل یک هترودایمر، متشکل از یک زیرواحد KSα (سایت فعال) و یک زیرواحد KSβ یا فاکتور طول زنجیره (CLF)، که با ACP همکاری می­کنند هستند (9). PKSهای غیرتکرار شونده فاقد دومین ACP بوده و مستقیماً از سوبسترای آسیل کوآنزیم A برای تشکیل باندهای C-C و C-O استفاده می­کنند (21)؛ 3) PKSهای تیپ III (PKS-III) آنزیمهای هومودایمری هستند که سایت فعال تک آنها در هر مونومر واکنشهای آماده­سازی، گسترش یا طویل شدن و حلقوی کردن را به صورت تکرار شونده برای تشکیل محصولات PK کاتالیز می­کند (4 و 25). علی رغم سادگی ساختار، PKS-IIIهای باکتریایی خود به 5 گروه تقسیم می­شوند که تعداد زیادی از آنها از استرپتومیسس­ها شناسایی شده­اند (25).

NRPها از مهم­ترین داروهای ضدباکتریایی، ضدقارچی، ضدویروسی، سرکوب کننده­های سیستم ایمنی و ضدتوموری هستند (2). آنها همچنین می­توانند ترکیبات فعالی مانند سیدروفورها را تولید کنند (5). تعیین توالی NRPSهای مختلف نشان داده است که معمولاً این خانواده­های ژنی شامل زیرواحدهای کاتالیتیک مودولار بوده و نظم قرارگیری این مودولها در کمپلکس آنزیمی معمولاً توالی پپتیدی را دیکته می­کند (2). هر مودول شامل  سه دومین به نامهای آدنیلاسیون (A)، تیولاسیون (پروتئین حامل پپتیدیل) (T) و متراکم سازی (C) با نظم C-A-T است. سنتز یک NRP به وسیله یک NRPS شامل یک سری مراحل تکرار شونده است که به وسیله عملکردهای هماهنگ سه دومین CAT کاتالیز می­شود (2 و 6). یک دومین چهارم (تیواستراز) اغلب در C-ترمینال NRPS وجود دارد که آزادسازی پپتید از NRPS را کاتالیز می­کند. دومینهای اضافی که زنجیره پپتیدی در حال رشد را تغییر می­دهند نیز می­توانند بخشی از یک مودول NRPS باشند. دلیل مهم تنوع ساختاری زیاد NRP این است که دومینهای A به 20 اسیدآمینه پروتئینوژنیک استاندارد محدود نمی­شوند. در حقیقت بیش از 300 پیش­ماده متفاوت در NRPها شناسایی شده است.  NRPSها دارای سه تیپ هستند: 1) تیپ A، NRPS خطی. هر مودول یکبار در طول بیوسنتز NRP استفاده می­شود. برای تیپ A، NRPS خطی، تعداد مودولها دلالت بر تعداد آمینواسیدهای وارد شده در یک NRP دارد؛ 2) تیپ B، NRPSهای تکرار شونده. همه مودولها بیش از یکبار در طول بیوسنتز NRP استفاده می­شوند؛ 3) تیپ C، NRPSهای غیرخطی. این گروه از قانون CAT تبعیت نکرده و بعضی از دومینهای خاص بیش از یکبار در طول بیوسنتز یک NRP عمل می­کنند (6).

غربال­گری PKSها و NRPSها به عنوان دو گروه­ مهم ژنی دخیل در بیوسنتز متابولیتهای ثانویه یک راه سریع و میانبر برای اثبات پتانسیل تولید عامل ضدمیکروبی و کشف عوامل دارویی جدید می­باشد. در این راستا سه سویه استرپتومایسس (Streptomyces) جدا شده در آزمایشگاه تحقیقاتی با نامهای Iz8 (KX229772)، F9 (KX417085) و F6 (KX229769) با 100، 88/99 و 49/99 درصد تشابه با استرپتومایسس کریلشنس (S. coerulescens)، استرپتومایسسکریزیوس (S. chryseus) و استرپتومایسس ماروکننسیس (S. marokkonensis) برای مطالعه و تعیین میزان تنوع به ترتیب در ژنهای PKS-I، PKS-II و NRPS انتخاب شدند. پس از مشابه­سازی (Cloning)، تنوع دومینهای KS و متیل­مالونیل تراسفراز (MT) در PKS-I، زیرواحد KSα در PKS-II و دومین A در NRPS با ژل پلی­آکریل آمید بررسی و با تعیین توالی و رسم درخت فیلوژنی نشان داده شد.

مواد و روشها

الف) غربال­گری اولیه ژنهای کد کننده PKS-I، PKS-II و NRPS به روش PCR لغزشی: DNA به روش CTAB استخراج شد (14). پتانسیل ژنومی برای تولید متابولیتهای ثانویه در 3 سویه Iz8، F9 و F6 با استفاده از 3 جفت پرایمر لغزشی K1F/M6R برای تکثیر ناحیه بین دومینهای KS و MT در PKS-I، KSαF/KSαR، بخشی از زیرواحد KSα در PKS-II و A3F/A7R و ناحیه بین موتیفهای حفظ شده A3 و A7 در NRPS ارزیابی شد (جدول 1). واکنش پلیمرازی برای تکثیر اولیه ژنها در حجم 25 میکرولیتر شامل 300-10 نانوگرم DNA ژنومیک استخراج شده به عنوان الگو، 4-4/0 میکرومولار از هر یک از پرایمرها، 200 میکرومولار dNTPs، 5/1 میلی­مولار کلرید منیزیم، 5/2 میکرولیتر بافر PCR 10x ، 5/2 میکرولیتر DMSO و 5/2 واحد تک­پلیمراز انجام شد. PCR در یک ترمال سایکلر گرادیانت اپندروف انجام شد. PCR شامل 1) 5 دقیقه در 95 درجه سانتی­گراد برای واسرشت اولیه DNA ، 2) 35 سیکل هر سیکل شامل 30 ثانیه در 95 درجه سانتی­گراد، 2 دقیقه در 57 درجه سانتی­گراد (برای K1F/M6R)، 58 درجه سانتی گراد (برایKS𝛼F/KSαR )  و 55 درجه سانتی­گراد (برای A3F/A7R) و 4 دقیقه در 72 درجه سانتی­گراد، و 3) 10 دقیقه در 72 درجه سانتی­گراد برای بسط نهایی بود. بعد ازانجام مراحلPCR ، 4 میکرولیتر از محصول PCR به همراه یک میکرولیتر از رنگ لود کننده درون چاهک ژل آگاروز 1 درصد شامل اتیدیوم بروماید در بافر TBE 1x بارگذاری شد و در جریان 100 میلی­آمپر به مدت 1 ساعت قرار گرفت و سپس توسط UV ترانس لومیناتور دیده شد.باندهای 1400-1200، 700-600 و 800-700 جفت باز به ترتیب به عنوان محصولات تکثیر احتمالی ژنهای PKS-I، PKS-II و NRPS در نظر گرفته شدند (3، 8، 12، 13 و 15). برای اطمینان و تأیید نهایی، محصولات PCR با سایز مربوطه با کمک کیت استخراج DNA از ژل (GeNet Bio, Korea) خالص و برای مشابه­سازی استفاده شدند.

جدول 1- توالی پرایمرهای لغزشی برای تکثیر ژنهای PKS-I، PKS-II و NRPS.

ب) محیط لیزوژنی: محیط لیزوژنی مایع (Lysogeny broth; LB) به عنوان یک محیط مغذی طی فرآیند مستعد سازی سلولها و محیط لیزوژنی جامد (Lysogeny agar; LA) انتخابی (حاوی 100 میکروگرم بر میلی­لیتر آمپی­سیلین) برای گزینش کلونهای ترانسفورم شده استفاده شد. محیط کشت LA شامل 10 گرم بر لیتر تریپتون، 10 گرم بر لیتر کلرید سدیم، 5 گرم بر لیتر عصاره مخمر و 15 گرم بر لیتر آگار می­باشد. در صورت پایین بودن pH محیط، با استفاده از محلول سود 1 نرمال pH محیط به 5/7 رسانده شد (18).

پ) محیط بهینه شده با سرکوب کاتابولیک: محیط بهینه شده با سرکوب کاتابولیک (Super optimal broth with catabolite repression; SOC) با ترکیب 20 گرم بر لیتر تریپتون، 5 گرم بر لیتر عصاره مخمر، 58/0 گرم بر لیتر کلرید سدیم، 18/0 گرم بر لیتر کلرید پتاسیم، 95/0 گرم بر لیتر کلرید منیزیم و 6/3 گرم بر لیتر گلوکز طی فرآیند تراریختی یا ترانسفورماسیون (Transformation) استفاده شد (18).

ت) تهیه سلولهای مستعد برای مشابه­سازی(Cloning) : در این مرحله ابتدا از کشت شبانه اشرشیا کلی (Escherichia coli) سویه TOP10 به محیط LB استریل فاقد آنتی­بیونیک با نسبت 1 به 49 تلقیح و در دمای 37 درجه سانتی­گراد در انکوباتور شیکردار با دور rpm140 انکوبه شد. پس از گذشت مدت مورد نیاز برای رسیدن به OD برابر با 6/0-5/0، فاکلون حاوی باکتری به منظور توقف رشد به مدت10 دقیقه بر روی یخ قرار داده شد. تمامی محیط کشت در میکروتیوبهای 5/1 پخش و به مدت20 دقیقه با دور rpm4000  و در 4 درجه سانتی­گراد سانتریفیوژ شد. مایع روبی را بیرون ریخته، به باکتریهای رسوب داده شده مقدار 5/1 میلی­لیتر کلرید منیزیم 100 میلی­مولار سرد اضافه، با عمل پیپتینگ یک دست و به مدت30 دقیقه روی یخ قرار داده شد. عمل سانتریفیوژ همانند مرحله قبل انجام شد (20 دقیقه با دور rpm4000  و در 4 درجه سانتی­گراد). پس از دور ریختن مایع رویی، مقدار 5/1 میلی­لیتر کلرید کلسیم 100 میلی­مولار سرد به رسوب اضافه، به آرامی با عمل پیپتینگ یک دست و به مدت یک ساعت بر روی یخ قرار داده شد. پس از گذشت مدت زمان مورد نظر نمونه­ها همانند مرحله قبل (20 دقیقه با دور rpm4000  و در 4 درجه سانتی­گراد) سانتریفیوژ شدند. مایع رویی را خارج کرده و به هر میکروتیوپ 200 میکرولیتر از مخلوط 7:3 گلیسرول 60 درصد:کلرید کلسیم 100 میلی­مولار استریل و سرد اضافه شد. پس از پیپتینگ کردن مخلوط به دست آمده تا زمان استفاده در دمای 70- درجه سانتی­گراد نگهداری شد (18).

ث) واکنش الحاق(Ligation): هدف، الحاق قطعات ژنی PKS-I از سویه Iz8، قطعات ژنی PKS-II از سوبه F9 و قطعات ژنی NRPS از سویه F6 در وکتور pTG19-T  (ساخت شرکت ویوانتیس، Vivantis) می­باشد. با در نظر گرفتن نسبت بهینه 3 به 1 محصولات PCR به وکتور، مقدار نانوگرم محصول PCR مورد نیاز طبق پروتکل کیت محاسبه شد. به منظور برآورد تقریبی غلظت محصولات PCR استخراج شده از ژل از نشانگر وزنی DM3100 1Kb (0.25-10) ساخت شرکت اسموبیو(SMOBIO)استفاده شد و در نهایت حجم مورد نیاز برآورد شد. سپس واکنش الحاق در حجم نهایی 20 میکرولیتر شامل حجمی معادل نانوگرم قطعه مورد نیاز، 4 میکرولیتر وکتورpTG19-T  (25 نانوگرم بر میکرلیتر)، 2 میکرولیتر پلی اتیلن گلیکول 50 درصد، 2 میکرولیتر بافر اتصال x10 و 1 میکرولیتر آنزیمT4  (5 Weiss بر میکرولیتر) در دمای 16 درجه سانتی­گراد به مدت16 ساعت انجام شد. حجم مورد نیاز از واکنش الحاق برای ترانسفورماسیون طبق فرمول کیت محاسبه شد.

ج)ترانسفورماسیون یاانتقال پلاسمیدها به باکتری: ابتدا سلول مستعد را به مدت10 دقیقه به منظور خروج از یخ­زدگی بر روی یخ قرار داده سپس حجمی معادل 80 نانوگرم از محصول واکنش الحاق به سلول مستعد اضافه شد. پس از مخلوط کردن، میکروتیوب مجدداً به مدت30 دقیقه بر روی یخ قرار داده شد. نمونه به مدت2 دقیقه داخل حمام آب گرم با دمای 42 درجه سانتی­گراد قرار گرفته و سپس بلافاصله به مدت 5 دقیقه بر روی یخ قرار داده شد. 800 میکرو­لیتر از محیط استریل SOC به نمونه­ اضافه و برای یک ساعت در دمای 37 درجه سانتی­گراد در انکوباتور شیکر­دار انکوبه شد. سپس نمونه به مدت2 دقیقه در دورrpm 3000 سانتریفیوژ و مایع رویی به نحوی که 100 میکرو لیتر بر روی رسوب باقی بماند خارج شد. با عمل پیپتینگ به آرامی رسوب حاصله مخلوط شد. نمونه ترانسفورماسیون شده را در پلیت LA انتخابی حاوی آمپی­سیلین پخش کرده و به مدت16 الی 18 ساعت در دمای 37 درجه سانتی­گراد انکوبه شد (18).

چ) غربال­گری کلونهای دارای ژن مورد نظر با کلنی PCR: هر کلنی در یک پلیت LA انتخابی حاوی آمپی­سیلین جهت خالص­سازی به صورت مجزا کشت داده شد. این روند سه بار تکرار شد. سپس جهت اثبات الحاق ژن مورد نظر به وکتور از کلنی PCR با جفت پرایمرهای اختصاصی استفاده شد. 4 میکرولیتر از محصول کلنی PCR هر سه ژن به همراه یک میکرولیتر از رنگ لود کننده درون چاهک ژل آگاروز 1 درصد شامل اتیدیوم بروماید در بافر TBE 1x برده شد و در جریان 100 میلی آمپر به مدت1 ساعت قرار گرفت و سپس توسط  UVترانس لومیناتور دیده شد. نمونه­های مثبت از لحاظ وجود باند مورد نظر برای بررسی تنوع توالی و سایز بر روی ژل پلی آکریل­آمید 10 درصد برده شدند.

ح) بررسی تنوع توالی، ساختاری وتفاوتهای کوچک در سایز با ژل پلی آکریل آمید: 3 میکرولیتر از هر نمونه مثبت با 7 میکرولیتر از لودینگ بافر x3 (125/0 درصد بروموفنول بلو، 125/0 درصد گزیلن سیانول و 15 درصد گلیسرول) مخلوط و درون چاهک ژل پلی­آکریل­آمید 10 درصد (5:1/37 بیس­آکریل آمید/ آکریل آمید) در بافر1x  TBE (1 میلی مولار اتیلن­ دی آمین تترا استیک اسید، 45 میلی مولار تریس-بورات با 8= pH) برده شد و به مدت 22، 17 و 5/18 ساعت به ترتیب برای PKS-I، PKS-II و NRPS در جریان 220 میلی آمپر قرار گرفت و سپس ژل با محلولهای ثبوت (اسید استیک 5/7)، آب مقطر، رنگ­آمیزی (نیترات نقره 1/0 درصد) و ظهور (5/1 درصد هیدروکسید سدیم و 15/0 درصد فرمالدهید) به ترتیب به مدت20، 10 ، 30 و 20-15 دقیقه شیک شد و در هر مرحله بعد از دور ریختن محلول قبلی و افزودن محلول بعدی دوبار با آب مقطر به آرامی شستشو داده شد (19).

خ) تأیید گروههای ژنی PKS-I،PKS-II  و  NRPSبا توالی یابی: جهت اطمینان از حضور ژنهای مورد نظر، بر پایه نتایج بدست آمده از ژلهای پلی آکریل­آمید 3 کلون با سایز متفاوت از PKS-I، دو کلون از PKS-II و 3 کلون از NRPS برای تعیین توالی انتخاب شدند. استخراج پلاسمید با کیت استخراج پلاسمید (GeNet Bio, Korea) طبق پروتکل ارائه شده انجام شد. پلاسمیدهای استخراج شده با پرایمرهای وکتور M13F و M13R در هر دو جهت با استفاده از یک توالی­یاب اتوماتیک به وسیله ماکروژن تعیین توالی شد.

د) آنالیز فیلوژنتیک توالیهای PKS-I، PKS-II و NRPS: توالیها با استفاده از نرم­افزارهای Chromas نسخه 2.6 و Bioedit نسخه 7.1.11.0 ویرایش و با استفاده از ابزارBLAST  در بانک اطلاعاتی NCBI مورد بررسی و سپس با توالیهایی از نزدیک­ترین دومینهای مرتبط با استفاده از نرم افزار PhyDE نسخه 0.9971 همردیف(Align)شدند. طول ردیف  (Alignment) نوکلئوتیدی 1334، 573 و 713 باز و طول ردیف آمینواسیدی 444، 191 و 237 آمینواسید (شامل الحاق و حذف) به ترتیب برای توالیهای PKS-I، PKS-II و NRPS بود. تعیین رابطه فیلوژنتیک با استفاده از نرم­افزار مستربیز(MrBayes)نسخه 3.2.6 انجام شد. مستربیز نرم­افزاری برای استنباط بیزی (Bayesian inference) با انتخاب طیف وسیعی از مدلهای فیلوژنتیکی و تکاملی می­باشد (17). مدل تکاملی GTR+I+G برای توالیهای نوکلئوتیدی و مدل Jones برای توالیهای آمینواسیدی انتخاب شد. مستربیز از روشهای مارکوف چین منته کارلو (Markov chain Monte Carlo; MCMC) برای برآورد توزیع احتمال پسین(Posterior probability distribution)پارامترهای مدل استفاده می­کند. برای درخت فیلوژنی با همردیفی نوکلئوتیدی، دو اجرای موازی از 4 زنجیره MCMC شامل سه زنجیره گرم و یک زنجیره سرد به صورت همزمان برای 8 میلیون بار(Generation) (تشخیصها هر 1000 بار محاسبه شد) و برای درخت فیلوژنی با همردیفی آمینواسیدی، دو اجرای موازی شامل یک زنجیره سرد به صورت همزمان برای 1 میلیون بار (تشخیصها هر 1000 بار محاسبه شد) گذاشته شدند. آنالیزها وقتی که انحراف معیار فراوانیهای خرد شده(Standard deviation of split frequencies)به زیر 01/0 رسید متوقف شد. اولین 25 درصد از تکرارها سوزانده (Burn-in) شد. درختها با نرم­افزار FigTree نسخه 1.2.2 دیده شدند (22). حمایت شاخه­ها در روش مستربیز با اعداد مربوط به احتمال پسین (Posterior probability; PP) بیان می­شود.

نتایج

الف) انتقال قطعات ژنی PKS-I، PKS-II و NRPS به درون وکتور TA: حضور احتمالی سه گروه ژنی PKS-I، PKS-II و NRPS به ترتیب در سه سویه استرپتومایسس Iz8، F9 و F6 با کمک پرایمرهای لغزشی بررسی و اثبات شد. برای اطمینان و تأیید نهایی، محصولات PCR با سایز مربوطه به وکتور pTG19-T  الحاق و سپس در اشرشیا کلی سویه TOP10 ترانسفورم شدند. 12، 19 و 24 کلون به ترتیب از ترانسفورماسیون قطعات ژنی PKS-I، PKS-II و NRPS جدا شد. کلونها تا 3 مرحله کشت مجدد و خالص شدند. برای اطمینان از حضور ژنها در وکتور کلنی PCR با پرایمرهای اختصاصی انجام شد. از اشرشیا کلی سویه TOP10 به عنوان کنترل منفی استفاده شد. همان طور که در شکل 1 دیده می­شود 8، 15 و 22 کلون قطعه ژنی مورد نظر را داشتند. محصول PCR کلونهای مثبت برای بررسی و مطالعه دقیق­تر تنوع در توالی و سایز بر روی ژل پلی­آکریل آمید برده شد.

ب) بررسی و مطالعه تنوع درناحیه بین دومینهای KS و MT خوشه ژنی PKS-I در سویه Iz8: همان طور که در شکل 2 (آ) دیده می­شود 8 کلون به دست آمده از ترانسفورماسیون قطعات ژنی PKS-I در 3 سایز متفاوت قرار می­گیرند. یک کلون از هر سه سایز (کلونهای 1، 3 و 8) برای استخراج پلاسمید و تعیین توالی انتخاب شد. نتیجه بدست آمده از بلست توالیهای تعیین شده توسط ماکروژن با توالیهای به ثبت رسیده در  NCBI نشان داد که کلون 1 با 1329 باز و 75 درصد G+C یک ژن کاذب با تغییر چارچوب و تشابه 94 درصدی (Query Cover=100%) با خوشه ژنی PKS-I متعلق به پلاسمید pSPA1 در استرپتومایسس پارولوس (S. parvulus) سویه 2297 است. کلون 3 با 1246 باز و 5/72 درصد G+C و کلون 8 با 1303 باز و 70 درصد G+C ژنهای عملکردی بودند. بیشترین تشابه (85 درصد) (Query Cover=99%) کلونهای 3 و 8 به ترتیب با خوشه ژنی PKS-I متعلق به "پلاسمید  pSPA1در استرپتومایسس پارولوس سویه 2297" و "ژن ShaA کد کننده PKS-I در استرپتومایسس آلبوگریزئولوس (S. albogriseolus) سویه MGR072 می باشد.

پ) بررسی و مطالعه تنوع در زیرواحد KSα در ژن PKS-II در سویهF9 : کلون 3 با 613 باز و 4/65 درصد G+C، یک ژن کاذب با چندین کدون توقف درونی بود. کلون 4 با 613 باز و 2/69 درصد G+C دارای 99 درصد تشابه (Query Cover=99%) با اولین خوشه ژنی PKS-II ثبت شده از گونه­ای استرپتومایسس سویه MM1 بود.

(آ) (ب)

(پ) (ت)

(ث)

شکل 1- تصویر ژل الکتروفورز محصول کلنی PCR تمامی کلونهای تراسفورم شده با استفاده از پرایمر های اختصاصی K1F/M6R (آ)، KSαF/KSαR (ب و پ) و A3F/A7R (ت و ث) روی ژل آگارز 1 درصد. شماره کلونها در بالای چاهکها ذکر شده است. قطعات ژنی  PKS-I (آ)، PKS-II (ب و پ) و NRPS (ت و ث) به ترتیب سایز 1400-1200، 700-600 و 800-700 قابل مشاهده هستند. از نشانگر وزنی  DM3100 1Kb (0.25-10)برای تخمین اندازه و غلظت و از اشرشیا کلی سویه TOP10 به عنوان کنترل منفی (Cont -) استفاده شد.

(آ) (ب)

 (پ)

شکل 2- تصویر ژل الکتروفورز محصول کلنی PCR کلونهای مثبت تأیید شده با ژل آگارز شامل قطعات ژنی PKS-I مرتبط با سویه Iz8 (آ)، PKS-II مرتبط با سویه F9 (ب) و NRPS مرتبط با سویه F6 (پ) روی ژل پلی ­آکریل­آمید 10 درصد (5:1/37 بیس­آکریل آمید/ آکریل آمید). شماره کلونها در بالای چاهکها ذکر شده است.

ت) بررسی و مطالعه تنوع در دومین A در ژن NRPS در سویه F6:کلونهای 5 و 20 با 723 باز و 1/70 درصد G+C دارای توالی یکسان با 92 درصد تشابه (Query Cover=99% ) با خوشه ژنی NRPS در استرپتومایسس پاکتوم (S. pactum) سویه ACT12 بودند. کلون 19 با 664 باز و 70 درصد G+C، 95 درصد تشابه (Query Cover=98%) با زنجیره بلند اسید چرب کوآ لیگاز در استرپتومایسس پاکتوم سویه ACT12 و 94 درصد تشابه (Query Cover=98%) با زنجیره بلند اسیدچرب کوآ لیگاز در گونه­ای از استرپتومایسس سویه 2114.2  و سنتتاز وابسته به AMP در استرپتومایسس پارولوس سویه 2297 داشت.

ث) ثبت ژن در GenBank: کلونهای 3 و 8 از PKS-I، کلون 4 از PKS-II و کلون 5 از NRPS به ترتیب با شماره های KY637058، KY637059، KY637060 و KY637057 در پایگاه داده GenBank در سایت NCBI ثبت شدند.

ج) رابطه تکاملی بین گروههای ژنی PKS-I، PKS-II و NRPS در سویه­های Iz8، F9 و F6 با نزدیکترین سویه­های مرتبط فیلوژنتیک: در هر دو درخت فیلوژنی با همردیفی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی، کلون 8 سویه Iz8 در کلاد جداگانه­ای قرار گرفته (شکل 3 آ و ب) و کلون 3 با پروتئینی با شماره ANJ11907 در پایگاه اطلاعاتی بانک ژنی NCBI از استرپتومایسس پارولوس سویه 2297، با احتمال شاخه­ای 1 در یک شاخه درونی از کلاد 3 قرار می­گیرد. مرتبط با سویه F9، درخت فیلوژنی با همردیفی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی به ترتیب به 3 و 4 کلاد مجزا تقسیم شد(شکل 3 پ و ت). در هر دو درخت، کلون انتخاب شده از سویه F9 خود یکی از این کلادها بود. در درخت فیلوژنی بر اساس همردیفی نوکلئوتیدی سویه F6 (شکل 3 ث) و نزدیکترین سویه­های مرتبط فیلوژنتیک، کلاد 3 با حمایت شاخه­ای 1 به 2 شاخه مجزا تقسیم می‍شود. شاخه 2 نیز با حمایت شاخه ای 5/0 به 2 زیرشاخه تفکیک می­شود. توالی نوکلئوتیدی دومین A سویه F6 کلون 5 همراه با استرپتومایسس پاکتوم سویه ACT12، استرپتومایسس آمبوفاشینس (S. ambofaciens) سویه ATCC 23877، استرپتومایسس سلیکالر
 (S. coelicolor) سویه A3(2)، استرپتومایسس لیویدانس(S. lividans)  سویه TK24، استرپتومایسس سیلاسئوس (S. silaceus) سویه و نانوموریا (Nonomuraea) سویه ATCC 3972 با حمایت شاخه­ای 9/0 زیرشاخه 2 را تشکیل می­دهند. دومین A در استرپتومایسس آمبوفاشینس سویه ATCC 23877 و نانوموریا سویه ATCC 3972، در تولید سیدروفور نقش دارد. به علاوه این سویه تنها با احتمال شاخه­ای 5/0 درصد که احتمال پایینی محسوب می­شود از استرپتومایسس ساب­تروپیکوس (S. subtropicus) سویه CGMCCIA A-182 در زیرشاخه 1 از شاخه 2 کلاد 3 جدا می­شود. دومینA  در استرپتومایسس ساب­تروپیکوس سویه CGMCCIA A-182 نیز در تولید سیدروفور نقش دارد. در درخت فیلوژنی بر اساس همردیفی آمینواسیدی نیز توالیها در 3 کلاد متمایز قرار می­گیرند (شکل 3 ج). کلاد 2 به 2 شاخه تقسیم شد. دومین A در سویه F6 کلون 5 همراه با استرپتومایسس پراتنسیس (S. pratensis) سویهATCC 33331، استرپتومایسس سویه PAMC26508، استرپتومایسس آمبوفاشینس سویه ATCC 23877، استرپتومایسس سلیکالر سویه A3(2) و استرپتومایسس لیویدانس سویه TK24 با حمایت شاخه ای 64/0 دریکی از زیرشاخه­های شاخه 2 از کلاد 2 قرار می­گیرند. این در حالی است که استرپتوماسس پاکتوم سویه ACT12 که بیشترین شباهت نوکلئوتیدی را با کلون 5 دارد به طور مجزا زیرشاخه دیگری از شاخه 2 از کلاد 2 را تشکیل می­دهد. با در نظر گرفتن نتیجه هر دو درخت احتمال اینکه قطعه ژنی توالی­یابی شده مرتبط با تولید سیدروفور در این سویه باشد وجود دارد.

بحث

مسیرهای PKS وNRPS ، به عنوان مشخصه­های تولید متابولیت ثانویه، در تعداد زیادی از سویه­های اکتینومیست شناسایی شده است (11). جنس استرپتومایسس 75 درصد آنتی­بیوتیکهای طبیعی و دامنه وسیعی از سایر متابولیتهای ثانویه بـر ضـد عوامـل انگلی، قارچی و همچنین ضدتومور و علف­کش را تولید می­کند (1). از یک طرف، غربالگری اولیه سویه­ها با پرایمرهای اختصاصی برای ژنهای مرتبط با متابولیت ثانویه (PKS-I،PKS-II ، NRPS  و غیره) یک روش مؤثر در شناسایی ترکیبات بوده (16) و از طرف دیگر، غربالگری این ژنها می­تواند در کشف سویه­های با پتانسیل بالا برای تولید متابولیتهای ثانویه جدید بسیار حیاتی و ارزشمند باشد زیرا تعدادی از خوشه­های ژنی سنتز کننده متابولیت ثانویه تحت شرایط کشت استاندارد غیرفعال یا خاموش بوده و ممکن است برای تولید به یک سری محرک نیاز داشته باشند.

(آ)

(ب)

(پ)

(ت)

در واقع سو­یه­های غیرفعال زیستی تحت شرایط کشت مناسب، توانایی ژنتیکی برای تولید متابولیتهای ثانویه مفید را دارند (11). وو (Wu) و همکاران در سال 2011 با کلونینگ قطعات ژنی با سایز پیش­بینی شده برای NRPS و PKS در پانی­باسیلوس سویه  F6-B70 و تعیین توالی چند کلون و مقایسه آنها با توالیهای ثبت شده در NCBI شاهد تشابه کمتر از 81 درصد با متابولیتهای ثانویه شناخته شده بودند که به احتمال زیاد نشان دهنده آن است که باکتری ممکن است میزبان آنزیمهای جدید برای سنتز متابولیتهای ثانویه باشد.

در واقع آنها معتقد بودند که شرایط کشت موجود در مطالعه لزوماً بیان تمام ژنهای NRPS  و PKS را امکان­پذیر نمی­سازد (24). این نکته در عصر مقاومت به آنتی­بیوتیک و نیاز بسیار بالا برای کشف سریهای جدید آنتی­بیوتیک بسیار حائز اهمیت است.   

(ث)

(ج)

شکل 3- درخت فیلوژنی با تخمین بیزین برای توالی­های تقریبا کامل ناحیه بین دومینهای KS و MT در PKS-I (آ: ردیف نوکلئوتیدی و ب: آمینواسیدی)، بخشی از زیرواحد KSα در PKS-II (پ: ردیف نوکلئوتیدی و ت: آمینواسیدی) و ناحیه بین موتیف­های حفظ شده A3 و A7 در NRPS (ث: ردیف نوکلئوتیدی و ج: آمینواسیدی) ببه ترتیب در سه سویه Iz8، F9 و F6. احتمال شاخه­ای گره­ها در زیر هر شاخه نوشته شده است.