نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه شهید باهنر کرمان

2 گروه زیست شناسی، دانشگاه پیام نور، تهران

3 دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته کرمان

چکیده

یکی از اولین اثرات تنش‌های مختلف، تغییر در بیان ژن‌های مربوط می‌باشد. بنابراین مطالعه بیان ژن برای بررسی اثر تنش دارای اهمیت ویژه است. بررسی بیان یک ژن نیاز به اندازه‌گیری دقیق و تجدید پذیر میزان mRNA به صورت کمی یا نیمه‌کمی دارد. برای بهینه‌سازی (نرمال کردن) داده‌ها، انتخاب ژن‌های کنترل درونی (مرجع یا خانه‌دار) مناسب، که بیان آن‌ها در طول تیمار نوسان نداشته باشند، اهمیت دارد. ژن‌های GAPDH و EF1α در بسیاری مطالعات بعنوان ژن‌های مرجع استفاده می‌شوند. در این پژوهش بیان این دو ژن تحت پیش‌تیمار اسپرمین ( صفر و 1/0 میلی مولار) و شوری (صفر و 80 میلی مولار سدیم کلرید) و پایداری بیان آنها در بافت برگ و ریشه گیاه کدو مورد بررسی قرار گرفت. بررسی بیان ژن‌های مرجع نشان داد که بیان ژن GAPDH در دو اندام متفاوت است و تحت تنش شوری و کاربرد اسپرمین نیز تغییر می‌نماید اما بیان EF1α نسبت به GAPDH در برگ و ریشه از پایداری بیشتری برخوردار است. بنابراین، نتایج پیشنهاد می‌کنند که ژنGAPDH نقش مهمی در مقاومت به تنش شوری در کدو ایفا می‌کند. همچنین استفاده از ژن مرجع EF1α در بهینه‌سازی بیان ژن را در کدو تحت تنش شوری پیشنهاد می‌کند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Comparison of two reference genes (GAPGH and EF1α) expression in medicinal pumpkin plant (Cucurbita pepo L.) during spermine pretreatment and salt stress

نویسنده [English]

  • Fatemeh Nejad Alimoradi 1 2

1 University of Kerman

2 University of Kerman

چکیده [English]

One of the first effects of various stresses is related Changes in gene expression. So, the study of the effect of stress on gene expression is of special importance. The analysis of gene expression requires precise and reproducible measurements for quantitative or semi-quantitative mRNA level. For normalization of the data, the selection of suitable internal control (reference or housekeeping) genes, whose expression do not fluctuate during treatments is important. The GAPDH and EF1α genes are used as reference genes in many studies. In this study, the expression of two reference genes under spermine (0 and 0.1 mM) pretreatment, salinity (0 and 80 mM NaCl), and the stability of their expression in leaves and roots of pumpkin were investigated. Study of the reference genes expression showed that the expression of GAPDH gene varied in both different organs and under salinity stress and spm application, but EF1α gene has more stable expression than GAPDH gene in the roots and leaves. Therefore, the results of this study suggest that GAPDH plays an important role in salt stress tolerance in pumpkin, and also EF1α, can be used as suitable reference gene for normalization of gene expression analysis in pumpkin under salinity stress.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Keywords: Normalization factor
  • Salinity
  • Semi-Quantitative expression

مقایسه بیان دو ژن مرجع GAPDH و EF1α در کدو (Cucurbita pepo L.) تحت پیش تیمار اسپرمین و تنش شوری

فاطمه نژادعلیمرادی1و2*، خسرو منوچهری کلانتری1، فاطمه نصیبی1، مسعود ترکزاده ماهانی3 و فرخنده رضانژاد1

1 کرمان، دانشگاه شهیدباهنر، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

2 تهران، دانشگاه پیام نور، گروه زیست شناسی

3 کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، گروه بیوتکنولوژی

تاریخ دریافت: 3/11/95                تاریخ پذیرش: 16/3/96

چکیده

یکی از اولین اثرات تنشهای مختلف، تغییر در بیان ژنهای مربوط می‌باشد. بنابراین مطالعه بیان ژن برای بررسی اثر تنش دارای اهمیت ویژه است. بررسی بیان یک ژن نیاز به اندازه‌گیری دقیق و تجدید پذیر میزان mRNA به صورت کمی یا نیمه‌کمی دارد. برای بهینه‌سازی (نرمال کردن) داده‌ها، انتخاب ژنهای کنترل درونی (مرجع یا خانه‌دار) مناسب، که بیان آن‌ها در طول تیمار نوسان نداشته باشند، اهمیت دارد. ژنهای GAPDH و EF1α در بسیاری مطالعات به عنوان ژنهای مرجع استفاده می‌شوند. در این پژوهش بیان این دو ژن تحت پیش‌تیمار اسپرمین ( صفر و 1/0 میلی مولار) و شوری (صفر و 80 میلی مولار سدیم کلرید) و پایداری بیان آنها در بافت برگ و ریشه گیاه کدو مورد بررسی قرار گرفت. بررسی بیان ژنهای مرجع نشان داد که بیان ژن GAPDH در دو اندام متفاوت است و تحت تنش شوری و کاربرد اسپرمین نیز تغییر می‌نماید اما بیان  EF1αنسبت به GAPDH در برگ و ریشه از پایداری بیشتری برخوردار است. بنابراین، نتایج پیشنهاد می‌کنند که ژن GAPDH نقش مهمی در مقاومت به تنش شوری در کدو ایفاء می‌کند. همچنین استفاده از ژن مرجع EF1α در بهینه‌سازی بیان ژن را در کدو تحت تنش شوری پیشنهاد می‌کند.

واژه های کلیدی: بیان نیمه‌کمی، شوری، فاکتور نرمال‌سازی

* نویسنده مسئول، تلفن: 09132498890، پست الکترونیکی: alimoradih60@sci.uk.ac.ir

مقدمه

 

تنش شوری، بسته به شدت و مدت تنش، تغییراتی در فرآیندهای فیزیولوژیکی و متابولیکی مختلف ایجاد و در نهایت منجر به مهار تولید محصول می‌شود (26). پلی‌آمینها از جمله اسپرمین، ترکیبات نیتروژنی آلیفاتیک با وزن مولکولی پایین و بار مثبت در pH فیزیولوژیکی هستند که در طیف وسیعی از موجودات از باکتریها تا گیاهان و جانوران یافت می‌شوند و به عنوان یکی از مؤثرترین املاح سازگار در برابر تنش زیست محیطی محسوب می‌شوند (14). نقش پلی‌آمینها در انواع فرآیندهای تنظیمی و سلولی مانند تقسیم و رشد طولی سلول، همانندسازی، رونویسی، ترجمه، ثبات غشاء و دیواره سلولی، سازمان‌دهی کروماتین، تشکیل ریبوزوم و مرگ برنامه‌ریزی شده سلولی مورد بررسی قرار گرفته است (14 و 19). بسیاری از مطالعات مربوط به مکانیسمهای دفاعی و تنش درگیاهان بر بیان ژن استوار بوده است. مطالعات رونوشت (ترانسکریپتوم) به ارائه درک بهتری از پاسخهای تنش گیاه کمک کرده اند (27). بیان ژن نیاز به سنجش همزمان ژن یا ژنهای مرجع (کنترل درونی یا خانه‌دار) دارد تا اطمینان حاصل شود که هر نوع تغییر در سیگنال هدف به دلیل تغییر در میزان الگوی استفاده شده جهت تنظیم PCR نیست. در حالت مطلوب، شرایط آزمایش نباید بیان ژن کنترل داخلی را تحت تأثیر قرار دهد (27). با این حال، برخی مطالعات هم نشان داده است که ژن خانه‌دار مورد استفاده برای کمی سازی بیان mRNA، می‌تواند تحت شرایط تجربی تغییر پیدا کند (6، 27، 30، 39 و 41). به این دلیل، پیشنهاد شده است که حداقل دو یا سه ژن مرجع باید به عنوان کنترل داخلی استفاده شود تا مانع خطاهای احتمالی حاصل از تغییرات بیان این ژنها شود (34 و 36 ). به هرحال، غالب محققین در مطالعات مولکولی از یک ژن کنترل داخلی استفاده می‌کنند و در بیشتر موارد، ژن اکتین جهت نرمال‌سازی بیان استفاده می‌شود در حالی که گزارشاتی هم وجود دارد که ژن اکتین بهترین کنترل داخلی مورد استفاده نیست زیرا در طول تیمارهای مختلف تغییرات بیان را نشان می‌دهد (27). همچنین به دلیل اینکه رونویسی زیرواحدهای ریبوزومی توسط داروها و عوامل بیولوژیکی تحت تأثیر قرار می‌گیرد بحثهای متعددی در خصوص استفاده rRNA ( 18Sو 28S) به عنوان کنترل درونی وجود دارد (36). در سالهای اخیر، پایداری بیان ژنهای مرجع در برخی گونه ها، بافتها و شرایط مختلف بررسی و نشان داده شده است که ژن مرجع در بافتهای مختلف در یک ژنوتیپ و همچنین بافت یکسان در ژنوتیپهای مختلف، متفاوت است. این تغییر بیان ژن مرجع، ضرورت بررسی پایداری ژن مرجع در همه نمونه های مورد آزمایش را تأیید می‌کند (9، 12، 17، 24 و 37).

مطالعات روی بیان ژنهای مرجع بیشتر روی بافتهای انسانی، باکتریها و ویروسها انجام شده اند (30). مطالعات محدودی در این زمینه روی برخی گیاهان انجام شده است که از جمله می‌توان به جو (11)، برنج (21)، سپیدار (40)، آرابیدوپسیس و توتون (28 و 38)، قهوه و گل اطلسی (9 , 24)، سیب زمینی تحت تیمارهای خشکی، سرما و شوری (27)، گوجه فرنگی تحت تیمار نیتروژن، سرما و نور (23)، آفتابگردان طی 6 مرحله متفاوت نمو برگ (15) اشاره کرد. به طور معمول، ژنهای GAPDH، ژنهای ریبوزومی، سیکلوفیلین، اکتین و EF1α به عنوان مرجع در گیاهان گزارش شده‌اند اما آدنین‌فسفوریبوزیل ترانسفراز (Aprt) و توبولین نیز در برخی موارد استفاده قرار گرفته‌اند (27 و 30) بیان این ژنها تا حد کمتری نسبت به سایر ژنهای مرجع یا ژنهای هدف نوسان دارد. به هر حال، گزارشهای اخیر نشان داده‌اند که حتی برخی از شناخته‌شده‌ترین این ژنها که به میزان زیاد نیز استفاده می‌شوند به دلیل بیان متغیر، جهت نرمال‌سازی بررسی بیان، مناسب نمی‌باشند (6، 39 و 41). کدو (C. pepo) یک محصول زراعی اقتصادی مهم و حساس به شوری، به خصوص در مرحله گیاهچه است (43). مطالعات مروری انجام شده نشان داد که هیچ مطالعه منتشر شده‌ای در مورد بهترین و پایدارترین ژن مرجع در کدو و حتی خانواده آن، تحت تنش شوری وجود ندارد. بنابراین، با توجه به گسترش خاکهای شور در کشور و مطالعات بیان ژن به عنوان عوامل تأثیر پذیر اولیه تحت تنشهای مختلف، مطالعات بیان ژن و مکانیزمهای درگیر در شوری مهم می‌باشد. در این راستا، اولین قدم انتخاب ژن مرجع مناسب به عنوان کنترل داخلی برای نرمال‌سازی داده‌های مربوط به ژنهای هدف، می‌باشد. در این تحقیق پایداری دو ژن مرجع GAPDH و EF1α در گیاهان قرار گرفته در معرض اسپرمین و تنش شوری، به منظور ارزیابی میزان آنها به عنوان کنترل داخلی در مطالعات بیان مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

کشت گیاه و تیماردهی: دانه‌های کدو سبز یا کدو تخم پوست کاغذی (Cucurbita pepo) در پتری‌ دیشهای حاوی دو لایه کاغذ صافی که با آب مقطر استریل مرطوب شده بودند، در تاریکی و دمای 25 درجه سانتی گراد به مدت 48ساعت جوانه زدند. بعد از ظهور گیاهچه‌ها، دسته های 5تایی از گیاهچه ها به ظروف پلاستیکی که هر کدام حاوی 6 لیتر محلول غذایی هوگلند با رقت 2/1 ( pH= 6.2±0.1)‌ بودند تحت کشت هیدروپونیک منتقل شدند. گیاهچه‌های 10روزه با اندازه یکنواخت جهت تیمار دهی با محلولهای غذایی مختلف پیش‌تیمار شدند: (1) کنترل: محلول غذایی هوگلند، (2) اسپرمین (سیگما) (صفر و 1/0 میلی مولار) که به محلول غذایی اضافه شد. پس از 5 روز پیش‌تیمار اسپرمین، هر دو گروه با کلرید سدیم) صفر و 80 میلی مولار) به مدت 7 روز تیمار شدند. در این تیمارها نیز نمک کلرید سدیم به محلول غذایی تازه اضافه شد. محلول غذایی هر 2 روز یکبار عوض و با پمپ هوا هوادهی می‌شد. آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی و با 3 تکرار انجام شد. هر تکرار حاوی ظرف پلاستیکی با 5گیاه بود. نمونه‌برداری برگ و ریشه برای بررسی شاخصهای مولکولی 7 روز پس از تیماردهی انجام شد.

استخراج RNA: RNAکل از برگ و ریشه تازه گیاه (100 میلی‏گرم) با استفاده از کیت استخراج RNA (Qiagene, RNeasy Plant Mini Kit, Germany) به روش ذکر شده در کیت استخراج شد. برای بررسی حضور و ارزیابی خلوص و تعیین غلظت RNA از روشهای اسپکتوفتومتری با دستگاه نانودراپ (NanoDrop 2000C Spectrophometer, Thermo Scientific, USA ) در طول موجهای 260 و 280 نانومتر و الکتروفورز افقی (BioRad, PowerPac Universal, USA) روی ژل آگارز 1 درصد استفاده شد. پس از الکتروفورز، ژل در دستگاه ژل اسکن مدل MO25889 (UVitec BTS) قرار ‏گرفت و از روی میزان درخشش باندهای مشاهده شده می‏توان مقدار و سالم بودن RNA و همچنین وجود ناخالصی از نوع DNA را تخمین زد (32). به منظور حذف آلودگی احتمالی DNA از آنزیم DNase شرکت تاکارا (TAKARA Bio Inc. DNase I, RNase-free) و به روش ذکر شده در کیت استفاده شد. برای این منظور، ابتدا به یک تیوب عاری از RNase مقدار 1 میکروگرم (µl 5 ) RNA، 1 میکرولیتر بافر (10X Reaction Buffer with MgCl2) و 1 میکرولیتر آنزیم DNase اضافه گردید و سپس حجم آن با آب DEPC به 10 میکرولیتر رسید و به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه قرار گرفتند. به منظور مهار عمل آنزیم DNase مقدار 1 میکرولیتر EDTA (50 mM) به مواد قبل اضافه شده و به مدت 10 دقیقه در دمای 65 درجه قرار گرفت. از این RNA تیمار شده با آنزیم DNase برای ساخت cDNA در مراحل بعد استفاده گردید.

طراحی آغازگر‌: اولین مرحله در شناسایی ژن، طراحی آغازگر‌های مناسب و استفاده از آنها در واکنش‌PCR است. از آنجاکه توالی ژنهای مورد نظر نامشخص بود، آغازگرها بر اساس توالیهای ژن موجود از سایر گیاهان طراحی گردیدند. اگرچه اولویت با گیاهان همجنس یا هم خانواده است اما از آنجا که تاکنون ژن  GAPDHدر هیچ گیاه همجنس یا هم خانواده گیاه مورد مطالعه شناسایی نشده بود از توالی ژن GAPDH در گیاهان سایر خانواده‌ها و توالی ژنEF1α  از گیاه هم خانوده، استفاده شد. به این منظور توالی ژن GAPDH در Betula luminifera (Accession no: KM586058.1)، Medicago truncatula (Accession no: XM_003595990.2) وPrunus cerasifera(Accession no: KP765685.1)، توالی ژنEF1α  از گیاه هم خانواده، در Cucumis melo (Accession no: XM_008459007, XM_008465698) از بانک ژن NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) گرفته شد. همردیفی توالیها با استفاده از نرم‌افزار ClustalW2 صورت گرفت. براساس نقاط حفاظت شده موجود، آغازگرهایی با استفاده از نرم‏افزارGeneious  طراحی گردیدند و سپس مناسب بودن آنها به وسیله نرم‏افزار BLAST مورد بررسی قرار گرفت. سنتز آغازگرهای طراحی شده توسط شرکت پیشگام صورت گرفت و تخلیص آنها با روش MOPC انجام شد. طبق روش شرکت، محلول ذخیره و محلول کاری با استفاده از آغازگرهای لیوفیلیزه تهیه شدند.

ساخت cDNA و انجام RT-PCR: برای انجام RT-PCR، از RNA کل استخراج شده از ریشه و برگ که با آنزیم DNase تیمار شده بود استفاده گردید. بدین منظور با استفاده از کیت ساخت cDNA شرکت فرمنتاز (RevertAid First Strand CDNA Synthesis Kit) و طبق روش ذکر شده در آن از روی RNA تیمار شده، رشته اول cDNA تهیه گردید. در نهایت از این cDNA در PCR به عنوان DNA الگو استفاده شد. مراحل ساخت cDNA به صورت زیر است: مقدار 6 میکرولیتر از RNA تیمار شده با DNase به همراه 1 میکرولیتر آغاز گر oligo(dT)18 و 5 میکرولیتر آب دیونیزه در یک میکروتیوب 2/0 میلی‌لیتری ریخته شده و سپس به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه قرار گرفت. این دما موجب از بین رفتن ساختارهای ثانویه RNA می‌شود. بلافاصله میکروتیوب حاوی مواد به مدت 2 تا 3 دقیقه بر روی یخ قرار گرفت. این مرحله موجب اتصال آغازگر‌های Oligo(dT)18 به RNA می‌شود. آغاز گر Oligo(dT)18 با اتصال به دم پلیA موجود در سمت ́3 mRNA های یوکاریوتی، موجب ساخت cDNA از روی این mRNAها می‌شود. در این مرحله 4 میکرولیتر بافر آنزیم (5X Reaction Buffer)، 1 میکرولیتر RiboLock RNase Inhibitor (20 u/µl)، 2 میکرولیتر dNTP (10 mM dNTP Mix) و 1 میکرولیتر RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase (200 u/µl) به میکروتیوب اضافه و به مدت 1 ساعت در دمای 42 درجه قرار گرفت. در این دما آنزیم RT (Reverse transcriptase) به دنبال آغازگر oligo(dT)18 و با استفاده از dNTPها از روی mRNAهای موجود، cDNA را می‏سازد. واکنش پایانی به مدت 5 دقیقه در دمای 70 درجه انجام گرفت. واکنشهای تیمار RNA برای حذف آلودگی DNA و ساخت cDNA در دستگاه ترموسایکلر مدل PTC 1148 ( MJ Mini Personal Termal Cycler BioRad, USA) انجام شد.

مطالعات بیان ژن: از cDNA ساخته شده، به عنوان DNA الگو در واکنش PCR برای بررسی بیان ژن همساخت GAPDH و EF1α در برگ و ریشه گیاه مورد مطالعه، استفاده شد. بررسی بیان ژن با استفاده از واکنش PCR به صورت نیمه کمی و با استفاده از کیت PCR شرکت تاکارا EmeraldAmp® GT PCR Master Mix, TAKARA Bio Inc)) و طبق روش ذکر شده در کیت صورت پذیرفت. برای این منظور 50 نانوگرم cDNA، 1 میکرولیتر از آغازگرهای اختصاصی پیشبرنده و برگرداننده با غلظت نهایی 5/0 میکرو‌مولار، 10 میکرولیتر مستر میکس (EmeraldAmp® GT PCR Master Mix,) درون لوله لیوفیلیزه PCR ریخته و با آب دو بار تقطیر استریل به حجم 20 میکرولیتر رسانده و با پیپت کردن، به‌طور کامل مخلوط شد. PCR توسط ترموسایکلر مدل 1148 PTC (MJ Mini Personal Termal Cycler BioRad, USA) و طبق مراحل ذکر شده در جدول1 انجام شد. پس از بهینه‌سازی واکنش PCR و استفاده از سیکلهای مختلف و انجام آن در شرایط بهینه، کیفیت محصول روی ژل آگارز 1 درصد بررسی شد. کمی‌سازی داده‌ها و شدت نسبی باندها با نرم افزار ImageJ اندازه گیری شد.

آنالیز آماری داده ها: آزمایشها بر اساس طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد. آنالیز آماری داده ها با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه توسط نرم افزار SAS انجام شد و برای مقایسه میانگین تیمارها از آزمون دانکن در سطح خطای 05/0 استفاده شد. 

نتایج

مطالعات بهینه‌سازی سنتز پرایمرها، طول قطعه تکثیر شده برای بیان ژن و شرایط بهینه‌سازی برنامه PCR برای دو ژن مرجع همساخت GAPDH و EF1α در جدول 1 نشان داده شده است.

 

 

 

جدول1- توالی آغازگرهای طراحی شده، طول قطعه انتخابی و برنامه PCR برای بیان ژنهای EF1α و GAPDH در کدو (C. pepo)

ژن

توالی آغازگر

(جفت باز)طول قطعه

PCR  شرایط

EF1α

F: 5ʹ-GAGATGAACAAGAGGTCATTCAAGTATGC-3ʹ

R: 5'-GAAATACCAGCCTCAAAACCACCAGT -3'

 

242

یک سیکل 5 دقیقه در 95 درجه سانتیگراد، 27سیکل 45 ثانیه در 94درجه، 45ثانیه در 57درجه، 45 ثانیه در 72 درجه و یک سیکل 10 دقیقه در 72درجه

GAPDH

F: 5ˊ-ACCTTGGAAATAAATGGGAAG-3ˊ

R:5ˊ- CTTCTGTGTTGCTGTAGTTGC-3ˊ

363

یک سیکل 5 دقیقه در 95 درجه سانتیگراد، 32سیکل 45 ثانیه در 94درجه، 45ثانیه در 60 درجه، 45 ثانیه در 72 درجه و یک سیکل 10 دقیقه در 72درجه

         

 

الکتروفورز محصول PCR روی ژل آگارز یک درصد نشـان داد کـه قطعه اختصاصی برای ژن GAPDH و EF1α به ترتیب به طول تقریبی 363 و 242 جفـت بـاز به خوبی تکثیر شده است (شکل 1).

 

شکل 1- تکثیر قطعات 363 و 242جفت بازی مربوط به ژنهای مرجع GAPDH و  EF1αدر گیاه کدو (C. pepo) به ترتیب از چپ به راست: M- مارکر، 1- کنترل منفی مربوط به GAPDH، 2- قطعه تکثیر شده 363 جفت بازی GAPDH، 3- کنترل منفی مربوط به EF1α و 4- قطعه تکثیر شده 242جفت بازی EF1α

برای ارزیابی ثبات بیان ژنهای کنترل داخلی، میزان بیان RNA برای همه نمونه ها (برگ و ریشه در شرایط کنترل و تیمار) تحت شرایط پیش‌تیمار با اسپرمین و تنش شوری اندازه گیری شد. شدت بیان دو ژن مرجع GAPDH و  EF1α در برگ و ریشه گیاه در شکل 2 و 3 نشان داده شده است. همان‌گونه که در این شکلها نشان داده شده است سطح بیان ژن GAPDH در دو اندام مورد مطالعه و نیز تحت تیمارهای مختلف واکنشهای متفاوتی نشان داد. بیان این ژن در هر دو اندام ریشه و برگ، تحت تنش شوری افزایش یافت اما پیش‌تیمار اسپرمین به ترتیب منجر به افزایش و کاهش سطح بیان در ریشه و برگ شد. برخلاف این ژن، میزان بیان ژن EF1α در هر دو اندام ریشه و برگ گیاه در شرایط تیماری مختلف، تغییر معنی‌داری نشان نداد و در همه اندا‌مها و تیمارهای استفاده شده به نسبت یکسان بود (شکلهای 2 و 3).

 

 
شکل2- الگوی بیان ژنهای GAPDH و  EF1αدر برگ (A) و ریشه (B) گیاه کدو (C. pepo) تحت شرایط شاهد (Con)، پیش‌تیمار اسپرمین (Spm=0.1 mM)، تنش شوری (NaCl= 80 mM) و برهمکنش این دو (Spm+NaCl= 0.1+80mM).
 
 
 
 
 
 
 
شکل3- اثرات اسپرمین برون‌زاد بر سطح بیان نسبی ژنهای مرجع GAPDH و EF1α در برگ (A) و ریشه (B)کدو (C. pepo) تحت تنش شوری. شدت هر باند ژن با نرم افزار ImageJ اندازه‌گیری شد و اندازه‌گیری ها میانگین 3تکرار ± خطای استاندارد می‌باشند. حروف مشابه هر ستون نشانگر عدم اختلاف معنی داری بر اساس آزمون دانکن در سطح 05/0 می‌باشد.


به‌طور قابل توجه بیان این ژن در شرایط PCR مشابه ژن GAPDH (32 سیکل)، بسیار بالا بود و حتی با کاهش سیکلها به 27 و 20 نیز بیان بالاتر و به نسبت پایدار این ژن دیده شد. چون در شرایط 32 سیکل میزان اشباع خیلی بالا بود، در نتیجه تعداد سیکل 27 برای آنالیز بیان استفاده شد که خیلی از شرایط ژن مرجع دیگر دور نباشد. 

بحث

برای اینکه مطالعات بیان ژن درست و دقیق باشد، تهیه آغازگر اختصاصی، طول قطعه مناسب، شرایط بهینه واکنش PCR و انتخاب کنترل داخلی مناسب لازم می‌باشد. الکتروفورز محصول PCR روی ژل آگارز یک درصد نشـان داد کـه قطعه اختصاصی برای ژن GAPDH و EF1α به ترتیب به طول تقریبی 363 و 242 جفـت بـاز به خوبی تکثیر شده است. ایـن مطلـب نشـان دهنـده طراحی و عملکرد صحیح آغازگرها می‌باشد. 

انتخاب ژن کنترل داخلی مناسب، جهت تعیین بیان ژن حتی در مطالعات اولیه مولکولی خیلی مهم است و این ژن باید طوری انتخاب شود که کمترین میزان تغییرات را در اندامهای مختلف و نیز در شرایط تیماری متفاوت نشان دهد، در حالی که ژن هدف به طور معمول وابسته به شرایط آزمایش، به میزان زیادی تغییر می‌نماید (27 و 30). مطالعه ژنهای مرجع نشان می‌دهد که در اغلب گیاهان از جمله گیاه مورد مطالعه، این ژنها و به ویژه ژنهایی که در اندامهای مختلف و در تنشهای مختلف پایداری نشان می‌دهند شناسایی نشده‌اند. غالب محققین در مطالعات مولکولی از یک ژن کنترل داخلی استفاده می‌کنند و ژن اکتین اغلب جهت نرمال‌سازی بیان استفاده می‌شود در حالی که گزارشاتی هم وجود دارد که ژن اکتین بهترین کنترل داخلی مورد استفاده نیست زیرا در طول تیمارهای مختلف تغییرات بیان را نشان می‌دهد (27). استفاده ار چندین ژن کنترل داخلی ( حداقل دو ژن) جهت مقایسه سطوح بیان ژن توسط Thellin و همکاران (1999) توصیه شده است (34). Vandesompele و همکاران (2002) دلایل و شواهدی ارائه کردند که روند نرمال‌سازی معمول بر اساس یک ژن کنترل داخلی منجر به نرمال‌سازی اشتباه می‌شود (36). اخیراً پایداری بیان ژنهای مرجع در برخی گونه‌ها، بافتها و شرایط مختلف بررسی شده است (6، 13، 39 و 41). مطالعات در قهوه و گل اطلسی نشان داد که ژن مرجع در بافتهای مختلف در یک ژنوتیپ و همچنین بافت یکسان در ژنوتیپهای مختلف، متفاوت است. این تغییر بیان ژن مرجع، ضرورت بررسی پایداری ژن مرجع در همه نمونه‌های مورد آزمایش را تأیید می‌کند (9 و 24). در این تحقیق، نتایج بیان دو ژن مرجع GAPDH و EF1α در کدو واکنش متفاوت نشان داد به این صورت که بیان GAPDH هم در اندامهای متفاوت و هم تحت تیمارهای مختلف استفاده شده نوسان داشت اما میزان بیان ژن  EF1αدر همه آزمایشات به نسبت یکسان بود. در نتیجه ژن EF1α به عنوان اولین ژن پایدار کنترل درونی برای گونه مورد مطالعه معرفی شد که به عنوان اولین گزارش به عنوان ژن مرجع پایدار برای این گونه شناسایی و معرفی شد. مشابه این نتایج، تغییر ژنهای مرجع در برخی گیاهان دیگر، در اندامها، مراحل نموی و نیز تحت تیمارهای مختلف گزاراش شده است. برای مثال، تغییر ژنهای مرجع در سیب زمینی تحت تیمارهای خشکی، سرما و شوری (27)، گوجه فرنگی تحت تیمار نیتروژن، سرما و نور (23)، آفتابگردان طی 6 مرحله متفاوت نمو برگ (15)، گندم در برهمکنش با بیمارگر Mycosphaerella graminicola (6) و سپیدار طی مراحل متفاوت نموی گیاه (40) گزارش شده است. همچنین، مشابه نتایج این تحقیق، گزارشاتی در مورد تغییرپذیری بیان ژن GAPDH که به وفور به عنوان ژن مرجع استفاده می‌شود وجود دارد (6، 27، 30، 39، 41 و 42). Zhang و همکاران در 2011 گزارش کردند که بیان ژن GAPDH تحت شوری در برنج افزایش می‌یابد به طوری که با تراریختی گیاه و بیش‌بیان آن، مقاومت گیاه به شوری افزایش یافت. آنها گزارش کردند که تحت تنش، گروههای واکنش‌پذیر اکسیژن افزایش می‌یابند و کاتالاز به عنوان آنزیم اصلی در پاک‌سازی این گونه‌ها فعالیت می‌کند. ضمن تراریختی گیاه مورد مطالعه و کاهش فعالیت کاتالاز، حساسیت گیاهان به شوری افزایش یافت. این محققین گزارش کردند که بیش‌بیان GAPDH، بیان ژن کاتالاز را تحت تأثیر قرار می‌دهد و از این طریق در پاک‌سازی رادیکالهای آزاد درگیر می‌شود و به عنوان آنتی‌اکسیدان عمل می‌کند (42). بنابراین ممکن است افزایش بیان این ژن در گیاه کدو تحت اثر شوری، نشان دهنده نقش دفاعی آن در برابر شوری و نیز تنظیم فعالیت کاتالاز می‌باشد. از طرفی مطالعات در آرابیدوپسیس نشان داده است که آنزیم GAPDH به طور مستقیم با H2O2 برهمکنش دارد که نشان دهنده نقش آن در تنظیم سیگنالینگ وابسته به گونه‌های واکنش‌پذیر اکسیژن در گیاهان می‌باشد. همچنین گزارش شده است که این ژن نقش چند عملکردی دارد و در حفظ ATP سلولی، متابولیسم کربوهیدرات، مقاومت در برابر تنشهای غیر زیستی و باروری عادی در آرابیدوپسیس دخالت دارد (31). گزارشات نشان می‌دهد فعالیت آنزیمی GAPDH گلیکولیتیک در طول عفونت افزایش می‌یابد. افزایش فعالیت گلیکولیتیک منجر به ترویج بقای سلول می‌شود. علاوه بر این، محصول اصلی گلیکولیز پیروات می‌باشد، که یک ربایشگر مستقیم ROS است. بنابراین، در گیاهان وحشی تحت پاسخهای ایمنی، افزایش گلیکولیز ممکن است از طریق افزایش سطوح پیروات رباینده ROS حائز اهمیت باشد. علاوه بر این، سیگنالینگ دفاعی گیاه یک فرآیند پر انرژی است. گلیکولیز ATP تولید می‌کند. بنابراین، افزایش در فعالیت GAPDH گلیکولیتیک طی تنش می‌تواند انرژی اضافی مورد نیاز برای برنامه ریزی مجدد سلولی در ارتباط با دفاع را فراهم کند. به هر جهت، اینکه آیا GAPDH به طور مستقیم در پاک‌سازی ROS نقش دارد هنور ناشناخته است (18). به هرحال، نتایج مخالفی نیز وجود دارد به طوری که Gu و همکاران (2011) گزارش کرده‌اند از بین هشت ژن مرجعی که تحت تنشهای مختلف درگیاه داودی بررسی شده است، GAPDH پایدارترین ژن مرجع در تنش گرما، پنجمین ژن پایدار در تنش آلودگی با شته و سومین ژن پایدار تحت تنش غرقابی بود (16). همچنین Petriccione و همکاران (2015) دو ژن GAPDH و protein phosphatase 2A (PP2A)، را به عنوان پایدارترین ژنهای مرجع در برگ کیوی آلوده با باکتری سودوموناس گزارش کردند (29). Cruz و همکاران در 2009 نیز گزارش کردند که GAPDH به عنوان مناسب‌ترین ژن مرجع در بین هشت ژن مورد مطالعه، جهت نرمال‌سازی در برگهای ارقام مختلف قهوه، انتخاب شد (13). بنابراین این ژن به تنهایی نمی‌تواند ژن مرجع باشد و ممکن است منجر به نتایج اشتباه در شرایط آزمایش خاص شود. مطالعات بیشتری در مورد عملکرد و تغییرات این ژن در سلولهای حیوانی وجود دارد که نشان داده‌اند GAPDH نه فقط به عنوان یک جزء مسیر گلیکولیتیک عمل می‌کند، بلکه ممکن است در فرآیندهای دیگری از جمله تکثیر سلول و ایجاد سرطان دخالت داشته باشد (25). همچنین اسمعیلی و همکاران (1389) در بررسی بیان ژن GAPDH در بیماران مبتلا به سرطان سینه گزارش کردند که این ژن به عنوان ژن مرجع مناسب توصیه نمی‌شود (1). مطالعات در خصوص اثر پلی‌آمین اسپرمین بر بیان ژن GAPDH نادر است. پیشنهاد شده است پلی‌آمینها نقش اساسی در تنظیم پاسخهای دفاعی گیاهان به تنشهای زیست محیطی متنوع شامل سمیت فلزی، تنش اکسیداتیو، خشکی، شوری و تنش سرما دارند و این نقش آنها در تحمل به تنش به تعدیل سیستمهای آنتی‌اکسیدانی مربوط می‌شود (14 و 22). به نظر می‌رسد اسپرمین از طریق تجمع یونهای سدیم ناشی از تنش شوری در ریشه گیاه و جلوگیری از انتقال این یون به بخش هوایی گیاه مقاومت گیاه به شوری را افزایش می‌دهد. بنابراین ریشه گیاه که مستقیم (کشت هیدروپونیک) در معرض شوری قرار دارد بیان ژن GAPDH بالاتری را نشان داده ولی در برگ احتمالاً از طریق مهار انتقال یون سدیم و اثرات آنتی‌اکسیدانی اسپرمین میزان بیان آن کاهش یافته است.

EF1α در گزارشات متعددی به عنوان یک کنترل داخلی ثابت معرفی شده است که با نتایج این تحقیق مطابقت دارد. در مطالعه ای که روی هفت ژن کنترل داخلی (بتا-توبولین، سیکلوفیلین، اکتین، EF1α،18S rRNA ،آدنین فسفوریبوزیل ترانسفراز و پروتئین L2 ریبوزومی سیتوپلاسمی) گیاه سیب زمینی تحت تنشهای مختلف زیستی و غیر زیستی انجام شده گزارش شده است که از بین هفت ژن ذکر شده، EF1α پایدارترین ژن کنترل داخلی است، در حالی که اکتین و توبولین کمترین میزان پایداری بیان ژن را نشان دادند (27). همچنین این ژن در طیف گسترده ای از شرایط آزمایشی که در سیب زمینی، هلو و برنج انجام شده است از پایداری بیان بیشتری برخوردار بوده است (10، 27 و 35) به طوری که در سیب زمینی و گوجه فرنگی تحت تنش سرما (23 و 27)، برنج تحت تنش گرما و سرما (10)، و گل داودی تحت تنش گرما (16) پایدار بوده است. همچنین در مطالعه‌ای که اخیراً بر روی گیاه رستاخیزی craterostigma plantagineum تحت تنش کم‌آبی توسط Juszczak و Bartels (2017) انجام شده است EF1α به عنوان پایدارترین ژن مرجع در این گیاه انتخاب شده است (20). به هرحال بر خلاف نتایج ذکر شده، Qi و همکاران (2010) نتایج ضد و نقیضی گزارش کردند. آنها بیان کردند که سطح بیان این ژن در گیاه کلم تحت تنش خشکی پایدار نیست و GAPDH بهترین ژن مرجع در این شرایط است اما از طرفی گزارش نمودند EF1α بهترین انتخاب برای نرمال‌سازی بیان ژن درمیان بافتهای مختلف گیاه کلم می باشد (30). ژن کنترل داخلی ایده آل، باید سطح بیان ثابتی در تمام شرایط آزمایش داشته باشد، با این حال، هیچ ژنی وجود ندارد که بیان بسیار ثابت در تمام شرایط داشته باشد. هنگام انتخاب ژنهای مرجع، جانب احتیاط باید رعایت شود حتی هنگامی که بیان آن ژن مرجع تحت چندین شرایط و گونه وابسته به هم ثابت باشد. در این بررسی نیز بر روی نمونه‌های برگی و ریشه گیاه و تحت شرایط مختلف آزمایش بیان متفاوتی از ژنهای مرجع مشاهده شد. بنابراین برای نرمال‌سازی سطح بیان، انتخاب ژن کنترل داخلی خیلی مهم است. قابل ذکر است که در مطالعات مروری منتشر شده به ویژه مطالعات داخل کشور دیده شد که اغلب محققین از یک ژن مرجع استفاده می‌کنند (2، 3، 4، 5، 7 و 8). در این تحقیق نیز در ابتدا ژن GAPDH با توجه اینکه در اغلب مطالعات به عنوان کنترل داخلی استفاده شده گزارش شده بود انتخاب شد (2، 4، 5، 7 و 33). بیان غیر یکنواخت این ژن در اندامها و تیمارهای مختلف این تحقیق باعث انجام مطالعات بیشتر و در نهایت انتخاب ژن EF1α، شناخته شده به عنوان پایدارترین ژن مرجع تحت تنشهای زیستی و غیر زیستی، شد (6 و 27). در روند عملکرد این دو ژن در اندامهای مختلف و نیز تحت تنش تفاوت چشمگیری مشاهد شد. به طوری که برعکس GAPDH، ژن EF1α از پایداری به نسبت کاملی برخوردار بود و به همین دلیل به مطالعه سایر ژنهای مرجع پرداخته نشد. ممکن است کار محققین دیگر روی تنش نبوده است یا یک اندام را استفاده می‌کردند و یا در گیاه آنها تغییرات این ژن وجود نداشته است و یا خطای کار را نادیده گرفتند. با توجه به نتایج این تحقیق به محققان توصیه می‌شود که بهینه‌سازی ژن مرجع، اولین قدم در مطالعات مولکولی می‌باشد تا گریبان‌گیر مشکلات احتمالی مشابه این تحقیق نشوند. 

1-  اسمعیلی، ر. مجید زاده اردبیلی، ک. عبدلی، ن. 1389. اندازه گیری ژن uPA در سرطان پستان: انتخاب ژن خانه‌دار. فصلنامه بیماری‌های پستان ایران. جلد 3 (3 و 4). صفحه 7-15.

2- تقی‌زاده، م. احسانپور، ع.ا. بررسی اثر کلرید کبالت بر سطح برگ، کروفیل، کاروتنوئید و بیان ژن ACC اکسیداز گیاه سیب‌زمینیSolanum tuberosum  در کشت در شیشه. 1392. مجله سلول و بافت. جلد4 (3). صفحه 287-295.

3- جدیر، س. دهقان نیری، ف. 1394. بررسی بیان ژنهای عوامل رونویسی MADS-box مؤثر در تشکیل گل زعفران (Crocus sativus L.). مجله پژوهش‌های سلولی و مولکولی (مجله زیست‌شناسی ایران)، شماره 4. صفحه 488-499.

4- حسین‌پناهی، ژ. معروفی، ا. بهرام‌نژاد، ب. 1395. جداسازی و الگوی بیان ژن ß-آمیرین‌سنتاز در سطح رونوشت در گیاه دارویی کاسنی ( Cichorium intibus L. ). مجله ژنتیک نوین، شماره3. صفحه 399-409.

5-  شمسی‌فرد، م.ح. 1392. بررسی بیان ژن ژرانیل‌دی‌فسفات‌سنتاز در سطح رونوشت در بافتهای مختلف گیاه دارویی سیاه‌دانه .(Nigella sativa L.) پایان‌نامه کارشناسی ارشد. دانشگاه کردستان. 

6- غلام‌نژاد، ج. سنجریان، ف. محمدی گل تپه، ا. صفایی، ن. رضوی، خ. 1394. ارزیابی میزان تغییرات بیان ژنهای خانه‌دار در برهمکنش گندم با بیمارگر Mycosphaerella graminicola با روش Reverse northern dot blot. مجله زیست فناوری گیاهان زراعی، شماره 12. صفحه 1-10.

7-  موسوی، س.ط. جعفریان، و. بهاری، ع. 1395. بررسی مولکولی و تعیین ویژگی‌های عملکردی جلبک Chlorella با رویکرد بیان ژن هیدروژناز. مجله زیست‌شناسی گیاهی ایران، شماره29. صفحه 21-36.

8- میرشمسی کاخکی، ا. بهرامی، ا.ر. شهریاری‌احمدی، ف. ا. گری، ج. 1392. بررسی بیان ژن ein2 در گیاه اطلسی
(Petunia hybrida) و مطالعه نقش تنظیم‌کنندگی آن در مسیر انتقال پیام اتیلن. مجله پژوهش‌های سلولی و مولکولی (مجله زیست‌شناسی ایران)، شماره 4. صفحه 572- 586.

 

9- Barsalobres-Cavallari C.F. Severino F.E. Maluf M.P. and Maia I.G. 2009. Identification of suitable internal control genes for expression studies in Coffea arabica under different experimental conditions. BMC molecular biology 10(1):1.

10- Brunner A.M. Yakovlev I.A. and Strauss S.H. 2004. Validating internal controls for quantitative plant gene expression studies. BMC plant biology 4(1):14

11- Burton R.A.. Shirley N.J. King B.J. Harvey A.J. and Fincher G.B. 2004. The CesA gene family of barley. Quantitative analysis of transcripts reveals two groups of co-expressed genes. Plant physiology. 134(1):224-236.

12- Chen L. Zhong H.y. Kuang, J.f. Li, J.g. Lu, W.j. Chen J.y. 2011. Validation of reference genes for RT-qPCR studies of gene expression in banana fruit under different experimental conditions. Planta. 234(2):377-390.

13-  Cruz F. Kalaoun S. Nobile P. Colombo C. Almeida J. Barros L.M. Romano E. Grossi-de-Sá M.F. Vaslin M. and Alves-Ferreira M. 2009. Evaluation of coffee reference genes for relative expression studies by quantitative real-time RT-PCR. Molecular Breeding. 23(4):607-616.

14- Fariduddin Q. Mir, B.A. Yusuf M. Ahmad A. 2013. Comparative roles of brassinosteroids and polyamines in salt stress tolerance. Acta physiologiae plantarum. 35(7):2037-2053.

15- Fernandez P. Di Rienzo J.A. Moschen S. Dosio G.A. Aguirrezábal L.A. Hopp H.E. Paniego N. and Heinz R.A. 2011. Comparison of predictive methods and biological validation for qPCR reference genes in sunflower leaf senescence transcript analysis. Plant cell reports. 30(1):63-74.

16- Gu C. Chen S. Liu Z. Shan H. Luo H. Guan Z. and Chen F. 2011. Reference gene selection for quantitative real-time PCR in Chrysanthemum subjected to biotic and abiotic stress. Molecular Biotechnology. 49(2):192-197.

17- Guénin S. Mauriat M. Pelloux J. Van Wuytswinkel O. Bellini C. Gutierrez L. 2009. Normalization of qRT-PCR data: the necessity of adopting a systematic, experimental conditions-specific, validation of references. Journal of experimental botany. 60(2):487-493.

18- Henry E. Fung N. Liu J. Drakakaki G. and Coaker G. 2015. Beyond glycolysis: GAPDHs are multi-functional enzymes involved in regulation of ROS, autophagy, and plant immune responses. PLoS Genet 11(4):e1005199.

19- Hussain S.S. Ali, M. Ahmad M. Siddique K.H. 2011. Polyamines: natural and engineered abiotic and biotic stress tolerance in plants. Biotechnology advances. 29(3):300-311.

20- Juszczak I. and Bartels D. 2017. LEA gene expression, RNA stability and pigment accumulation in three closely related Linderniaceae species differing in desiccation tolerance. Plant Science. 255:59-71.

21- Kim B.R. Nam H.Y. Kim S.U. Kim S.I. and Chang Y.J. 2003. Normalization of reverse transcription quantitative-PCR with housekeeping genes in rice. Biotechnology letters. 25(21):1869-1872.

22- Liu J.H. Wang W. Wu H. Gong X. and Moriguchi T. 2015. Polyamines function in stress tolerance: from synthesis to regulation. Frontiers in plant science. 6:827.

23- Løvdal T. and Lillo C. 2009. Reference gene selection for quantitative real-time PCR normalization in tomato subjected to nitrogen, cold, and light stress. Analytical biochemistry. 387(2):238-242.

24- Mallona I. Lischewski S. Weiss J. Hause B. and Egea-Cortines M. 2010. Validation of reference genes for quantitative real-time PCR during leaf and flower development in Petunia hybrida. BMC Plant Biology. 10(1):4

25- McNulty S.E. and Toscano W. 1995. Transcriptional regulation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase by 2, 3, 7, 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Biochemical and biophysical research communications. 212(1):165-171.

26- Munns R. 2005. Genes and salt tolerance: bringing them together. New phytologist 167:645-663.

27- Nicot N. Hausman J.F. Hoffmann L. and Evers D. 2005. Housekeeping gene selection for real-time RT-PCR normalization in potato during biotic and abiotic stress. Journal of experimental botany, 56(421):2907-2914.

28- Orsel M. Krapp A. and Daniel-Vedele F. 2002. Analysis of the NRT2 nitrate transporter family in Arabidopsis. Structure and gene expression. Plant physiology. 129:886-896.

29- Petriccione M. Mastrobuoni F. Zampella L. and Scortichini M. 2015. Reference gene selection for normalization of RT-qPCR gene expression data from Actinidia deliciosa leaves infected with Pseudomonas syringae pv. actinidiae. Scientific reports. 5:16961.

30- Qi J. Yu S. Zhang F. Shen X. Zhao. Yu Y. and Zhang D. 2010. Reference gene selection for real-time quantitative polymerase chain reaction of mRNA transcript levels in Chinese cabbage (Brassica rapa L. ssp. pekinensis). Plant Molecular Biology Reporter. 28:597-604.

31- Rius S.P. Casati P. Iglesias A.A. and Gomez-Casati D.F. 2008. Characterization of Arabidopsis lines deficient in GAPC-1, a cytosolic NAD-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Plant physiology. 148(3):1655-1667.

32- Sambrook J. and Russell D.W. 2001. In vitro mutagenesis using double-stranded DNA templates: selection of mutants with DpnI. Molecular cloning. 2:13-19.

33- Suzuki T. Higgins P. Crawford D. 2000. Control selection for RNA quantitation. Biotechniques 29:332-337.

34- Thellin O. Zorzi W. Lakaye B. De Borman B. Coumans B. Hennen G. Grisar T. Igout A. and Heinen E. 1999. Housekeeping genes as internal standards: use and limits. Journal of biotechnology. 75:291-295.

35- Tong Z. Gao Z. Wang F. Zhou J. and Zhang Z. 2009. Selection of reliable reference genes for gene expression studies in peach using real-time PCR. BMC Molecular Biology. 10(1):71.

36- Vandesompele J. De Preter K. Pattyn F. Poppe B. Van Roy N. De Paepe A. and Speleman F. 2002. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome biology. 3(7): research0034-1.

37- Vashisth T. Johnson L.K. Malladi A. 2011. An efficient RNA isolation procedure and identification of reference genes for normalization of gene expression in blueberry. Plant cell reports. 30:2167-2176.

38-  Volkov R.A. Panchuk I.I. and Schöffl F. 2003. Heat‐stress‐dependency and developmental modulation of gene expression: the potential of house‐keeping genes as internal standards in mRNA expression profiling using real‐time RT‐PCR. Journal of Experimental Botany. 54:2343-2349.

39- Wu Z.J. Tian C. Jiang Q. Li X.H. and Zhuang J. 2016. Selection of suitable reference genes for qRT-PCR normalization during leaf development and hormonal stimuli in tea plant (Camellia sinensis). Scientific reports, 6:19748.

40- Xu M. Zhang B. Su X. Zhang S. and Huang M. 2011. Reference gene selection for quantitative real-time polymerase chain reaction in Populus. Analytical biochemistry. 408(2):337-339.

41- Yang Y. Zhang X. Chen Y. Guo J. Ling H. Gao S. Su Y. Que Y. and Xu L. 2016. Selection of Reference Genes for Normalization of MicroRNA Expression by RT-qPCR in Sugarcane Buds under Cold Stress. Frontiers in plant science. 7:86.

42- Zhang X.H. Rao X.L. Shi H.T. Li R.J. and Lu Y.T. 2011. Overexpression of a cytosolic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene OsGAPC3 confers salt tolerance in rice. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 107:1-11.

43- Zhu J.K. 2001. Plant salt tolerance. Trends Plant Science.6:66-71.