نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه شهید مدنی آذربایجان

2 گروه زیست شناسی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان

چکیده

به کارگیری آنزیم‌ها در حلال‌های آلی برای مصارف صنعتی و صنایع داروسازی حائز اهمیت می‌باشد. کاهش فعالیت آنزیم‌ها در حضور حلال‌های آلی می‌تواند به دلیل سخت شدن ساختار پروتئینی آنزیم‌ها در حلال‌های آلی ، واسرشتگی و مهار آنزیمی باشد. معمولا پایداری آنزیم‌ها نیز در حلال‌های آلی کاهش می‌یابد. برای رفع این مشکل می توان از روش‌های پایدارسازی پروتئین‌ها نظیر افزودنی‌ها، مهندسی پروتئین و تغییرات شیمیایی استفاده نمود. در این تحقیق ابتدا آنزیم اندوگلوکاناز Aacel9A تولید و سپس فعالیت و پایداری آنزیم در درصدهای مختلفی از حلال-های آلیn –پروپانول، دی متیل فرمامید (DMF) و دی متیل سولفواکسید (DMSO) مورد بررسی قرار گرفت. در نهایت برای پایدارسازی آنزیم از افزودنی‌ ساکارز استفاده گردید. نتایج نشان داد که حلال DMSO در غلظت‌های 5 % و 10 % باعث افزایش فعالیت آنزیم و در غلظت‌های بالاتر باعث کاهش فعالیت آنزیم شد. بقیه حلال‌ها از همان غلظت‌های پایین باعث کاهش فعالیت آنزیم شدند که در این میان DMF بیشترین تأثیر را بر روی کاهش فعالیت آنزیم داشت. پایداری آنزیم توسط ساکارز در حضور حلال دی متیل سولفواکسید در مقایسه با سایر حلال‌ها بیشتر بود. افزودن ساکارز تاثیر قابل ملاحظه ای بر پایداری آنزیم در حضور حلال های -nپروپانول و DMF نداشت.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The effect of organic solvents on the activity and stability of the endoglucanase and stabilization with sucrose

نویسنده [English]

  • Saeed Najavand 2

2 Azarbaijan Shahid Madani University

چکیده [English]

: The use of enzymes in organic solvents is the important for industrial and pharmaceutical industries. Reduced activity of enzymes in the presence of organic solvent could be due to the rigidity of the protein structure , denaturation and inhibition. Usually, the stability of enzymes in organic solvents decreases. To fix the problem, protein stabilization methods such as additives, protein engineering and chemical changes used. In this study, endoglucanase enzyme was produced, then the activity and stability of the enzyme in the different percentages of organic solvents, n -Propanol, Dimethylformamide (DMF) and dimethyl sulfoxide (DMSO) were studied. Finally, sucrose as additives was used for the stabilization of enzyme. The results showed that the solvent DMSO in concentrations of 5% and 10% increased the enzyme activity. The enzyme activity was reduced at higher concentrations of this solvent. Other solvents reduced the activity of enzyme from the low concentrations, among which DMF had the most effect on the reduction of enzyme activity. Stability of the enzyme by sucrose in the presence of the solvent DMSO was more in comparison with other solvents. Added sucrose had no effect on the stability of the enzyme in the presence of solvents n- propanol and DMF.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Aacel9A enzymes
  • Organic solvents
  • stability
  • cosolvents
  • sucrose

تأثیر حلالهای آلی بر فعالیت و پایداری آنزیم اندوگلوکاناز و پایدارسازی آن با ساکارز

معصومه محمدی1، سعید نژاوند1*، محمد پاژنگ1 و علیرضا امانی قدیم2

1 تبریز، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان. دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی 

2 تبریز، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان. دانشکده علوم پایه، گروه شیمی

تاریخ دریافت: 26/8/95                تاریخ پذیرش: 16/3/96

چکیده

به کارگیری آنزیمها در حلالهای آلی برای مصارف صنعتی و صنایع داروسازی حائز اهمیت می­باشد. کاهش فعالیت آنزیمها در حضور حلالهای آلی می­تواند به دلیل سخت شدن ساختار پروتئینی آنزیمها در حلالهای آلی، واسرشتگی و مهار آنزیمی باشد. معمولاً پایداری آنزیمها نیز در حلالهای آلی کاهش می­یابد. برای رفع این مشکل می­توان از روشهای پایدارسازی پروتئینها نظیر افزودنیها، مهندسی پروتئین و تغییرات شیمیایی استفاده نمود. در این تحقیق ابتدا آنزیم اندوگلوکاناز AaCel9A تولید و سپس فعالیت و پایداری آنزیم در درصدهای مختلفی از حلالهای آلیn –پروپانول، دی متیل فرمامید (DMF) و دی متیل سولفواکسید (DMSO) مورد بررسی قرار گرفت. در نهایت برای پایدارسازی آنزیم از افزودنی ساکارز استفاده گردید. نتایج نشان داد که حلال DMSO در غلظتهای 5 و 10 درصد باعث افزایش فعالیت آنزیم و در غلظتهای بالاتر باعث کاهش فعالیت آنزیم شد. بقیه حلالها از همان غلظتهای پایین باعث کاهش فعالیت آنزیم شدند که در این میان DMF بیشترین تأثیر را بر روی کاهش فعالیت آنزیم داشت. پایداری آنزیم توسط ساکارز در حضور حلال دی متیل سولفواکسید در مقایسه با سایر حلالها بیشتر بود. افزودن ساکارز تأثیر قابل ملاحظه­ای بر پایداری آنزیم در حضور حلالهای -nپروپانول و DMF نداشت.

واژه های کلیدی: آنزیم اندوگلوکاناز، حلالهای آلی، پایدارسازی، افزودنی، ساکارز

* نویسنده مسئول، تلفن: 09127123560، پست الکترونیکی: S.najavand@azaruniv.ac.ir

مقدمه

 

استفاده از آنزیمها در محیطهای حاوی حلالهای آلی روز به روز در حال افزایش است. آنزیمها در حضور حلالهای آلی خواص و ویژگیهای جدیدی پیدا می­کنند که در محیطهای آبی این ویژگیها هرگز دیده نمی­شود (11 و 32). استفاده از آنزیمها در حلالهای آلی مزایایی همچون برگشت معادله ترمودینامیکی واکنشهای هیدرولیز، جلوگیری از ایجاد واکنشهای جانبی وابسته به آب، افزایش پایداری دمایی به دلیل کاهش تحرک ساختاری، کاهش خطر رشد میکروبی، بازیابی و استفاده مجدد آنزیم و راحت­تر شدن استفاده از سوبستراهای حساس به رطوبت دارد (9، 19، 28، 30 و 31). با این حال اغلب حلالهای آلی فعالیت و پایداری آنزیمها را کاهش می­دهند. کاهش فعالیت آنزیمها در حلالهای آلی می­تواند به دلیل سخت شدن ساختار پروتئینی آنزیمها در حلالهای آلی، واسرشتگی و مهار آنزیمی باشد. حلالهای آلی با جدا کردن مولکولهای آب از اطراف پروتئین باعث تخریب ساختار سه بعدی یا دناتوره شدن آنها شود، استفاده از آنزیمها در محیطهای حاوی حلالهای آلی همواره با چالشهای بزرگی روبرو بوده است (15 و 23). سلولازها از آنزیمهای پرکاربرد و جزء آنزیمهای صنعتی می­باشند که قادر به هیدرولیز پیوندهای گلیکوزیدی می­باشند (14). از کاربردهای این آنزیم می­توان به استفاده آن در صنایع غذایی، کاغذسازی، نساجی، کشاورزی، صنایع شویندگی و نیز تولید سوختهای زیستی مانند بیواتانول اشاره کرد (34). از مهمترین سلولازها، می توان به β-1,4 اندوگلوکانازها اشاره کرد زیرا این آنزیمها سوبستراهای سلولزی را به طور تصادفی از داخل مورد هدف قرار داده و سوبسترای مورد نیاز برای بقیه سلولازها را فراهم می­کنند که هیدرولیز کامل سلولز را در پی دارد. آنزیم اندوگلوکاناز آلیسیکلوباسیلوس اسیدوکالداریوس یک آنزیم منومر با 537 آمینواسید و وزن مولکولی 59 کیلودالتون می­باشد و متعلق به زیر خانواده E1 از خانواده 9 گلیکوزیدهیدرولازهاست (12 و 13). شکل 1 ساختار سوم این آنزیم را نشان می­دهد.

 

شکل1- ساختار کریستالوگرافی آنزیم AaCel9A. دمین کاتالیتیکی، دمین شبهIg ، جایگاه اتصال فلزات و جایگاه فعال نشان داده شده است.

برای استفاده آنزیم در صنعت باید پایداری آنزیم در فرآیندهای صنعتی را که در شرایط فیزیکی و شیمیایی خاصی انجام می­شوند بهبود بخشید، زیرا ساختار آنزیم حین استفاده در فرآیند­های صنعتی ممکن است واسرشته شده و بنابراین آنزیم فعالیت کاتالیزوری خود را از دست بدهد. به دلیل استفاده گسترده سلولاز در صنایع مختلف از یک طرف و ضرورت استفاده از حلالهای آلی در صنعت از طرف دیگر، پایدارسازی سلولاز در حضور حلالهای آلی امری اجتناب ناپذیر است. برای رفع این مانع می­توان از روشهای پایدارسازی پروتئینها همچون استفاده از افزودنیها، مهندسی پروتئین و تغییر شیمیایی آنزیمها بهره برد (17، 21، 25، 26 و 36)، که در این میان افزودنیها به ویژه پلی­آلها به علت کاربرد آسان و هزینه نسبتاً پایین اهمیت قابل ملاحظه­ای دارند. در میان افزودنیها، ساکارز در علم بیوشیمی و داروسازی توجه زیادی را به خود جلب کرده است چرا که باعث پایداری پروتئینها در مقابل شرایط حاد محیطی نظیر دماهای بالا و محلولهای نمکی می­شود. ساکارز با افزایش کشش سطحی و دور­شدگی ترجیحی باعث پایدارسازی پروتئین می­شود (7، 10 و 20). در این تحقیق ابتدا آنزیم اندوگلوکاناز AaCel9A تولید و تخلیص گردید، سپس فعالیت و پایداری آنزیم اندوگلوکاناز در حضور حلالهای آلی مختلفn –پروپانول، دی متیل فرمامید (DMF) و دی متیل سولفواکسید (DMSO) مورد ارزیابی قرار گرفت. در نهایت از افزودنی ساکارز برای پایدارسازی آنزیم در حضور حلالها استفاده گردید.

مواد و روشها

مواد استفاده شده در این تحقیق: کربوکسی متیل سلولز (CMC)، 5،3-دی نیترو سالسیلیک اسید (DNS)، ساکارز و حلالهای مورد استفاده در این تحقیق از شرکت مرک  تهیه گردید.

تولید آنزیم اندوگلوکاناز در باکتری اشریشیا کلی: وکتور نوترکیب pET21a حاوی ژن اندوگلوکاناز AaCel9A ساخته شده در آزمایشگاه (27) برای بیان به اشریشیاکلی سویه بیانی BL21 منتقل گردید. از القاگر ایزوپروپیل بتا تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG) با غلظت یک میلی­مولار جهت بیان آنزیم در دمای 22 درجه سانتی گراد به مدت 21 ساعت استفاده گردید. پروتئین نوترکیب تولید شده با روش شوک حرارتی به مدت 10 دقیقه در دمای 70 درجه سانتی گراد تخلیص نسبی گردید. این نوع تخلیص براساس عدم پایداری پروتئینهای باکتریایی در دماهای بالا و در نتیجه غیر فعال شدن ساختار و تجمع آنهاست. در دمای بالا دمینهای هیدروفوب پروتئینهای مزوفیل در سطح قرار می­گیرند و با هم میانکنش واندروالسی داده، باعث اتصال و در نهایت تجمع پروتئینها و رسوب آنها می­شوند، در حالی که پروتئینهای ترموفیل همچون آنزیم اندوگلوکاناز AaCel9A در دمای بالا ساختار طبیعی خود را حفظ می­کنند و به صورت محلول باقی می­مانند. در نهایت تخلیص کامل این آنزیم با ستون نیکل آگارز صورت گرفت.

تعیین فعالیت آنزیم اندوگلوکاناز: برای تعیین فعالیت آنزیمی، 50 میکرولیتر سوبسترای CMC 1 درصد) 1 گرم CMC حل شده در 100 میلی­لیتر بافر فسفات با 7pH=)  با 50 میکرولیتر آنزیم به مدت 3 دقیقه در دمای 65 درجه انکوبه شد. توقف واکنش آنزیمی با افزودن معرف 3، 5 دی نیترو سالسیلیک اسید (معرف برنفیلد) و جوشاندن میکروتیوب واکنش به مدت 5 دقیقه در آبجوش صورت گرفت (22). برای سنجش میزان سرهای احیاءکننده آزاد حاصل از واکنش آنزیمی بر روی سوبسترای CMC، جذب نمونه­ نسبت به بلانک آنزیمی در طول موج 540 نانومتر (اسپکتروفتومتر JASCO UV/VIS) خوانش شد. میزان سرهای آزاد حاصل از واکنش آنزیمی بر طبق منحنی استاندارد گلوکز تعیین گردید (27). واحد فعالیت آنزیمی به صورت مقدار آنزیمی که بتواند یک میکرومول سر احیا کننده را در مدت زمان یک دقیقه در شرایط واکنش ایجاد ­کند، تعریف شد.

تعیین فعالیت آنزیم اندوگلوکاناز در حضور حلالهای آلی: برای ارزیابی فعالیت آنزیم در حضور حلالهای آلی، درصدهای مختلفی (حجمی به حجمی از صفر تا 25 درصد) از حلالهای آلی n-پروپانول،DMF  وDMSO  در بافر فسفات 50 میلی­مولار با 7pH= تهیه و تعیین فعالیت آنزیم در حضور هر یک از این حلالها انجام پذیرفت. حلالهای مذکور به ترتیب افزایش Log P و قابل امتزاج بودن با آب انتخاب شدند (5 و 8). درصد فعالیت باقیمانده آنزیم با در نظر گرفتن فعالیت آنزیم در محیط واکنش بدون حلال به عنوان کنترل (فعالیت 100 درصد)، محاسبه گردید.

بررسی پایداری آنزیم اندوگلوکاناز در مقابل حلالها: برای بررسی پایداری حرارتی آنزیم در مقابل حلالهای آلی، غلظت 10 درصد از حلالهای آلی n-پروپانول،DMF  و DMSO در بافر فسفات 50 میلی­مولار با 7 pH=تهیه گردید. پایداری آنزیم در غلظتهای بالاتر از 10 درصد حلال هم مورد بررسی قرار گرفت ولی به علت افت ناگهانی پایداری آنزیم در غلظتهای بالاتر از 10 درصد (نتایج نشان داده نشده است) همان غلظت 10 دصد انتخاب گردید. سپس 50 میکرولیتر آنزیم به میکروتیوبهای حاوی 100 میکرولیتر از هر یک از حلالهای آلی منتقل گردید و میکروتیوبها به مدت 0، 5، 10، 15 ،20 و 25 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد انکوبه شدند و بعد از گذشت 30 دقیقه از  قرارگیری آخرین میکروتیوب بر روی یخ، فعالیت آنزیمی مانند مراحل قبل اندازه­گیری گردید. قابل ذکر است که میکروتیوب حاوی آنزیم AaCel9A بدون حلال آلی در دمای 65 درجه سانتی گراد و زمانهای انکوباسیون ذکر شده به عنوان نمونه کنترل در نظر گرفته شد.

بررسی پایداری آنزیم اندوگلوکاناز در حضور غلظتهای مختلف ساکارز: ابتدا غلظتهای 0، 10، 20، 30، 40، 60 و 80 درصد از ساکارز در بافر فسفات 50 میلی­مولار با  7pH= تهیه گردید. مقدار 50 میکرولیتر از این غلظتها به میکروتیوبهای حاوی 50 میکرولیتر آنزیم اضافه شد به طوری که غلظت نهایی ساکارز در این میکروتیوبها به ترتیب 0، 5، 10، 15، 20، 30 و 40 درصد گردید. سپس نمونه­ها به مدت 10 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد انکوبه و سپس به مدت 30 دقیقه برای بازسازی ساختار بر روی یخ منتقل شدند. بعد از گذشت 30 دقیقه  نمونه­ها در مجاورت سوبسترا قرار گرفتند و فعالیت آنزیمی مانند مراحل قبل اندازه­گیری گردید.

بررسی پایداری آنزیم اندوگلوکاناز در مقابل حلالها با حضور ساکارز 20 درصد: برای ارزیابی پایداری آنزیم به وسیله ساکارز، مقدار 75 میکرولیتر از آنزیم به میکروتیوب حاوی 75 میکرولیتر محلول حاوی حلالها و ساکارز اضافه شد به طوری که درصد نهایی حلال و ساکارز به ترتیب 10 درصد و 20 درصد شد. نمونه­ها به مدت 0، 5، 10، 15و 20 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد قرارگرفتند. سپس میکروتیوبها به مدت 30 دقیقه در یخ گذاشته شده و فعالیت باقیمانده آنزیمی مانند مراحل قبل اندازه­گیری گردید. زمان صفر دقیقه انکوباسیون به عنوان فعالیت 100 درصد در نظر گرفته شد. نتایج فعالیت آنزیم در حضور حلالهای آلی با نتایج فعالیت آنزیم در حضور حلالهای آلی و ساکارز مقایسه شد.

نتایج

بیان و تخلیص آنزیم اندوگلوکاناز AaCel9A: آنزیم اندوگلوکاناز با شرایط ذکر شده در قسمت قبل تولید و تخلیص گردید. نتایج نشان داد که وزن مولکولی آنزیم اندوگلوکاناز تولید شده حدود 59 کیلودالتون می­باشد (شکل2).

 

شکل 2- ژل SDS-PAGE. چاهک 1 مربوط به پروتئین آلبومین سرم گاوی (BSA) به عنوان مارکر پروتئینی با وزن مولکولی 66 کیلودالتون، چاهک 2 مربوط به محصول سونیکاسیون، چاهک 3 مربوط به محصول تخلیص با شوک حرارتی (تخلیص نسبی)، چاهک 4 مربوط به محصول تخلیص با ستون Ni-NTA. همان طور که در شکل مشاهده می­شود آنزیم اندوگلوکاناز AaCel9A با وزن مولکولی تقریباً 59 کیلودالتون تولید و تخلیص شده است. 

فعالیت آنزیم اندوگلوکاناز در حضور حلالهای آلی: نتایج مربوط به فعالیت آنزیم اندوگلوکاناز AaCel9A در حضور حلالهای آلی در شکل 3 آمده است.

 

 

شکل3- فعالیت اندوگلوکاناز AaCel9A در حضور حلالهای DMSO، DMF و پروپانول


چنانچه در شکل مشاهده می­شود در غلظتهای 5 و 10 درصد از حلال DMSO فعالیت آنزیم افزایش یافته و در غلظتهای بالاتر فعالیت آن کاهش یافته است. DMF و n-پروپانول از همان غلظتهای پایین باعث کاهش فعالیت آنزیم شدند که این کاهش در مورد حلال DMF بیشتر بود. 

پایداری آنزیم اندوگلوکاناز در مقابل حلالهای آلی: شکل 4 پایداری آنزیم اندوگلوکاناز AaCel9A در حضور حلالهای DMSO، DMF و n-پروپانول را نشان می­دهد. همان طور که در شکل مشاهده می­شود پایداری آنزیم در حضور حلالهای آلی کاهش یافته است. از بین حلالهای مورد استفاده، n-پروپانول بیشترین و DMSO کمترین تأثیر را بر روی کاهش پایداری آنزیم مورد نظر داشته­اند.

 

 

شکل 4- پایداری آنزیم اندوگلوکاناز AaCel9A در حضور حلالهای DMSO، DMF و n-پروپانول. (نمونه کنترل مربوط به واکنش آنزیمی بدون حلال می­باشد)


پایداری آنزیم اندوگلوکاناز در حضور غلظتهای مختلف ساکارز: همان طوری که در شکل 5 مشاهده می­شود آنزیم مورد نظر بهترین پایداری خود را در غلظت 20 درصد ساکارز نشان داد. با توجه به نتایج شکل 5، غلظت 20 درصد ساکارز برای پایدارسازی آنزیم اندوگلوکاناز AaCel9A مورد استفاده قرار گرفت.

 

 

شکل 5- پایداری آنزیم در غلظتهای مختلف ساکارز


پایداری آنزیم اندوگلوکاناز در مقابل حلالها با حضور ساکارز 20 درصد: برای بررسی اثر ساکارز بر روی پایداری آنزیم اندوگلوکانازAaCel9A ، تأثیر آن بر روی پایداری آنزیم در حضور حلالهای مختلف مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج نشان ­داد که ساکارز در حضور حلال DMSO باعث پایداری آنزیم اندوگلوکاناز AaCel9A گردید. در حضور حلال n-پروپانول ساکارز تأثیر قابل ملاحظه­ای بر روی پایداری آنزیم نداشت و در مورد حلال DMF تقریباً هیچ تأثیری مشاهده نگردید (شکل 6).

 

 

 

شکل 6- پایداری آنزیم اندوگلوکاناز AaCel9A در مقابل حلالها با حضور ساکارز 20 درصد. (منحنی a: پایداری آنزیم در مقابل حلال DMSO، منحنی b: پایداری آنزیم در مقابل حلال پروپانول، منحنی c: پایداری آنزیم در مقابل حلال DMF)


بحث 

اغلب فرآیندهای آنزیمی در صنعت در دماهای بسیار بالا صورت می­گیرند و در این رابطه آنزیمهای ترموفیل از اهمیت ویژه ای برخوردار می­باشند. با توجه به کاربرد گسترده آنزیمهای ترموفیل نظیر اندوگلوکاناز  AaCel9A و آنزیمهایی نظیر پلی گالاکتوروناز در صنایع، بررسی پایداری این آنزیمها امری ضروری به نظر می­رسد (1). آنزیمها معمولاً در حلالهای آلی فعالیت و پایداری خود را از دست می­دهند. پروتئینها در محلولهای آبی به وسیله یک پوسته هیدراته احاطه می­شوند، در حضور حلالهای آلی، مولکولهای حلال تمایل دارند جایگزین مولکولهای آب موجود در سطح پروتئین شوند که نتیجه­اش تغییر فعالیت و ساختار پروتئین خواهد بود که اکثراً منجر به واسرشته شدن پروتئین نیز می­گردد (18 و 32). فعالیت آنزیمها در حلالهای آلی بنا به دلایلی همچون مهار، سخت شدگی و تخریب ساختار پروتئین کاهش می­یابد. در این مطالعه نیز فعالیت آنزیم اندوگلوکاناز در حضور حلالهای آلی کاهش یافته است. استثنای این امر غلظتهای پایین DMSO می­باشد چرا که در غلظتهای پایین DMSO فعالیت آنزیم به طور قابل ملاحظه­ای افزایش یافته است. این افزایش فعالیت دلایل مختلفی می­تواند داشته باشد. شان و هرسلیگ در سال 1999 نشان دادند که حضور غلظتهای پایین DMSO منجر به قوی­تر شدن پیوندهای هیدروژنی بین آنزیم تریوز فسفات ایزومراز و سوبسترا می­شود به طوری که بار در طی تبدیل حالت پایه به حالت انتقال بازآرایی می­شود ­و منجر به افزایش سرعت واکنش نسبت به آنزیم بدون حلال می­گردد، اما در غلظتهای بالاتر با توجه به رقابت مولکولهای حلال با مولکولهای سوبسترا در جایگاه فعال آنزیم مهار شروع می­گردد (29). در این مطالعه نیز فعالیت آنزیم اندوگلوکاناز در حضور غلظتهای پایین DMSO افزایش یافته است. احتمالاً آبپوشی ترجیحی و یا اتصال غیرترجیحی DMSO در غلظتهای پایین این حلال باعث می­شود که ساختار آنزیم در حالت طبیعی حفظ شود. با افزایش غلظت DMSO، آبپوشی ترجیحی جای خود را به اتصال ترجیحی DMSO می­دهد. اتصال ترجیحی DMSO با تغییرات ساختاری و دناتوره شدن آنزیم در ارتباط است (4). در مطالعه حاضر نیز با افزایش غلظت DMSO فعالیت آنزیم اندوگلوکاناز کاهش یافته است به طوری که در حضور غلظت 25 درصد از حلال DMSO، آنزیم توانسته است تنها 40 درصد از فعالیت کاتالیزی خود را حفظ نماید (شکل3). در مورد حلال n-پروپانول از همان غلظتهای پایین کاهش فعالیت آنزیم مشاهده شده که این کاهش احتمالاً بیشتر به دلیل تخریب ساختاری بوده چرا که حلالهای هیدروفیلیک تمایل بیشتری به جدا کردن آب ضروری اطراف پروتئین دارند. از آنجایی که بیش از 60 درصد فعالیت آنزیم اندوگلوکاناز در حضور غلظت 5 درصد DMF از بین رفته است (شکل 3) می­توان این کاهش فعالیت را به مهار آنزیم ربط داد (18 و 25). در مطالعه­ای مشابه نیز که توسط صدر ممتاز و همکاران انجام شده بود فعالیت آنزیم ترمولیزین در حضور غلظتهایv/v) ) 50-0 درصد حلالهای آلی دی ­متیل ­فرمامید، اتانول، متانول و ایزوپروپانول کاهش یافته بود (2). در مورد پایداری نیز آنزیم اندوگلوکاناز در مقابل حلال DMSO نسبت به بقیه حلالها پایداری بیشتری از خود نشان داد به طوری که آنزیم در حضور حلال 10 درصد در مدت زمان 10 دقیقه توانست بیش از 60 درصد از فعالیت خود را حفظ نماید در حالی که این میزان در مورد حلالهای DMF و n-پروپانول به کمتر از 10 درصد رسید (شکل 4). ژربرگ و همکاران نشان دادند که در غلظتهای پایین DMSO به علت کاهش بار سطحی آنزیم، فشردگی ساختار نسبتاً زیاد شده و این مساله باعث پایداری آنزیم در مقابل حلال DMSO  نسبت به بقیه حلالها می­گردد (35). در این مطالعه از افزودنی ساکارز جهت پایدارسازی آنزیم اندوگلوکاناز در مقابل حلالها استفاده گردید. پایداری آنزیمها معمولاً با افزایش Log P حلالها کاهش می­یابد. با افزایش میزان Log P، آبگریزی حلال و نیز میل به باز شدن ساختار پروتئین نیز افزایش می­یابد. ساکارز با افزایش کشش سطحی و دور شدن از سطح پروتئین باعث پایدارسازی آنزیم می­گردد (3، 20، 24 و 33). بر اساس نتایج، افزودن ساکارز تأثیر قابل قبولی بر پایداری آنزیم در حضور حلالهای n-پروپانول و DMF نداشت که این امر احتمالاً به عدم مؤثر بودن افزایش کشش سطحی توسط ساکارز در حلالهای مذکور مربوط می­باشد (10). تأثیر ساکارز بر پایداری آنزیم در حضور حلال DMSO قابل ملاحظه بود (شکل a6). در حضور ساکارز به دلیل افزایش کشش سطحی و افزایش تعداد پیوندهای هیدروژنی بین مولکولهای آب اطراف پروتئین اتصالات آنها به یکدیگر زیاد شده و بنابراین توانایی حلالها خصوصاً حلال DMSO در جدا کردن آب ضروری از اطراف پروتئین کاهش می­یابد و این امر می­تواند دلیل اصلی پایدار شدن آنزیم توسط ساکارز در حضور حلال DMSO باشد اما در مورد حلال DMF تقریباً هیچ تأثیری مشاهده نگردید. پروپانول مورد استفاده در این تحقیق الکل بوده و قطبیت کمتری دارد و از طریق میانکنش با پاکتهای آبگریز سطحی موجود در آنزیم باعث کاهش پایداری آنزیم می­شود (6 و 16). در حضور این حلال ساکارز تأثیر قابل ملاحظه­ای بر روی پایداری آنزیم نداشت. با توجه به مکانیسم متفاوت تخریب ساختار پروتئین در حضور این حلال نسبت به حلالهای قطبی اثر پایدارسازی ساکارز در حضور n-پروپانول کمتر می­باشد. با توجه به نتایج، حلال DMSO حلال مناسبی برای مصارف صنعتی سلولازها می­باشد، چرا که در حضور این حلال فعالیت و پایداری آنزیم به میزان کمی دستخوش تغییر می­شود همچنین در صورت نیاز می­توان از افزودنی ساکارز برای پایداری آنزیم در شرایط فیزیکوشیمیایی سخت بهره برد.

تشکر و قدردانی

نویسندگان مقاله از حمایت­های مالی معاونت پژوهش و فناوری دانشگاه شهید مدنی آذربایجان نهایت تشکر و قدردانی را دارند.

1- فهیمی بایرامی، ا.، فرخی، ن.، امین زاده، س. 1395. استخراج و پایداری و پارامترهای ترمودینامیکی یکی از پلی گالاکتورونازهای قارچ Macrophomiona phaseolina. مجله پژوهش­های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران). جلد 29، ص 234-243.

2- صدر ممتاز، ا.، اصغری، م. 1394. مطالعات مقایسه­ای مقاومت پروتئاز حاصل از سودوموناس آئروجینوزا در مقایسه با ترمولیزین حاصل از باسیلوس ترموپروتئولیتیکوس در حلالهای آلی. مجله پژوهش­های سلولی  و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران). جلد 28، ص 560-567.

 

3- Arakawa, T., & Timasheff, S. N. (1982). Stabilization of protein structure by sugars. Biochemistry, 21(25), 6536-6544.‏

4- Arakawa, T., Kita, Y., & Timasheff, S. N. (2007). Protein precipitation and denaturation by dimethyl sulfoxide. Biophysical chemistry, 131(1), 62-70.‏

5- Asghari, S. M., Khajeh, K., Dalfard, A. B., Pazhang, M., & Karbalaei-Heidari, H. R. (2011). Temperature, organic solvent and pH stabilization of the neutral protease from Salinovibrio proteolyticus: significance of the structural calcium. BMB reports, 44(10), 665-668.‏

6- Avdulov, N. A., Chochina, S. V., Daragan, V. A., Schroeder, F., Mayo, K. H., & Wood, W. G. (1996). Direct binding of ethanol to bovine serum albumin: a fluorescent and 13C NMR multiplet relaxation study. Biochemistry, 35(1), 340-347.‏

7- Back, J. F., Oakenfull, D., & Smith, M. B. (1979). Increased thermal stability of proteins in the presence of sugars and polyols. Biochemistry, 18(23), 5191-5196.

8- Badoei-Dalfard, A., Khajeh, K., Asghari, S. M., Ranjbar, B., & Karbalaei-Heidari, H. R. (2010). Enhanced activity and stability in the presence of organic solvents by increased active site polarity and stabilization of a surface loop in a metalloprotease. Journal of biochemistry, 148(2), 231-238.‏

9- Castillo, B., Pacheco, Y., Al-Azzam, W., Griebenow, K., Devi, M., Ferrer, A., & Barletta, G. (2005). On the activity loss of hydrolases in organic solvents: I. Rapid loss of activity of a variety of enzymes and formulations in a range of organic solvents. Journal of molecular catalysis b: enzymatic, 35(4), 147-153.‏

10- Cioni, P., Bramanti, E., & Strambini, G. B. (2005). Effects of sucrose on the internal dynamics of azurin. Biophysical journal, 88(6), 4213-4222.

11- Davis, B. G., & Boyer, V. (2001). Biocatalysis and enzymes in organic synthesis. Natural Product Reports, 18(6), 618-640.‏

12- Eckert, K., Zielinski, F., Leggio, L. L., & Schneider, E. (2002). Gene cloning, sequencing, and characterization of a family 9 endoglucanase (CelA) with an unusual pattern of activity from the thermoacidophile Alicyclobacillus acidocaldarius ATCC27009. Applied microbiology and biotechnology, 60(4), 428-436.‏

13- Eckert, K., Vigouroux, A., Leggio, L. L., & Moréra, S. (2009). Crystal structures of Aacidocaldarius endoglucanase Cel9A in complex with cello-oligosaccharides: strong− 1 and− 2 subsites mimic cellobiohydrolase activity. Journal of molecular biology, 394(1), 61-70.‏

14- Fogarty, W. M., & Kelly, C. T. (Eds.). (2012). Microbial enzymes and biotechnology. Springer Science & Business Media.‏

15- Griebenow, K., & Klibanov, A. M. (1996). On protein denaturation in aqueous-organic mixtures but not in pure organic solvents. Journal of the American Chemical Society, 118(47), 11695-11700.‏

16- Herskovits, T. T., Gadegbeku, B., & Jaillet, H. (1970). On the structural stability and solvent denaturation of proteins I. Denaturation by the alcohols and glycols. Journal of Biological Chemistry, 245(10), 2588-2598.‏

17- Khajeh, K., Ranjbar, B., Naderi-Manesh, H., Habibi, A. E., & Nemat-Gorgani, M. (2001). Chemical modification of bacterial α-amylases: changes in tertiary structures and the effect of additional calcium. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology, 1548(2), 229-237.‏

18- Klibanov, A. M. (1997). Why are enzymes less active in organic solvents than in water? Trends in biotechnology, 15(3), 97-101.‏

19- Klibanov, A. M. (2001). Improving enzymes by using them in organic solvents. Nature, 409(6817), 241-246.‏

20- Kumar, V., Chari, R., Sharma, V. K., & Kalonia, D. S. (2011). Modulation of the thermodynamic stability of proteins by polyols: significance of polyol hydrophobicity and impact on the chemical potential of water. International journal of pharmaceutics, 413(1), 19-28.‏

21- Lee, J. C., & Timasheff, S. N. (1981). The stabilization of proteins by sucrose. Journal of Biological Chemistry, 256(14), 7193-7201.‏

22- Miller, G.L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical chemistry, 31(3), 426-428.

23- Miroliaei, M., & Nemat-Gorgani, M. (2002). Effect of organic solvents on stability and activity of two related alcohol dehydrogenases: a comparative study. The international journal of biochemistry & cell biology, 34(2), 169-175.‏

24- Ohtake, S., Kita, Y., & Arakawa, T. (2011). Interactions of formulation excipients with proteins in solution and in the dried state. Advanced drug delivery reviews, 63(13), 1053-1073.‏

25- Pazhang, M., Khajeh, K., Ranjbar, B., & Hosseinkhani, S. (2006). Effects of water-miscible solvents and polyhydroxy compounds on the structure and enzymatic activity of thermolysin. Journal of biotechnology, 127(1), 45-53.‏

26- Pazhang, M., Mehrnejad, F., Pazhang, Y., Falahati, H., & Chaparzadeh, N. (2015). Effect of sorbitol and glycerol on the stability of trypsin and difference between their stabilization effects in the various solvents. Biotechnology and applied biochemistry.‏

27- Rahimizadeh, P., Najavand, S., & Pazhang, M. (2015). A comparative Study of Activity and Stability of the Free and the Immobilized Endoglucanase from Alicyclobacillus Acidocaldarius. Biomacromolecular Journal, 1(2), 167-176.

28- Rodakiewicz-Nowak, J., Kasture, S. M., Dudek, B., & Haber, J. (2000). Effect of various water-miscible solvents on enzymatic activity of fungal laccases. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 11(1), 1-11.‏

29- Shan, S. O., & Herschlag, D. (1996). The change in hydrogen bond strength accompanying charge rearrangement: Implications for enzymatic catalysis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 93(25), 14474-14479.

30- Simon, L. M., László, K., Vértesi, A., Bagi, K., & Szajáni, B. (1998). Stability of hydrolytic enzymes in water-organic solvent systems. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 4(1), 41-45.‏

31- Simon, L. M., Kotorman, M., Garab, G., & Laczko, I. (2001). Structure and activity of α-chymotrypsin and trypsin in aqueous organic media. Biochemical and biophysical research communications, 280(5), 1367-1371.‏

32- Simon, L. M., Kotormán, M., Szabó, A., Nemcsók, J., & Laczkó, I. (2007). The effects of organic solvent/water mixtures on the structure and catalytic activity of porcine pepsin. Process Biochemistry, 42(5), 909-912.‏

33- Street, T. O., Bolen, D. W., & Rose, G. D. (2006). A molecular mechanism for osmolyte-induced protein stability. Proceedings of the National Academy of Sciences, 103(38), 13997-14002.‏

34- Sukumaran, R. K., Singhania, R. R., & Pandey, A. (2005). Microbial cellulases-production, applications and challenges. Journal of Scientific and Industrial Research, 64(11), 832.‏

35- Tjernberg, A., Markova, N., Griffiths, W. J., & Hallén, D. (2006). DMSO-related effects in protein characterization. Journal of biomolecular screening, 11(2), 131-137.‏

36- Villalonga, R., Fernández, M., Fragoso, A., Cao, R., Mariniello, L., & Porta, R. (2003). Thermal stabilization of trypsin by enzymic modification with β‐cyclodextrin derivatives. Biotechnology and applied biochemistry, 38(1), 53-59.‏