بررسی هیستوپاتولوژی ترمیم زخمهای عمیق پوستی غیر عفونی با عصاره هیدروالکلی گیاهان مرزه کوهی، بادرنجبویه، سدر، گل ختمی و حنا

مهران میراولیایی¹، ریحانه چلونگر²، اکرم امین جعفری¹، اردشیر طالبی³ و مجید غیاث⁴

¹ اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده ع لوم، گروه زیست شناسی، بخش سلولی مولکولی

² یزد، دانشگاه پیام نور یزد، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

³ اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده پزشکی، گروه علوم پزشکی، بخش پاتولوژی

⁴ اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده جغرافیا و برنامه ریزی

تاریخ دریافت: 19/8/95                تاریخ پذیرش: 24/11/95

چکیده

ﺑـﺎ وﺟﻮد ﭘﻴـﺸﺮفتهای ﻋﻤـﺪه در درﻣﺎن زﺧﻢ، ترمیم ﺑﻪ ﻋﻨﻮان ﻳﻜﻲ از چالشهای مهم پیش رو ﺑﺎﻗﻲ ﻣﺎﻧﺪه اﺳﺖ. با توجه به خواص آنتی اکسیدانی، ضد میکروبی و ضد التهابی اثبات شده در گیاهان مرزه کوهی، بادرنجبویه، سدر، گل ختمی و حنا، تأثیر گیاهان نام برده ﺑﺮ روﻧﺪ ﺗﺮﻣﻴﻢ زﺧﻢ ﭘﻮﺳﺘﻲ و همچنین مقایسه با تتراسیکلین در ﻣﻮش ﺻﺤﺮاﻳﻲ مورد بررسی قرار گرفت. در این مطالعه 48 رأس رت نر همسان نژاد ویستار در 8 گروه 6 تایی به صورت کاملاً تصادفی دسته بندی شدند. پس از ایجاد زخم در رتها (شرایط یکسان) ، اثر عصاره هیدروالکلی گیاهان مرزه کوهی، بادرنجبویه، سدر، گل ختمی، حنا از یک سو و پماد تتراسیکلین (کنترل مثبت) از سوی دیگر، بر روند التیام زخم مورد بررسی قرار گرفت.  یک گروه به عنوان کنترل، یک گروه تحت تیمار عصاره هر گیاه و گروه دیگر نیز تحت تیمار مخلوط پنج گیاه (با غلظت gr/ml3/0( قرار گرفتند. بررسیهای ماکروسکوپی و هیستوپاتولوژی نشان داد که پس از هفت روز (با شدت کمتر) و بعد از چهارده روز تیمار (تقریباً به طور کامل)، ناحیه درم واپیدرم پوست ترمیم یافته است. بررسیهای میکروسکپی تفاوت معنادار را در میزان درصد بهبود لایه درم و اپیدرم پس از 14 روز تیمار (با پمادهای گیاهی)، در مقایسه با گروه کنترل، نشان می دهد (p<0.05). تیمار با عصاره گل ختمی (پس از چهارده روز) ، در روند بهبود ناحیه درم و اپیدرم نسبت به سایر گروهها چشمگیر تر است. ﻋﺼﺎره  هیدروالکلی  گیاه گل ختمی به واسطه داشتن ﺗﺮﻛﻴﺒﺎت ضدالتهابی و آنتی اکسیدانی ویژه، در مقایسه با سایر عصاره ها، در التیام لایه اپیدرم ودرم مؤثرتر عمل نموده است.

واژه های کلیدی: ترمیم زخم، بادرنجبویه، حنا، سدر، گل ختمی، مرزه کوهی، گیاهان دارویی.

* نویسنده مسئول، تلفن: 09123226158 ، پست الکترونیکی: mmiroliaei@yahoo.com

مقدمه

پوست سد دفاعی کاملاً مؤثر در برابر میکروارگانیسم‏ها و مواد مضراست. اما هنگامی این سد بیشترین تأثیر را دارد که سطح آن آسیب ندیده باشد. پوست به‌طور دائم از طریق ریزش سلولهای مرده و تولید سلولهای تازه، نوسازی می‌کند. در نتیجه سلولهای سطحی که به دلیل سایش، آسیب یا بیماری از دست می‌روند، سریعاً جایگزین می‌شوند. سلولهای جدید در اپیدرم (لایه فوقانی و پوشش محافظتی پوست) ساخته می‌شوند. هنگام بروز زخم‏ این لایه ممکن است عفونی شود و به باکتریها، که بعضی از آنها در سطح پوست زندگی می‌کنند، اجازه دهند که وارد جریان خون شوند. درمان ضد باکتری زخمها از عفونت جلوگیری می­کند. سلولهای مستقر در لایه زیرین درم،  بعد از آسیب پوست شروع به ساخت کلاژن نموده و سلولهای اپیتلیال را ترمیم می نمایند. بر این اساس ،یافتن عوامل درمانی برای ترمیم سریع تر لایة درم و اپیدرم در برابر آسیبهای پوستی اهمیت ویژه دارد. امروزه ﺍﺳـﺘﻔﺎﺩﻩ ﺍﺯ ﮔﻴﺎﻫﺎﻥ ﺩﺍﺭﻭﻳﻲ به منظور کاهش عوارض جانبی ناشی از مصرف داروهای شیمیایی ﺑﺮﺍﻱ ﺍﻫﺪﺍﻑ ﺩﺭﻣﺎﻧﻲ ﻣـﻮﺭﺩ ﺍﺳـﺘﻘﺒﺎﻝ ﻗﺮﺍﺭ ﮔﺮﻓﺘـﻪ ﺍﺳﺖ (18و19). به عنوان مثال، مرزه (Satureja bachtiarica) دارای اثرات ضد التهابی و ضد باکتری اثبات شده ناشی از ترکیبات موجود در آن شامل کارواکرول و فلاونوئیدها است (10). بادرنجبویه
(Melissa officinalis) به منظور درمان اختلالات گوارشی، زخم معده، بی اشتهایی در طب سنتی استفاده می شود و خواص درمانی متعدد مثل خصوصیات ضد باکتری، ضد قارچ، ضد ویروس ، آنتی اکسیدانی و به دام اندازی رادیکالهای آزاد دارد (5 و 15). گیاه سدر
(Ziziphus spina  christi ) به طور سنتی جهت تسریع بهبود زخمهای تازه (12) و سوختگی استفاده می شود(1)، همچنین این گیاه دارای اثرات ضد میکروبی است (2). از طرفی، پکتین موجود درگیاه گل ختمی
(Althaea officinalis) دارای اثر تحریک کنندگی سیستم ایمنی و فعالیت بهبود زخم است. استفاده از این گیاه در درمان بیماریهای پوستی از جمله اگزما گزارش شده است عملکرد آن را به تحریک فاگوسیتوز و فعال سازی ماکروفاژها نسبت می دهند (21). گیاه جالب توجه دیگر حنا
(Lawsonia inermis) است که برای درمان سوختگی و زخمهای دهانی کاربرد دارد (3). درمان با عصاره هیدروالکلی گیاه حنا، سطح آنزیمهای آنتی اکسیدانی سلولی را افزایش می دهد (20). از خواص درمانی ذکر شده برای این گیاه می توان کمک به بهبودی زخمهای عفونی ناشی از باکتریهای گرم مثبت را نام برد (14). با توجه به خواص متفاوت عملکردی گیاهان نام برده، اهمیت ویژه آنها در فرآیند ترمیم زخم مشخص می شود.

به منظور ارزیابی پتانسیل گیاهان مذکور در ترمیم زخمهای غیر عفونی پوستی، عصاره آنها در التیام زخمهای غیر عفونی در رت مورد بررسی قرار گرفت و روند ماکروسکوپی و هیستوپاتولوژی ترمیم زخم ارزیابی شد. در ﻃﺐ ﺳﻨﺘﻲ از این گیاهان ﺑـﺮای درﻣـﺎن اﻟﺘﻬـﺎب ﻳﺎ عفونت زخم اﺳﺘﻔﺎده شده است، اما تا کنون تحقیقی بر روی اثر آنها در روﻧﺪ ﺗﺮﻣﻴﻢ زﺧﻢ ﭘﻮﺳﺘﻲ غیر عفونی ﮔﺰارش ﻧﺸﺪه اﺳـﺖ. از آنجا ﻛﻪ اﻳﻦ ﮔﻴﺎهان ﺧﻮاص درمانی شناخته شده متعددی از ﺟﻤﻠﻪ خصوصیات ﺿﺪ ﻣﻴﻜﺮوﺑﻲ و ﺿﺪ اﻟﺘﻬﺎﺑﻲ دارند، پیش بینی می شود روند بهبود زخم را تسریع نمایند. امروزه برای ترمیم زخمهای عمیق پوستی از تتراسیکلین استفاده می شود که ممکن است دارای اثرات جانبی باشد (3). لذا در این پژوهش تأثیر عصاره گیاهان در مقایسه با داروی سنتزی تتراسیکلین برروند التیام زخمهای غیر عفونی در رت مورد مطالعه قرارگرفت.

مواد و روشها

در این تحقیق از 48 رت نر همسان، نژاد ویستار، با وزن50 ± 250 گرم استفاده شد. رتها در 8 گروه 6 تایی به صورت کاملاً تصادفی تقیسم و تأثیر عصاره های گیاهان مرزه کوهی، بادرنجبویه، سدر، گل ختمی، حنا در کنار پماد تجاری (تتراسیکلین) بر روند ترمیم زخم غیرعفونی بررسی شد. یک گروه به عنوان گروه کنترل که تنها زخم بر روی آن ایجاد شد و دارویی دریافت نکردند، یک گروه با زخم و تیمار هر عصاره وگروه دیگر با عصاره مخلوط پنج گیاه مورد تیمار قرارگرفتند. رتها در قفسهای انفرادی، دمای
2± 22 درجه سانتی گراد، سیکل روشنایی، تاریکی 12 ساعته، دسترسی آزادانه به آب و غذا در بخش حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه اصفهان نگهداری شدند. گیاهان مورد نظر در مرکز هرباریوم دانشگاه اصفهان تعیین جنس و گونه شدند. مرزه کوهی (Satureja bachtiarica) و بادرنجبویه (Melissa officinalis) از اعضای از خانواده Lamiaceae و حنا (Lawsonia inermis) عضو خانواده Lythraceae است. گیاه سدر (Ziziphus spina  christi ) از خانواده Rhamnaceae و گیاه گل ختمی (Althaea officinalis) از خانواده Malvaceae است.

ابتدا گیاهان با آب مقطر به دقت شتسشو داده شدند تا مواد زائد آنها جدا شود، سپس در زیر سایه و دمای 25-20 درجه سانتی گراد تحت شرایط کاملاً یکسان خشک شدند. جهت عصاره گیری 150 گرم برگ خشک  (برای ختمی از گل خشک استفاده شد) آسیاب شده گیاهان، در 600 میلی لیتر الکل 96 درجه به مدت 24 ساعت با دور 150 بر روی شیکر قرار داده شدند. به باقیمانده نمونه ها پس ازگذراندن از کاغذ فیلتر، 600 میلی لیتر الکل 70 درجه اضافه شد و به مدت 24 ساعت مجدداً بر روی شیکر با دور 150  قرار گرفت. سپس محلول مرحله1 و2 مخلوط شده و توسط دستگاه تقطیر در خلأ تا یک سوم حجم اولیه تغلیظ شدند. سپس به مدت 24 ساعت در داخل آون گذاشته شد. عصاره غلیظ به دست آمده، مجدداً در داخل آون 50 درجه قرار گرفت. عصاره خشک در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شد (5).

به منظور تهیه پماد، 3 گرم از عصاره های به دست آمده در 10 سی سی الکل 70 درجه حل شد، سپس با 100 گرم (اُسرین) مخلوط گردید تا محصول یکنواخت به دست آید. جهت تهیه پماد  مخلوط پنج گیاه، 3 گرم از هر گیاه را ترکیب کرده و از این مخلوط 3 گرم برداشته و در 10سی سی الکل 70 درجه حل شد.

آماده سازی رتها برای جراحی با تزریق زایلازین با دز mg/kg 5 در عضله ران صورت گرفت. برای القای بیهوشی، تزریق کتامین (با دز mg/kg 40(  طبق ماده پیش بیهوشی انجام شد. پس از بیهوشی، پشت آنها ناحیه بین دو استخوان کتف تراشیده و با الکل 70 درجه  سطح آن با ابعاد cm1×1 ضد عفونی شد. توسط تیغ جراحی، زخمی شامل برداشت تمام لایه های پوستی، ایجاد شد. عمق زخم شامل درم و هیپودرم بود (13). سپس به مدت 14 روز متوالی بستر زخم تحت تیمار پماد حاصل از گیاه و نیز تتراسیکلین قرار داه شد. در روزهای هفتم و چهاردهم پس از تیمار، حیوان از طریق تزریق کلروفرم به طور  کامل بیهوش شد و از زخم هر گروه جهت مطالعات هیستوپاتولوژی نمونه برداری شد. بررسیهای ماکروسکوپی از طریق مشاهده ظاهر زخم و روند التیام روزانه انجام شدند. مقاطع بافتی با قرار دادن در فرمالین 10 درصد به آزمایشگاه ارسال شدند و پس از تهیه برش با قطر 5 میکرون توسط دستگاه میکروتوم و رنگ آمیزی به روش هماتوکسیلین ـ ائوزین با میکروسکوپ  نوریNikon  مورد بررسی قرار گرفتند.

آنالیز دادها: ابعاد  لایه درم و اپیدرم با استفاده از عدسی مدرج تحت عنوان میکرومتر (دارای واحد میکرون) با بزرگنمایی 100 به دست آمد و با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 17 تمامی نتایج به صورت میانگین و انحراف معیار بیان شدند. پس از مشخص نمودن توزیع داده ها، برای مقایسه نتایج هر متغیر در هر یک از گروهها قبل و بعد از بررسی با اندازه گیری مکرر، از ANOVA یک طرفه و Duncan استفاده شد. سطح معنا داری کمتر از 05/0 برای تمامی آنالیزها در نظر گرفته شد.

نتایج 

بررسیهای ماکروسکوپی از طریق مشاهده ظاهر زخم و روند التیام روزانه انجام شدند. در روز هفتم و چهاردهم بهبود زخم، عدم التهاب و عفونت، و التیام اپیدرم و درم در گروههای تیمار شده با عصاره گیاهان قابل توجه بود. نتایج با آنچه از مطالعه با تتراسیکلین به دست آمد قابل قیاس و چشمگیر است. 

ترمیم اپیدرم: مشاهده گردید پس از 7 روز تیمار، تمامی گیاهان به صورت معناداری  (p<0.05) در مقایسه با شاهد باعث بهبود و ترمیم  لایه اپیدرم شده اند. روند التیام گروه شاهد در مقایسه با تتراسیکلین مناسب تر بود (p<0.05). گروه تیمار شده توسط گل ختمی در بین تمامی گروهها ( 7 روزپس از تیمار) نتایج بهتری نشان داد (p<0.05). پس از 14 روز تیمار نیز لایه اپیدرم در اکثر نمونه ها بهبود یافته است (نمودار 1).

نمودار 1- مقایسه میزان درصد بهبود زخم در لایه اپیدرم روز هفتم

* واحد بر اساس طول اپیدرم بر مبنای میدان میکروسکوپی با   بزرگنمایی 100 ، داده ها در (p<0.05) معنی دار می باشند.

ترمیم درم: لایه درم پس از 7 روز تیمار  توسط عصاره ها و در مقایسه با شاهد، به طور معناداری (p<0.05) التیام یافته است. روند بهبودی در گروه شاهد در مقایسه با تتراسیکلین حتی چشمگیر تر است. گروه تیمار شده با مخلوط 5 گیاه و گل ختمی در میان تمام گروهها در روز هفتم التیام قابل ملاحظه ای یافته اند(p<0.05) (نمودار 2). پس از 14 روز تیمار، لایه درم تیمار شده با عصاره ختمی نسبت به سایر گروهها بهبودی مناسب تری نشان می دهند (p<0.05) (نمودار 3).

نمودار2- مقایسه میزان درصد بهبود زخم در لایه درم (پس از 7 روز تیمار)

* واحد سطح  بر اساس طول و عرض سطح مقطع بافت ترمیمی درم بر مبنای میدان میکروسکوپی با   بزرگنمایی 100

داده ها در (p<0.05) معنی دار می باشند.

نمودار3- مقایسه میزان درصد بهبود زخم در لایه درم روز چهاردهم

* واحد سطح  بر اساس طول و عرض سطح مقطع بافت ترمیمی درم بر مبنای میدان میکروسکوپی با   بزرگنمایی 100

داده ها در (p<0.05) معنی دار می باشند.

در نمونه های تیمارشده با گیاه گل ختمی لایه اپیدرم در روز های هفتم وچهاردهم همچنین لایه درم در روز چهاردهم، در مقایسه با گروه تیمارشده با مخلوط پنج گیاه، وضعیت مناسب تری نشان می دهند (p<0.05). پس از هفت روز تیمار با پماد 3 درصد مخلوط پنج گیاه، لایه درم در مقایسه با گروه تیمار  شده توسط گل ختمی، دارای وضعیت بهتری است (p<0.05).

گروه شاهد: بررسی میکروسکوپی نشان می دهد پس از گذشت 7 روز لایه اپیدرم در گروه شاهد ترمیم نیافته در حالی که در روز چهادهم این لایه تا حدودی التیام یافته، لیکن هنوز ترمیم کامل نشده است. در بررسیهای هیستوپاتولوژی، فولیکول  نارس مو قابل رؤیت ولی ساقة مو تشکیل نشده است (شکل1).

شکل1- تصویرمیکروسکوپی زخم غیرعفونی گروه شاهد پس از 14 روزتیمار با مخلوط 5 گیاه. رنگ آمیزی H&E و بزرگنمایی 40.

تأثیرختمی: پس از گذشت 7 روز تیمار با وجود اینکه نمونه تیمار شده با گیاه گل ختمی دارای زخم است، اما ترمیم تقریباً صورت گرفته و داخل درم، بافت همبندی ترمیمی گرانولاسیون هنوز باقی است. لایه اپیدرم پس از 14روز کامل شده است. در داخل درم نسج گرانولاسیون بافت همبندی ترمیمی از بین رفته است. اجزای طبیعی درم شامل مو و غدد سباسه جایگزین شده اند به طوری که با حالت طبیعی تفاوتی ندارد (شکل2).

شکل 2- تصویرمیکروسکوپی زخم غیرعفونی پس از 14 روز تیمار با گل ختمی . رنگ آمیزی H&E و بزرگنمایی 40.

تأثیر مخلوط پنج گیاه: گروه تیمار شده با پماد حاصل از عصاره مخلوط پنج گیاه پس از 7 روز نشان داد که اپیدرم تقریباً کامل شده است و درم تا حدودی ضایعه دارد. پس از گذشت 14 روز، بررسیها کامل شدن اپیدرم را نشان می دهند (شکل3). تأثیر عصاره گل ختمی و مخلوط پنج گیاه در بهبود زخم ، ترمیم و تشکیل اپیدرم بسیار چشمگیر است (p<0.05)، با این تفاوت که تمام اجزای درم گروه تیمار شده با گیاه گل ختمی پس از هفت روز ترمیم شده، اما در گروه تیمار شده با مخلوط پنج گیاه هنوز در چند نقطه اجزاء کامل نشده بودند.

شکل 3- تصویر میکروسکوپی زخم غیرعفونی گروه تیمار شده با مخلوط پنج گیاه پس از 14 روز . رنگ آمیزی H&E و بزرگنمایی 40.

تأثیر مرزه: در گروه تیمار شده با گیاه مرزه، پس از 7 روز اپیدرم آنها تا حدودی ترمیم شده است (p<0.05) و سلولهای التهابی قابل رؤیت می باشند. جالب اینکه 14 روز پس از تیمار با عصاره این گیاه اپیدرم کامل شده است.

تأثیر بادرنجبویه و سدر: در گروه تیمار شده با پماد 3 درصد بادرنجبویه پس از 7 روز اپیدرم ناقص بود و سلولهای التهابی مشاهده نشد. در تیمار با گیاه سدر تا حدودی اپیدرم ترمیم شده است، عمل ترمیم قابل تشخیص و سلولهای التهابی نیز مشاهده می شوند و حتی 14روز پس از تیمار با وجوداینکه التیام  زخم کامل نشده، اپیدرم تشکیل شده است.

تأثیر حنا: نتایج پس از 7 روز در گروه تیمار شده با گیاه حنا نشان داد که نمونه دارای زخم و اپیدرم دارای فاصله است. سلولهای التهابی هنوز قابل رؤیت هستند در حالی که پس از 14 روز تیمار، اپیدرم کامل شده، بافت همبندی قابل رؤیت و ضمائم درم در دو طرف، نیمی از زخم را ترمیم نموده اند (شکل4).

شکل4- تصویرمیکروسکوپی التیام زخم غیرعفونی گروه تیمار شده با عصاره حنا پس از 14 روز. رنگ آمیزی H&E و بزرگنمایی 40.

تأثیر تتراسیکلین: گروه رتهای تیمار شده با آنتی بیوتیک سنتزی در مقایسه با گروه شاهد سرعت ترمیم کندتری داشته است (p>0.05). پس از گذشت 7 روز تیمار با پماد 3 درصد تتراسیکلین، نمونه تهیه شده دارای فاصله قابل ملاحظه می باشد و اپیدرم ترمیم نشده است. پس از گذشت 14 روز اپیدرم تا حدودی کامل شده است. بافت همبندی وجود دارد و ضمائم در حال تشکیل هستند (شکل5).

شکل 5- تصویرمیکروسکوپی روند التیام زخم پس از 14 روز تحت تأثیر تتراسیکلین. با رنگ آمیزی H&E و بزرگنمایی 40.