نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی
2 کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، دانشکده علوم و فناوریهای نوین، گروه بیوتکنولوژی
3 مشهد، دانشگاه فردوسی، دانشکده علوم، گروه فیزیولوژی گیاهی
چکیده
رزمارینیک اسید یک ترکیب با ارزش دارویی است و در گیاهان از طریق مسیر بیوسنتز فنیل پروپانوئیدی تولید میشود. در این تحقیق، محتوی رزمارینیک اسید، فلاونوئید کل و همچنین بیان ژن آنزیم تیروزین آمینوترانسفراز (TAT) در گیاهچههای 30 روزه بادرنجبویه تیمار شده به مدت 8 ساعت باغلظتهای مختلف نانوذره اکسید مس (0، 50، 200، 500، 1000 و 2000میلیگرم بر لیتر) مورد آنالیزقرار گرفتند. محتوی رزمارینیک اسید گیاهچههای تیمار شده در تمامی غلظتها بصورت معنیداری نسبت به نمونه شاهد افزایش یافت. بیشترین محتوی این ماده موثره در تیمار گیاهچهها با پایینترین غلظت نانوذره مشاهده شد و با افزایش غلظت نانوذره در محیط محتوی آن کاهش یافت. جالب توجه اینکه، بیان ژن آنزیم TAT نیزالگویی مشابه با محتوی رزمارینیک اسید نشان داد. محتوی فلاونوئید کل گیاهچههای تیمار شده نیز بصورت گرادیان تا غلظت 1000 میلیگرم بر لیتر افزایش یافت و در بالاترین غلظت بصورت معنیداری نسبت به غلظت 1000 میلیگرم بر لیتر کاهش یافت. بر اساس نتایج بدست آمده، چنین بنظر میرسد که این نانوذره با تاثیر بر بیان ژنهای درگیر در بیوسنتز ترکیبات فنلی محتوی فلاونوئید و رزمارینیک اسید را تحت تاثیر قرارداده است.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Rosmarinic acid accumulation and expression of tyrosine aminotransferase gene in Melissa officinalis seedlings in response to CuO nanoparticles
چکیده [English]
Rosmarinic acid (RA) is a valuable medicinal compound which can be produce through the phenilpropanoid biosynthesis pathway. In this research, RA accumulations, flavonoid content and TAT gene expression were analyzed in 30 days old Lemon balm seedlings which treated with different concentrations of CuO nanoparticles for 8 hours. RA contents were significantly evaluated in treated seedlings with all nano particles concentrations in compared to the control. The most content of this matter was seen in the treated seedlings with the lowest nanoparticles and decreased by increasing nano particles in media. Interestingly, the TAT gene expression showed the similar pattern as seen for RA content. The total flavonoid content gradually increased up 1000 mg/L concentration and significantly decreased at the highest concentration rater to 1000 mg/L. Based on the results, it seems the nanoparticle affected flavonoid and RA contents through effect on the genes expression which involve in phenolic compound biosynthesis pathway.
کلیدواژهها [English]
تجمع رزمارینیک اسید و بیان ژن آنزیم تیروزین آمینوترانسفراز در گیاهچههای بادرنجبویه (Melissa officinalis) تیمار شده با نانو ذره اکسید مس
علی ریاحی مدوار1*، معین الدین نصیری بزنجانی1، فاطمه رضائی2 و امین باقیزاده1
1 کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی.
2 مشهد، دانشگاه فردوسی، دانشکده علوم، گروه فیزیولوژی گیاهی
تاریخ دریافت: 8/7/95 تاریخ پذیرش: 21/9/95
چکیده
رزمارینیک اسید یک ترکیب با ارزش دارویی است و در گیاهان از طریق مسیر بیوسنتز فنیل پروپانوئیدی تولید میشود. در این تحقیق، محتوی رزمارینیک اسید، فلاونوئید کل و همچنین بیان ژن آنزیم تیروزین آمینوترانسفراز (TAT) در گیاهچههای 30 روزه بادرنجبویه تیمار شده به مدت 8 ساعت با غلظتهای مختلف نانوذره اکسید مس (0، 50، 200، 500، 1000 و 2000 میلیگرم بر لیتر) مورد آنالیز قرار گرفت. محتوی رزمارینیک اسید گیاهچههای تیمار شده در تمامی غلظتها به صورت معنیداری نسبت به نمونه شاهد افزایش یافت. بیشترین محتوی این ماده مؤثره در تیمار گیاهچهها با پایینترین غلظت نانوذره مشاهده شد و با افزایش غلظت نانوذره در محیط محتوی آن کاهش یافت. جالب توجه اینکه، بیان ژن آنزیم TAT نیز الگویی مشابه با محتوی رزمارینیک اسید نشان داد. محتوی فلاونوئید کل گیاهچههای تیمار شده نیز به صورت گرادیان تا غلظت 1000 میلیگرم بر لیتر افزایش یافت و در بالاترین غلظت به صورت معنیداری نسبت به غلظت 1000 میلیگرم بر لیتر کاهش یافت. بر اساس نتایج به دست آمده، چنین به نظر میرسد که این نانوذره با تأثیر بر بیان ژنهای درگیر در بیوسنتز ترکیبات فنلی محتوی فلاونوئید و رزمارینیک اسید را تحت تأثیر قرارداده است.
واژه های کلیدی: بادرنجبویه، رزمارینیک اسید، نانو ذرات اکسید مس، فلاونوئید.
* نویسنده مسئول، تلفن: 03433776611، پست الکترونیکی: riahi.ali@gmail.com
مقدمه
گیاه بادرنجبویه (Melissa officinalis) از رده دو لپهایها، راسته لب گلیها، خانواده نعنائیان (Lamiaceae) و جنس بادرنجبویهها است و دارای دو گونه M. officinalis و
M. romana میباشد. این گیاه دارویی پراکنش وسیعی از غرب اروپا (4) تا نواحی غربی و مرکزی ایران را دارد (2).
امروزه از اسانس این گیاه به وفور در زمینه های مختلفی از قبیل پزشکی، غذایی، عطرسازی و آرایشی استفاده میشود (1). این گیاه دارای خواص ضد توموری (30)، ضد باکتریایی و ضد ویروسی (8، 10 و 28) است. بادرنجبویه به دلیل داشتن ترکیبات فنلی نظیر رزمارینیک اسید و کافئیک اسید، 10 برابر ویتامین A و E خواص آنتیاکسیدانی دارد (17). بیشتر خواص درمانی این گیاه را به ماده مؤثره آن یعنی رزمارینیک اسید نسبت میدهند (29).
رزمارینیک اسید، یک استر از کافئیک اسید و 3، 4-دیهیدروفنیل لاکتیک اسید است که در گیاهان از طریق مسیر بیوسنتزی فنیل پروپانوئیدی تولید میشود (30). اسید آمینه های تیروزین و فنیل آلانین، سوبستراهای این مسیر بیوسنتزی بوده و آنزیمهای تیروزین آمینوترانسفراز (TAT) و فنیل آلانین آمینو لیاز (PAL) آنزیمهای اصلی کاتالیز کننده این مسیر میباشند (شکل 1) (30). نتایج منتشر شده توسط یان و همکاران (2006) نشان داد که تجمع رزمارینیک اسید در گیاه مریم گلی (Salvia miltiorrhiza) تحت تیمار با عصاره مخمر افزایش یافت. آنها گزارش کردند که تحت این تیمار فعالیت آنزیم تیروزین آمینوترانسفراز افزایش یافته، درحالی که فعالیت آنزیم PAL تغییر نکرده بود. آنها افزایش در فعالیت آنزیم TAT را دلیل افزایش بیوسنتز رزمارینیک اسید دانستند و آن را آنزیم کلیدی در مسیر بیوسنتز رزمارینیک اسید معرفی نمودند (37).
به دلیل اهمیت دارویی و کاربردهای صنعتی رزمارینیک اسید، تاکنون تولید آن در گونههای گیاهی مختلفی از قبیل Melissa officinalis، Orthosiphon aristatus، Salvia miltiorrhiza و Coleus blumei تحت تأثیر الیسیتورهای زیستی و غیر زیستی مورد بررسی قرار گرفته است (14، 21، 22، 26 و 37).
شکل 1- شمای کلی مسیرهای بیوسنتزی رزمارینیک اسید از سوبستراهای تیروزین و فنیل آلانین (30).
اهمیت فلاونوئیدها در مقاومت به تنشهای گوناگونی از قبیل گرما، سرما، خشکی، اشعه ماوراء بنفش و فلزات سنگین به اثبات رسیده است (34). این متابولیتها خاصیت آنتیاکسیدانی دارند و ثابت شده است که میزان تولید آنها و همچنین بیان ژن مرتبط با سنتز آنها در شرایط اعمال تنش افزایش مییابد (18 و 35).
علم نانوتکنولوژی به بررسی ساختار و عملکرد مواد و ترکیباتی میپردازد که حداقل یکی از ابعاد عملکردی آنها بین 1 تا 100 نانومتر باشد (12). با کاهش ابعاد ذرات، ویژگیهای فیزیکی، شیمیایی و الکتریکی آنها در مقایسه با حالت حجیم تغییر میکند (27). این مواد در صنایع مختلف از قبیل صنایع غذایی، میکروالکترونیک، نساجی، ساختمان سازی، پزشکی و کشاورزی کاربردهای بسیار زیادی دارند (13، 16، 23 و 36). گزارشات متعددی تأثیر منفی و مثبت این ذرات بر گیاهان را گزارش نمودهاند (11، 15، 20، 21، 32 و 38). اخیراً مطالعات انجام شده توسط Aminizadeh و همکاران (2016) نشان داد که محتوی سولفارافان در گیاهچههای Lepidium draba تحت تیمار با نانوذرات اکسید مس و آهن تحت تأثیر قرار گرفته است (9). علاوه بر آن تأثیر مثبت نانوذره نقره بر تولید مواد مؤثره در گیاه Artemisia annua و Calendula officinalis ثابت شده است (15 و 39). همچنین افزایش محتوی ترکیبات فنلی و رزمارینیک اسید در گیاه اسطوخودوس (Lavandua angostifloria) تحت تیمار با نانوذرات نقره گزارش شده است (6).
در این تحقیق، میزان تجمع رزمارینیک اسید، فلاونوئید کل و همچنین بیان ژن TAT در گیاهچههای 30 روزه بادرنجبویه که به مدت 8 ساعت با غلظتهای مختلف نانو ذرات اکسید مس تیمار شده بود موردآنالیز قرار گرفت.
مواد و روشها
کشت گیاه: در این تحقیق، از بذرهای نسل اول گیاه بادرنجبویه (تهیه شده از شرکت پاکان بذر اصفهان) برای کشت استفاده شد. جهت ضد عفونی بذرها از هیپوکلریت سدیم 2 درصد به مدت 10 دقیقه و اتانول 70 درصد به مدت 2 دقیقه با سه مرحله آبکشی با آّب مقطر استریل بین مراحل استفاده شد. تعداد 30 عدد بذر ضدعفونی شده درون پتری دیش (با قطر 9 سانتیمتر) بر روی محیط کشت موراشینگ-اسکوگ (MS) (Murashige and Skoog 1962) (24) حاوی آگار 8/0 درصد کشت داده شدند. پتری دیشهای در انکوباتور در دمای 2± 28 درجه سانتی گراد، رطوبت نسبی 5 ± 55 درصد و تاریکی مطلق قرار گرفتند. بعد از جوانه زنی بذرها (روز پانزدهم)، پلیتها به مدت پانزده روز به داخل گلخانه با دمای 2±25، رطوبت نسبی 5 ± 55 درصد و سیکل نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی منتقل شدند. گیاهچهها برای بررسی اثر نانوذرات بر محتوی رزمارینیک اسید، فلاونوئید کل و بیان ژن TAT تیمار شدند.
تیمار کردن گیاهچهها: غلظتهای مختلف (صفر (به عنوان شاهد)، 50، 200، 500، 1000 و 2000 میلیگرم بر لیتر) نانواکسید مس (میانگین اندازه60 نانومتر، درصد خلوص 98 درصد تهیه شده از شرکت NaBond Technology) به طور جداگانه توزین و به 100 میلیلیتر محلول هوگلند در ارلن شیشهای (250 میلیلیتری) اضافه شدند. گیاهان پس از جمعآوری از روی محیط پس از چندین بار آبکشی، به مدت 8 ساعت در ارلنها در معرض نانوذره قرار گرفتند. برای ایجاد محیطی یکنواخت از لحاظ تیمار و هوادهی لازم، ارلنها در دمای آزمایشگاه بر روی شیکر با دور rpm 120 قرار گرفتند (26).
بعد از گذشت زمان مورد نظر، گیاهچهها از محیط جمعآوری و بعد از چندین بار شستشو با آب مقطر استریل به دو قسمت تقسیم شدند. نیمی از گیاهچهها (بافت کامل گیاهچه) به منظور بررسی محتوی رزمارینیک اسید در سایه و در هوای آزاد خشک شدند و نیمی دیگر به منظور سنجش محتوی فلاونوئید کل و بررسی بیان ژن TAT بلافاصله در ازت مایع منجمد و به فریزر 80- منتقل گردیدند (26).
سنجش مقدار رزمارینیک اسید: مقدار رزمارینیک اسید با استفاده از روش نصیری بزنجانی و همکارن (2014) اندازهگیری شد (26). به این منظور، مقدار 100 میلیگرم از بافت خشک گیاهچههای تیمار شده و شاهد آسیاب و 10 میلیلیتر اتانول 30 درصد به آن اضافه گردید. این مخلوط توسط دستگاه سونیکاتور (با استفاده از امواج فرا صوت) به مدت 15 دقیقه سونیکیت شد تا گیاه به اندازه کافی متلاشی و عصاره آن خارج گردد، سپس محلول حاصل به مدت 20 دقیقه با دور rpm 4000 در دمای اتاق سانتریفیوژ گردید. محلول رویی با آب مقطر به حجم 20 میلیلیتر رسانده و به وسیله فیلتر سرنگی 2/0 میکرومتری صاف گردید. جهت تفکیک نمونهها از کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا (HPLC) (Agilent 1100, USA) استفاده شد. فاز جامد شامل ستون ZORBAX SB-C18(5 µm) و فاز مایع، شامل یک سیستم حلال دو فازی؛ حلالA (شامل آب و ارتوفسفریک 1 درصد) و حلال B (متانول و ارتوفسفریک 1 درصد) به نسبت 4/0 و 6/0 بود.
از جذب 330 نانومتر جهت شناسایی رزمارینیک اسید و همچنین از استاندارد رزمارینیک اسید (تهیه شده از شرکت سیگما) برای تعیین زمان نگهداری نمونه در ستون و مقدار رزمارینیک اسید تولید شده استفاده گردید. مقدار رزمارینیک اسید بر حسب میلیگرم بر گرم وزن خشک گزارش گردید.
اندازهگیری محتوی فلاونوئید: محتوی فلاونوئید کل گیاهچههای بر اساس روش کریزک و همکاران اندازهگیری شد (19). به این منظور، مقدار 2/0 گرم از بافتتر (فریز شده) در 10 میلی لیتر اتانول اسیدی ( شامل الکل اتیلیک 95 درصد و اسید استیک گلایسال به نسبت 99:1) ساییده شد و سپس به مدت 20 دقیقه با دورrpm 10000 در دمای 25 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ گردید. محلول رویی به مدت 10 دقیقه در بن ماری با دمای 80 درجه سانتی گراد قرار گرفت. جذب نمونهها در طول موجهای 270، 300 و 330 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Varian, cary 50Australia) اندازهگیری شد. با استفاده از فرمول CLƐA= (A، میزان جذب؛ Ɛ، ضریب خاموشی؛ C، غلظت و L، طول مسیر نور) و ضریب خاموشی cm-1mM-13300، محتوی فلاونوئید کل محاسبه و محتوی آن بر حسب µM/g FW گزارش گردید.
آنالیز مولکولی: استخراج RNA کل، سنتز cDNA و تکثیر ژن:
به منظور بررسی بیان ژن آنزیمTAT، استخراج RNA کل از گیاهچههای فریز شده با استفاده از کیت RNX-Plus (شرکت سینا ژن، شماره کاتالوگ: RN7713C) و مطابق روش انجام شده توسط یوسفی و همکاران انجام شد (7). برای این منظور، mg500 از بافت فریز شده، در حضور نیتروژن مایع ساییده و به میکروتیوب استریل منتقل شد. سپسµL500 از محلول RNX-Plus به آن افزوده و مخلوط کاملاً همگن گردید. مخلوط مذکور به مدت یک ساعت بر روی یخ انکوبه شد، سپس Lµ200 کلروفرم به آن اضافه و به شدت تکان دادهشد. پس از 5 دقیقه انکوباسیون بر روی یخ، به مدت 15 دقیقه با دور rpm 12000 در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ گردید. سپس محلول روشناور بیرنگ به میکروتیوب جدید منتقل و هم حجم آن ایزوپروپانول اضافه گردید و به آرامی تکان داده شد. پس ازگذشت 15 دقیقه انکوباسیون روی یخ، مطابق برنامه قبل سانتریفیوژ انجام شد. در ادامه، فاز رویی حذف گردید و به رسوب سفید رنگ مقدار یک میلیلیتراتانول 75 درصد افزوده و اینبار به مدت 8 دقیقه با دور rpm 7500 در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ انجام شد. فاز رویی دور ریخته شد و رسوب در دمای اتاق انکوبه گردید تا خشک شود. در نهایت به رسوب،L µ30 آب تیمار شده با DEPC 1/0 درصد اضافه گردید و تا زمان استفاده به فریزر 80- درجه سانتی گراد انتقال یافت. لازم به ذکر است که کلیه مراحل کار در شرایط RNase free و برروی یخ انجام گرفت. در نهایت کیفیت RNA تخلص شده بر روی ژل آگارز یک درصد بررسی شد. در ادامه، از RNA استخراج شده کتابخانه cDNA ساخته شد.
به منظور ساخت cDNA، 2 میکروگرم از RNAکل به تیوبهای 2/0 اضافه شد (کلیه مراحل ساخت cDNA روی یخ انجام شد). در ادامه، پس از اضافه نمودن 2 میکرولیتر پرایمر الیگو dT به تیوپها به مدت 10 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد انکوبه گردید. سپس یک میکرولیتر آنزیم (200U) DNA پلیمراز وابسته به RNA (RNA Dependent DNA Polymerase, RT) (MMuLV از شرکت فرمنتاز)، مقدار 5/2 میکرولیتر بافر رونوشت RT (10X)، 75/0 میکرولیتر dNTP، 75/0 میکرولیتر RNase inhibitor، و در نهایت آب دیونیزه استریل (RNase free) تا حجم نهایی 25 میکرولیتر به تیوپها اضافه شد. واکنش ساخت cDNA به مدت 80 دقیقه در دمای 42 درجه سانتی گراد انجام شد. در انتهای واکنش به منظور حذف آنزیمRT، تیوبها به مدت 10 دقیقه در دمای 70 درجه سانتی گراد قرار گرفت. همچنین به منظور حذف آلودگیهای اضافی RNA از آنزیم RNase A (1 میکرولیتر، 20 دقیقه در دمای 38 درجه سانتی گراد) استفاده شد. تکثیر TAT و GPDH (به عنوان کنترل داخلی) با استفاده از کتابخانه cDNAو آنزیم DNA Taq پلیمراز در حضور پرایمرهای اختصاصی که توالی آنها در جدول 1 آمده است انجام شد. واکنش تکثیر این ژنها در جدول 2 نشان داده شده است.
به منظور بررسی میزان بیان ژن TAT تحت شرایط تیمار، از روش نیمه کمی RT-PCR استفاده شد. به این منظور، مقدار مساوی (4 میکرولیتر) از محصول PCR هر کدام از ژنها (TAT و GPDH) بر روی ژل آگارز 1 درصد بارگذاری شد و پس از تفکیک و رنگ آمیزی ژلها با اتیدیوم بروماید، از ژلها وسیله دستگاه ژل داک عکسبرداری شد. میزان بیان با استفاده از نرم افزار Gene tools و از روی شدت باند تکثیر شده ژن TAT پس از نرمالیز کردن با ژن GPDH ارزیابی شد (6 و 25). نتایج به صورت درصد بیان ژن در نمونه شاهد گزارش گردید.
جدول 1- پرایمرهای مربوط به تکثیر ژن آنزیم تیروزین آمینو ترانسفراز و کنترل داخلی (GPDH).
GC % |
Tm |
توالی |
نام پرایمر |
50 |
4/54 |
5¢-GGAGAACGGGAAAAGAGTGA-3¢ |
F TAT |
50 |
3/54 |
5¢-AAATACTCCGCGATAGCCTC-3¢ |
R TAT |
50 |
5/55 |
5¢-GAGTTGATCTGAACGGTTCCTG-3¢ |
F GPDH |
5/54 |
55 |
5¢-GTTAGACCGGACATGAGGATCG-3¢ |
R GPDH |
٭توالی مربوط به پرایمر پیشرو (F) و معکوس (R) ژن تیروزین آمینو ترانسفراز (TAT) بر اساس توالی این ژن در گیاه بادرنجبویه با شماره دستیابی JN863949 و برای ژن GPDH بر اساس توالی این ژن در گیاه Arabidopsis thaliana با شماره دستیابی NM_127989.4 ثبت شده درGene Bank طراحی شدند و توسط شرکتMWG ساخته شدند.
جدول 2- شرایط تکثیر برای ژنهای TAT و GPDH
مرحله |
دما (ºC) |
زمان (دقیقه) |
سیکل |
واسرشته سازی اولیه |
94 |
4 |
1 |
واسرشته سازی |
95 |
1 |
30 |
اتصال پرایمرها |
51 |
1 |
|
بسط |
72 |
1 |
|
بسط نهایی |
72 |
10 |
1 |
آنالیز آماری: کشت گیاه با سه تکرار مستقل و در قالب یک طرح کاملاً تصادفی انجام شد. میانگین دادهها حاصل از سه تکرار مستقل با استفاده از نرم افزار SAS توسط آزمون دانکن (Duncan test) و با در نظر گرفتن سطح اطمینان 05/0 P ≤، مورد تجزیه واریانس یک عاملی (One way ANOVA) قرار گرفتند. معنیدار بودن نتایج با حروف بر روی هر ستون مشخص گردید. حروف متفاوت بیانگر معنیداری در سطح 5 درصد میباشد، حروف مشابه و مشترک بیانگر عدم معنیدار بودن نتایج در سطح 5 درصد میباشد.
نتایج
محتوی رزمارینیک اسید: زمان نگهداری رزمارینیک اسید در ستون و همچنین تعیین غلظت آن با استفاده از تزریق غلظتهای مشخصی از نمونه استاندارد به ستون به دست آمد (نتایج نشان داده نشد).
همان طور که در شکل 2 مشاهده میشود، تولید رزمارینیک اسید در گیاهچههای تیمار شده با تمامی غلظتهای نانو ذره به طور معنیداری نسبت به نمونه شاهد افزایش یافت. بیشترین مقداررزمارینیک اسید در پایینترین غلظت نانوذره (50 میلیگرم بر لیتر) تولید شد ولی با افزایش غلظت نانوذره در محیط، محتوی آن به طور معنیداری نسبت به غلظت 50 میلیگرم بر لیتر کاهش یافت.
شکل 2- تأثیر غلظتهای مختلف نانو ذرات اکسید مس بر تجمع رزمارینیک اسید در گیاهچههای بادرنجبویه پس از 8 ساعت تیمار. آزمایش با 3 تکرار مستقل انجام شد. حروف متفاوت بالای نمودارها نشان دهنده معنیدار بودن نتایج در سطح 5 درصد است.
محتوی فلاونوئید کل: در گیاهچههای بادرنجبویه تیمار شده با نانو ذرات اکسید مس، محتوی فلاونوئید کل در مقایسه با نمونه شاهد افزایش معنیداری را نشان داد (شکل 3). همان طور که در شکل قابل مشاهده میباشد، افزایش محتوی فلاونوئیدها تا غلظت 1000 میلیگرم بر لیتر به طور گرادیان و هماهنگ با افزایش غلظت نانوذره در محیط افزایش یافت. اما محتوی آن در تیمار با غلظت 2000 میلیگرم بر لیتر نسبت به غلظت 1000 میلیگرم بر لیتر به طور معنیداری کاهش نشان داد.
شکل 3- اثر غلظتهای مختلف نانو ذرات اکسید مس بر محتوی فلاونوئید کل در گیاهچههای بادرنجبویه پس از 8 ساعت تیمار. آزمایش با 3 تکرار مستقل انجام شد. حروف متفاوت بالای نمودارها نشان دهنده معنیدار بودن نتایج در سطح 5 درصد است.
آنالیز نیمه کمی بیان ژن TAT: کیفیت RNA استخراج شده با تفکیک باندهای rRNA بر روی ژل آگارز یک درصد بررسی شد. دو باند مربوط به S rRNA28 و S18 مشخص کننده کیفیت مناسب RNAتخلیص شده و دست نخورده بودن آن میباشد (نتایج نشان داده نشد).
مطابق شکل 4 قطعه تکثیر شده برای ژن TAT باندی معادل bp 177 وبرای ژن GPDH باندی معادل bp200 بر روی ژل مشاهده شد.
شکل4- نمونهای از تصویر ژل آگارز مربوط به تکثیر ژن TATو GADPH در گیاهچههای تیمار شده با غلظتهای مختلف نانو ذرات اکسید مس. قطعه تکثیر شده از ژن TAT، باندی معادل bp 177 و برای ژن GPDH باندی تقریباً معادل bp200 روی ژل در کنار باند مربوط به مارکر وزن مولکولی ظاهر گردید. MW بیانگر مارکر وزن مولکولی و شمارههای 1 تا 6 به ترتیب مربوط به تیمارهای صفر، 50، 200، 500، 1000 و 2000 میلیگرم بر لیتر میباشند.
همان طور که در شکل 5 قابل مشاهده است، بیان ژن TAT تحت تأثیر نانو ذرات اکسید مس قرار گرفته و میزان بیان آن به طور معنیداری در تمامی غلظتها (به جز غلظت 2000 میلیگرم بر لیتر که نسبت به نمونه شاهد به طور معنیداری کاهشیافته است) نسبت به نمونه شاهد افزایش یافته است. بیشترین میزان بیان ژن این آنزیم در تیمار با پایینترین غلظت نانوذره مشاهده شد و با افزایش غلظت نانوذره در محیط میزان بیان آن نسبت به غلظت 50 میلیگرم بر لیتر کاهش یافت.
شکل 5- میزان بیان ژنTAT درحضورغلظتهای مختلف نانو ذرات اکسید مس. آزمایش با سه تکرار مستقل انجام شد. حروف متفاوت بالای نمودارها نشان دهنده معنیدار بودن نتایج در سطح 5 درصد است. حروف متفاوت بالای نمودارها بیانگر معنیدار بودن در سطح 05/0 است.
بحث و نتیجهگیری
در این تحقیق تأثیر غلظتهای مختلف نانوذره اکسید مس بر مسیر فنیل پروپانوئیدی شامل محتوی فلاونوئید کل و ماده مؤثره رزمارینیک اسید و همچنین بیان ژن TAT در گیاهچههای 30 روزه بادرنجبویه مورد آنالیز قرار گرفت.
براساس نتایج حاصله، تولید رزمارینیک اسید در گیاهچههای بادرنجبویه تیمار شده با نانو ذرات اکسید مس تحت تأثیر قرار گرفت و افزایش معنیدار این ماده در تیمار با تمامی غلظتهای این نانوذره نسبت به شاهد مشاهده گردید. بیشترین محتوی این ماده مؤثره در پایینترین غلظت نانوذره (50 میلیگرم بر لیتر) مشاهده گردید ولی با افزایش غلظت نانو ذره در محیط محتوی آن کاهش یافت به طوری که در بالاترین غلظت نانوذره کاهش محتوی این ماده مؤثره نسبت به نمونه شاهد در سطح 5 درصد معنیدار میباشد. این مشاهدات با نتایج منتشره شده توسط کمال زاده و همکاران (5) همخوانی دارد. آنها گزارش کردند محتوی این ماده مؤثره در گیاه بادرشبو (Dracocephalum moldavica L.) بعد از 24 ساعت تیمار با نانوذره اکسید تیتانیوم تا غلظت ppm 30 افزایش مییابد و در غلظت ppm 50 محتوی آن کاهش مییابد. بر اساس نتایج حاصله، بیان ژن TAT در گیاهچههای تیمار شده با غلظتهای مختلف نانو ذره تحت تأثیر قرار گرفته است. همان طور که در شکلهای 2و 5 مشاهده میشود، الگوی تغییرات بیان این ژن با محتوی رزمارینیک اسید گیاهچههای تیمار شده هماهنگ است. این مشاهدات با نتایج منتشر شده توسط Nasiri-Bezenjani و همکاران (2014) همخوانی دارد (26). آنها گزارش کردند که بیان ژن TAT در گیاه بادرنجبویه تحت تیمار با عصاره مخمر با تولید رزمارینیک اسید هماهنگ میباشد. همچنین مطالعات گذشته نشان داده است که تجمع رزمارینیک اسید در گیاه مریم گلی (Salvia miltiorrhiza) تحت تیمار با عصاره مخمر با فعالیت آنزیم TAT مرتبط میباشد نه با فعالیت آنزیم PAL (37). نتایج به دست آمده بر روی بیان ژن TAT با مشاهدات کمال زاده و همکاران (5) مغایرت دارد. آنها گزارش کردند که همزمان با افزایش محتوی رزمارینیک اسید در گیاه بادرشبو تیمار شده با نانوذرات اکسید تیتانیوم بیان ژنPAL تحت تأثیر قرار گرفته ولی بیان ژن TAT تحت تأثیر قرار نگرفته است.
از طرف دیگر، محتوی فلاونوئید کل گیاهچههای تیمار شده با تمامی غلظتهای نانوذره اکسید مس نیز به طور معنیداری نسبت به نمونه شاهد افزایش یافت. در مقایسه با افزایش تولید رزمارینیک اسید و بیان ژن TAT که بیشترین مقدار در غلظتهای کم نانو ذره مشاهده شد، محتوی این ترکیبات هماهنگ با افزایش غلظت نانوذره در محیط تا غلظت 1000 میلیگرم بر لیتر افزایش یافت. این نتایج میتواند به دلیل فعال شدن مسیر PALدر غلظتهای بالای نانوذره و در نتیجه افزایش محتوی فلاونوئیدها باشد.PAL یکی از آنزیمهای اصلی مسیر فنیل پروپانوئیدی میباشد (30) و افزایش فعالیت آن تحت تیمار با یون مس در برگهای گیاه Phyllanthu stenellus و افزایش بیان ژن آن تحت تیمار با نانوذرات اکسید تیتانیوم در گیاه Dracocephalum moldavica گزارش شده است (5 و 31). تغییر بیان ژنها تحت تیمار با یون مس (7) و حتی تغییر توالی DNA موجودات تحت تیمار با نانواکسید مس گزارش شده است (3).
در مجموع، این مشاهدات بیانگر تحت تأثیر قرار گرفتن مسیر سنتز فنیل پروپانوئیدی تحت تیمار با این نانوذره میباشد که با افزایش محتوی فلاونوئید کل، رزمارینیک اسید و بیان ژن TAT به خوبی نشان داده شد. تاکنون گزارشی مبنی بر افزایش محتوی رزمارینیک اسید و بیان ژن TAT تحت تیمار با این نانوذره منتشر نشده است. چنین به نظر میرسد که تحریک این مسیر با نانوذره اکسید مس از طریق تحریک بیان ژنها درگیر در این مسیر بیوسنتزی (مثلاً TAT) صورت گرفته است.
تشکر و قدردانی
این تحقیق با حمایت مالی دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، کرمان با قرارداد شماره 2674/1 انجام شده است. بنابراین مجری و همکاران مراتب سپاس و قدردانی خود را از آن دانشگاه محترم اعلام میدارند.