نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه یاسوج

چکیده

هندوانه ابوجهل از گیاهان دارویی ضد سرطان است که ساپونین‌ها و فلاونوئیدهای موجود در آن، سیستم ایمنی بدن را تحریک کرده و از این‌رو یکی از مهمترین گیاهان داروئی می‌باشد. باززایی مستقیم گیاهچه در جمعیت‌های ایرانی این گیاه در جهت تکثیر درون شیشه‌ای آن بسیار کاربردی خواهد بود. به این منظور، آزمایشی بصورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی انجام شد که فاکتورهای آن شامل ریزنمونه (ساقه و برگ)، ترکیبات هورمونی (سطوح مختلف BAP و NAA)، محیط کشت (MS کامل، ½MS و MS ¼) و جمعیت (گچساران و دهدشت) بودند. نتایج نشان دادند که در جمعیت دهدشت، ریزنمونه ساقه بهتر از ریزنمونه برگ، ولی در جمعیت گچساران میزان باززایی مستقیم از هر دو ریزنمونه یکسان بود. با توجه به صفات درصد شاخساره‌زایی، تعداد شاخساره و طول شاخساره در هر دو جمعیت دهدشت و گچساران، ترکیب هورمونی 5/1 میلی‌گرم در لیتر BAP همراه با 1 میلی‌گرم در لیتر NAAدر محیط کشت‌ ½MS بهترین باززایی مستقیم را در هر دو جمعیت (به ترتیب 4/44 و 3/33 درصد) نشان داد. بهترین محیط ریشه‌زایی برای گیاهچه‌های حاصل از باززایی در هر دو جمعیت گچساران و دهدشت محیط کشت MS حاوی 5/0 میلی‌گرم در لیتر NAA و 5/0 میلی‌گرم در لیتر BAP بود (به ترتیب 8/76 و 33/73 درصد). نتایج این تحقیق نشان داد که دو جمعیت ایرانی مورد بررسی به کشت بافت و باززای مستقیم گیاهچه پاسخ خوبی می‌دهند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Study of direct plantlet regeneration in two populations of medicinal bitter melon (Citrulus colosynthis L.) using types of explants and growth regulators

چکیده [English]

Bitter melon is an anticancer medicinal plant that its saponins and flovonoids induce immunity system of body, thus it is one of the most important medicinal plants. Direct plantlet regeneration from Iranian accessions of this plant for its in vitro propagation will be very functional. For this, an experiment was conducted in factorial based on Complete Randomized Design. It`s factors included explants (stem and leaf), hormonal combinations (different levels of BAP ad NAA), culture medium (complete MS, ½MS and ¼MS) and population (Gachsaran and Dehdasht). In Dehdasht accession, stem explants were better than leaf explants, but in Gachsaran accession was equal for both explants. In respect to shoot regeneration percent, shoot number and shoot length, hormonal combination of 1.5 mg.L-1 BAP together with 1 mg.L-1 NAA in ½MS showed the best direct regeneration in both populations (44.4 and 33.3 percent, respectively). The best medium for rooting in plantlet obtained from regeneration was MS medium containing 0.5 mg.L-1BAP and 0.5 mg.L-1NAA (76.8 and 73.33 percent, respectively). The results of this research showed that these two assessed Iranian populations have good response to tissue culture and direct plantlet regeneration .

کلیدواژه‌ها [English]

  • Shooting
  • Rooting
  • Benzylaminopurine
  • genotype

بررسی باززایی مستقیم گیاهچه در دو جمعیت گیاه دارویی هندوانه ابوجهل
(Citrullus colosynthis L.) با استفاده از انواع ریزنمونه و تنظیم­کننده­های رشد  

زینب قاسمی، اسد معصومی‌اصل* و رضا امیری فهلیانی

یاسوج، دانشگاه یاسوج، دانشکده کشاوزی، گروه اصلاح نباتات 

تاریخ دریافت: 6/7/95                  تاریخ پذیرش: 22/12/95

چکیده

هندوانه ابوجهل از گیاهان دارویی ضد سرطان است که ساپونین‌ها و فلاونوئیدهای موجود در آن، سیستم ایمنی بدن را تحریک کرده و از این رو یکی از مهمترین گیاهان دارویی می­باشد. باززایی مستقیم گیاهچه در جمعیتهای ایرانی این گیاه در جهت تکثیر درون شیشه­ای آن بسیار کاربردی خواهد بود. به این منظور، آزمایشی به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی انجام شد که فاکتورهای آن شامل ریزنمونه (ساقه و برگ)، ترکیبات مواد تنظیم­کننده رشد (سطوح مختلف BAP و NAA)، محیط کشت (MS کامل، ½MS و MS ¼) و جمعیت­ (گچساران و دهدشت) بودند. نتایج نشان دادند که در جمعیت دهدشت، ریزنمونه ساقه  بهتر از ریزنمونه برگ، ولی در جمعیت گچساران میزان باززایی مستقیم از هر دو ریزنمونه یکسان بود. با توجه به صفات درصد شاخساره­زایی، تعداد شاخساره و طول شاخساره در هر دو جمعیت دهدشت و گچساران، ترکیب مواد تنظیم­کننده رشدی 5/1 میلی‌گرم در لیتر BAP همراه با یک میلی­گرم در لیتر   NAAدر محیط کشت‌ ½MS بهترین باززایی مستقیم را در هر دو جمعیت (به ترتیب 4/44 و 3/33 درصد) نشان داد. بهترین محیط ریشه‌زایی برای گیاهچه‌های حاصل از باززایی در هر دو جمعیت گچساران و دهدشت محیط کشت MS حاوی 5/0 میلی‌گرم در لیتر NAA و 5/0 میلی‌گرم در لیتر BAP بود (به ترتیب 8/76 و 33/73 درصد). نتایج این تحقیق نشان داد که دو جمعیت ایرانی مورد بررسی در محیط کشت درون شیشه­ای به باززایی مستقیم گیاهچه پاسخ خوبی می‌دهند.

واژه‌های کلیدی: شاخساره­زایی، ریشه­زایی، بنزیل آمینوپورین، ژنوتیپ

* نویسنده مسئول، تلفن: 07433224840 ، پست الکترونیکی: masoumiasl@yu.ac.ir

مقدمه 

 

هندوانه ابوجهل با نام علمی Citrulus colocynthis L. گیاهی دارویی از خانواده کدوئیان است. این گیاه متعلق به نواحی گرمسیری بوده و به صورت خودرو رشد می‌کند (10). در طب سنتی، عموماً از این گیاه برای درمان بیماریهای گوناگون استفاده می‌شود. این گیاه جزء گیاهان دارویی سمی می‌باشد که علاوه بر مسهل بودن، به دلیل وجود ماده تلخی که در آن است، درصد قند خون انسان را کاهش داده و در درمان دیابت مؤثر می‌باشد (4).

از آنجا که کشت بافت درون‌شیشه­ای امکان شناخت و کنترل عوامل موثر در تمایز زدایی، باززایی و تکثیر انبوه را فراهم می‌سازد، بنابراین می‌تواند ابزار مناسبی برای حذف عوامل محیطی و یکسان‌سازی مواد گیاهی باشد (2). تشکیل مستقیم اندامها روی سطح قطعات ریزنمونه‌های گیاهی، بدون مداخله مرحله پینه را باززایی مستقیم می‌نامند (9). که پایداری ژنتیکی در باززایی مستقیم بیشتر می‌باشد (6). به‌طور‌کلی، باززایی مستقیم از راهکارهای قابل توجه برای تکثیر درون‌شیشه‌ای سریع و در مقیاس وسیع  گیاهان بوده و مزایایی نظیر صرفه‌جویی در زمان، سادگی، ثبات ژنتیکی و پایین بودن تنوع سوماکلونی را دارد (12). ساتیاوانی و همکاران (2011) (24) اثر تنظیم­ کننده‌های رشد روی پینه‌زایی و باززایی غیرمستقیم هندوانه ابوجهل جمعیت پارانگی‌پتایی هند را بررسی کرده و روش ریزازدیادی با استفاده از ریزنمونه ساقه را ارائه نمودند (24). نتایج آنها نشان داد که حداکثر تعداد پینه القا شده در محیط MS، همراه با 5/0 میلی‌گرم در لیتر از مواد تنظیم­کننده رشد‌ IAA و 2,4-D و یک میلی‌گرم در لیتر6-BA  به دست آمد. در همین مطالعه، بیشترین درصد ریشه‌زایی در غلظت 4 میلی‌گرم در لیتر IBA گزارش شد. در تحقیق دیگری، بیشترین باززایی هندوانه ابوجهل از ریزنمونه نوک ساقه هندوانه ابوجهل، در محیط کشت MS دارای 5/0 میلی‌گرم در لیتر BAP و 5/0 میلی‌گرم در لیتر NAA گزارش گردیده است (18). ورما و همکاران (2013) (26) دستورالعمل باززایی گیاهچه با استفاده از ریزنمونه­های قطعات گره­دار و نوک ساقه را برای هندوانه ابوجهل ارائه نموده­اند. در این تحقیق القای شاخساره و تکثیر آن روی محیط کشت MS حاوی 2/2 میکرومول BA انجام و شاخساره­های به دست آمده در همین محیط کشت طویل شدند. ریشه­زایی نیز در محیط کشت MS½ حاوی 9/4 میکرومول IBA انجام شد (26). گاریماتروسیان (2015) (17) از ریزنمونه­های کوتیلدون، جوانه انتهایی، هیپوکوتیل و ریشه دانهالهای 10 روزه هندوانه ابوجهل استفاده کرد که برای ریزنمونه جوانه انتهایی از دو محیط کشت MS حاوی IAA و کینتین (1 میلی­گرم در لیتر) و نیز از محیط کشتهای شامل مقادیر دو برابر ویتامینهای محیط کشت MS و مواد تنظیم­کننده رشد BAP (2 میلی­گرم در لیتر) و NAA (1/0 میلی­گرم در لیتر) استفاده شد (17). نتایج وی نشان داد که پینه­زایی در حضور مواد تنظیم­کننده رشد BAP و NAA بهتر از مواد تنظیم­کننده رشد IAA و کینتین بود ولی شاخساره­زایی در حضور مواد تنظیم­کننده رشد IAA و کینتین انجام شد. راما کریشنا و شاستری (2015) (22) نشان دادند که بهترین ریشه­زایی در ریزنمونه­های ساقه هندوانه ابوجهل روی محیط کشت MS حاوی 2 میلی­گرم در لیتر IAA و 5/1 میلی­گرم در لیتر IBA انجام می­شود (22). ساویتا و همکاران (2010) (25) با استفاده از ریزنمونه های برگ و ساقه هندوانه ابوجهل نشان دادند که حداکثر شاخساره­زایی (75 درصد) روی پینه حاصل از ریزنمونه برگ و در محیط کشت MS حاوی 5/2 میلی­گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی­گرم در لیتر تیدیازورون به دست آمد (25). حداکثر ریشه­زایی (60 درصد) نیز روی محیط کشت MS حاوی 5/1 میلی­گرم در لیتر IBA مشاهده گردید. مینا و همکاران (2014) (19) دستورالعملی برای باززایی سریع از ریزنمونه نوک ساقه ارائه کردند که در آن از محیط کشت MS حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر  BAP و 5/0 میلی­گرم در لیتر  NAAاستفاده گردید. ریشه­زایی نیز در محیط کشت حاوی 4 میلی­گرم در لیتر IBA دارای 2/0 درصد زغال فعال انجام گردید (19).

از آنجا که در باززایی غیرمستقیم، گیاهچه با واسطه پینه تشکیل می­شود بنابراین ممکن است در آنها تنوع سوماکلونال ایجاد شود که این تنوع می­تواند گیاهچه­هایی با ساختار ژنتیکی متفاوت ایجاد نماید (16). از این رو به نظر می­رسد باززایی مستقیم گیاهچه در جهت ایجاد گیاهان یکنواخت و بدون هیچ گونه تنوع ناخواسته مطلوب­تر می­باشد. با توجه به اینکه گزارشی از ریزازدیادی جمعیتهای ایرانی گیاه دارویی هندوانه ابوجهل موجود نیست و اکثر گزارشات در مورد جمعیتهای بومی کشورهایی مثل هند و ارمنستان یا افریقاست و از طرفی در هیچ یک از آنها همزمان از دو جمعیت به طور مقایسه­ای استفاده نشده، لذا در تحقیق حاضر پاسخ به باززایی مستقیم دو جمعیت بومی هندوانه ابوجهل متعلق به استان کهگیلویه و بویراحمد بررسی شد. از آنجایی که بررسی پاسخ به کشت بافت هر گیاه دارویی (به خصوص باززایی مستقیم) مطالعه‌ای بنیادی است که می­تواند مقدمه تکثیر کلونی آن در محیط آزمایشگاهی باشد که قادر است در زمان و فضای کم تعداد زیادی گیاه همسان تولید نماید، از این رو با بهینه­سازی روش باززایی مستقیم این گیاه می توان تعداد زیادی گیاه همسان تولید و آن را از خطر انقراض نجات داد. از این جهت گزارش دستورالعمل باززایی مستقیم برای جمعیتهای بومی گیاهان دارویی مهم کشور اهمیت زیادی دارد.

مواد و روشها

میوه‌های هندوانه ابوجهل در اواخر مردادماه سال 1391 همزمان با رسیدگی کامل، از مناطق اطراف شهرستانهای گچساران و دهدشت واقع در استان کهگیلویه و بویراحمد جمع‌آوری گردید. بذرهای هندوانه ابوجهل در آفتاب خشک شد و سپس از مغز بذور جهت تولید گیاهچه و از اندام هوایی گیاهچه­های تولید شده در شرایط درون شیشه­ای (شامل برگ و ساقه) جهت انجام آزمایش باززایی استفاده گردید. بذرها ابتدا با استفاده از آب لوله‌کشی شسته شده، سپس به مدت 15 دقیقه در هیپوکلریت سدیم 5 درصد ضدعفونی و در نهایت با آب دوبار تقطیر سه بار شستشو داده شد و جهت نرم شدن پوسته به‌ مدت 24 ساعت در آب دو بار تقطیر قرار داده شدند. در زمان کشت، بذور فوق به زیر لامینارایرفلو منتقل و پوسته‌ بذور توسط پنس و اسکالپل جدا شده و مغز بذور در محیط MS کشت شدند.

جهت تعیین مناسب‌ترین نوع ریزنمونه، محیط کشت و ترکیب مواد تنظیم­کننده رشد در آزمون شاخساره­زایی از ریزنمونه‌های ساقه و برگ، محیطهای کشت  MSکامل، ½MS و  MS¼ و ترکیبات مختلف مواد تنظیم­کننده رشد BAP (5/0، 1، 5/1 و 2 میلی‌گرم در لیتر) و NAA (5/0، 1 و 5/1 میلی‌گرم در لیتر) استفاده شد. لازم به ذکر است که از بین همه ترکیبات ممکنه، بر اساس مقالات موجود تعدادی از بهترین ترکیبات مواد تنظیم­کننده رشد انتخاب و سپس آزمایش طراحی گردید. آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار اجرا گردید. پس از کاشت ریزنمونه‌ها، ظروف کشت به قفسه‌های اتاق کشت منتقل و 5 هفته پس ازکاشت، صفاتی از قبیل درصد شاخساره‌زایی، تعداد شاخساره، طول اندام هوایی (میلی‌متر) و وزن تر و خشک اندام هوایی (میلی‌گرم) اندازه‌گیری شدند.

به منظور تعیین بهترین غلظت مواد تنظیم­کننده رشد جهت ریشه‌زایی، شاخساره‌های کاملاً رشدیافته حاصل از آزمایشهای قبلی بر روی محیطهای کشت MSکامل، ½MS و MS ¼ حاوی ترکیبات مختلف مواد تنظیم­کننده رشد کشت گردیدند. تیمارهای مواد تنظیم­کننده رشد به‌کار رفته ترکیبات منتخبی از مواد تنظیم­کننده رشد BAP (1/0، 2/0، 3/0، 5/0، 1، 5/1، 2، 3، 4 و 5 میلی‌گرم در لیتر) و NAA (1/0، 2/0، 3/0، 5/0، 7/0، 1، 5/1 و 2 میلی‌گرم در لیتر) بود. این آزمایش نیز به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار پیاده گردید. ظروف کشت حاوی شاخساره­های تولید شده در شرایط درون شیشه­ای به قفسه‌های اتاق کشت منتقل و 3 هفته پس از تشکیل و رشد ریشه، صفات درصد ریشه‌زایی، تعداد ریشه و طول ریشه (میلی‌متر) اندازه‌گیری شدند. گیاهچه‌های باززایی شده از هر دو روش باززایی، به گلدانهای کوچک حاوی خاک استریل (نسبت 3 به 1 خاک و ماسه) منتقل شدند. برای سازگاری تدریجی با شرایط طبیعی و حفظ رطوبت نسبی بالا و کنترل آلودگی، از درپوشهای شیشه‌ای استفاده گردید. پس از سازگاری گیاهچه‌ها با شرایط طبیعی، درپوشها برداشته شده و گیاهچه‌ها به گلدانهای بزرگ‌تر منتقل شدند. این گیاهچه‌ها تبدیل به گیاه کامل گردیده و توانستند به خوبی مستقر شده و رشد کنند. تجزیه‌ آماری داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار SAS نسخه 1/9 انجام گردید. مقایسه میانگین اثرهای اصلی به روش LSD در سطح 5 درصد و در صورت معنی‌دار بودن برهمکنشها، مقایسه میانگینها با استفاده از رویه LSmeans انجام شد. رسم نمودارها نیز با استفاده از نرم افزار Excel صورت پذیرفت.

نتایج

حدود 5 هفته پس از کاشت ریزنمونه‌ها تشکیل شاخساره شروع گردید. تجزیه واریانس داده­ها نشان داد که برهمکنش ریزنمونه، محیط کشت، ترکیب مواد تنظیم­کننده رشد و جمعیت برای همه صفات مورد بررسی معنی‌دار شد (جدول نشان داده نشده است). مقایسه میانگین این برهمکنش در جمعیتهای دهدشت و گچساران (جدول 1) نشان داد که در جمعیت دهدشت، بیشترین درصد شاخساره‌زایی (4/44 درصد) با ریزنمونه ساقه و در ترکیبهای 5/0 و 5/1 میلی‌گرم در لیتر BAP همراه با 1 و 5/0 میلی گرم در لیترNAA  در محیطهای کشت MS کامل، ½MS و MS ¼ به دست آمد (شکل 1).

 

جدول1 - مقایسه میانگین برهمکنش ریزنمونه، جمعیت، محیط‌کشت، BAP و NAA برای صفات مورد ارزیابی در مرحله باززایی مستقیم

وزن تر شاخساره (میلی‌گرم)

Shoot fresh weight (mg)

طول شاخساره (میلی‌متر)

Shoot height (mm)

تعداد شاخساره

Shoot number

درصد شاخساره زایی

Shoot regeneration percent

BAP (mg.L-1)

NAA (mg.L-1)

محیط کشت

Medium

ریز نمونه

Explant

جمعیت

population

270c

16b

2b

44.4a

1.5

1

MS

ساقه

Shoot

دهدشت

Dehdasht

700a

19.6a

4.3a

44.4a

1.5

1

½MS

430b

16b

4a

44.4a

1.5

1

MS¼ 

70c

9c

1.3c

44.4a

0.5

0.5

150c

14.3b

1.3c

33.3b

2

1.5

MS¼ 

برگ Leaf

160c

13.6b

1.6b

33.3b

1.5

1

½MS

ساقه Shoot

گچساران

Gachsaran

43cd

7.3c

1.3c

33.3b

1.5

0.5

MS¼ 

برگ Leaf

در هر ستون میانگینهایی که حداقل دارای یک حرف مشابه هستند از نظر آماری در سطح 5 درصد تفاوت ندارند.

 

شکل 1- روند تغییرات تعداد شاخساره تولید شده از ریز نمونه‌های ساقه و برگ در ترکیبات هورمونی متفاوت

 

برای کمتر مصرف کردن و اقتصادی نمودن محیط کشت و مواد تنظیم کننده رشد می توان از ترکیب مواد تنظیم­کننده رشد 5/0 میلی‌گرم در لیتر BAP همراه با 5/0 میلی­گرم در لیترNAA  در محیط کشت MS¼ را برای ریزنمونه ساقه در جمعیت دهدشت پیشنهاد کرد. در همین جمعیت، بیشترین درصد شاخساره‌زایی از ریزنمونه برگ با ترکیب 2 میلی‌گرم در لیتر BAP همراه با 1 و 5/1 میلی‌گرم در لیتر NAA در محیط کشت  MS¼ به دست آمد (شکل 2).

 

 

شکل 2- باززایی مستقیم شاخساره از (A) ریزنمونه برگ در محیط کشت  حاوی  2 میلی‌گرم در لیتر BAP و 5/1 میلی‌گرم در لیتر NAA و (B) ریزنمونه‌ ساقه در محیط کشت  حاوی  5/1 میلی‌گرم در لیتر BAP و 1 میلی‌گرم در لیتر NAA در جمعیت دهدشت

 

ریزنمونه برگ نسبت به ریزنمونه ساقه شاخساره­زایی کمتری دارد. بنابراین هم از نظر میزان باززایی و هم از نظر اقتصادی، بهتر است برای باززایی مستقیم شاخساره در جمعیت دهدشت از ریزنمونه ساقه استفاده گردد (شکل 3).

 

 

شکل3- باززایی ریشه از (A) ریزنمونه ساقه  و (B) ریزنمونه برگ در ترکیب هورمونی 5/0 میلی‌گرم در لیتر NAA و 5/0 میلی‌گرم در لیتر BAP در جمعیت دهدشت

 

لازم به‌ذکر است ترکیبات مواد تنظیم­کننده رشد زیادی در هر آزمایش بررسی شدند که به جهت اختصار فقط ترکیبات مواد تنظیم­کننده رشد که پاسخ مناسبی نشان دادند، گزارش می‌شود. براساس جدول 1، در جمعیت گچساران دو ریزنمونه از نظر درصد شاخساره­زایی تفاوتی با همدیگر ندارند، ولی ریزنمونه برگ محیط کشت کمتری نسبت به ریزنمونه ساقه نیاز دارد، چرا که ریزنمونه برگ با یک چهارم ولی ریزنمونه ساقه با یک دوم محیط کشت کامل MS توانسته شاخساره­زایی را شروع نماید (شکل 4). با این حال با در نظر گرفتن مجموع صفات مورد بررسی، ریزنمونه ساقه نسبت به ریزنمونه برگ برتری نشان می­دهد، لذا برای باززایی مستقیم شاخساره در جمعیت گچساران، بهتر است از ریزنمونه ساقه استفاده گردد. براساس نتایج به دست آمده، دو جمعیت مورد بررسی از نظر میزان باززایی مستقیم تفاوت داشته و جمعیت دهدشت بهتر از جمعیت گچساران به باززایی مستقیم پاسخ می­دهد. علت احتمالی این برتری، جمعیت متفاوت و نیز تفاوت آب و هوایی دو منطقه دهدشت و گچساران می باشد.

 

 

شکل 4- باززایی مستقیم از (A) ریزنمونه‌ برگ در محیط کشت  حاوی  5/1 میلی‌گرم در لیتر BAP و 5/0 میلی‌گرم در لیتر NAA و (B) ریزنمونه ساقه در محیط کشت  حاوی  5/1 میلی‌گرم در لیتر BAP  و 1 میلی‌گرم در لیتر NAA در جمعیت گچساران

 

از نظر ریشه‌زایی (جدول 2) هر دو جمعیت مورد بررسی در ترکیب 5/0 میلی‌گرم در لیتر BAP همراه با 5/0 میلی­گرم در لیترNAA  در محیط کشت  MSریشه­زایی نشان دادند. در جمعیت گچساران ریشه­زایی 80/76 درصد ولی در جمعیت دهدشت، ریشه‌زایی 33/93 درصد بود. با توجه به مجموع صفات مورد بررسی در این مرحله، جمعیت دهدشت از نظر ریشه­دهی نسبت به جمعیت گچساران برتری نشان می­دهد.

گیاهچه­های ریشه­دار شده حاصل از باززایی مستقیم حدود یک ماه پس از انتقال در محیط خاک نیز رشد مناسبی انجام داده و به خوبی مستقر شدند (شکل 5).

 

جدول 2- مقایسه میانگین برهمکنش جمعیت و ترکیب هورمونی برای صفات مورد ارزیابی در مرحله ریشه‌زایی

طول ریشه (میلی‌متر)

Root length (mm)

تعداد ریشه

Root number

درصد ریشه‌زایی

Rooting percent

NAA (mg.L-1)

BAP (mg.L-1)

جمعیت population

a 47

a 8.86

a 93.33

0.5

0.5

دهدشت Dehdasht

b 41

b 5.66

b 76.80

0.5

0.5

گچساران Gachsaran

در هر ستون میانگینهایی که حداقل دارای یک حرف مشابه هستند از نظر آماری در سطح 5 درصد تفاوت ندارند.

 

شکل 5- انتقال و سازگاری گیاهچه باززایی شده ( A و B)

 

بحث

با توجه به اینکه هر یک از این جمعیتها ساختار ژنتیکی متفاوت داشته و میزان هورمونهای داخلی آنها متفاوت از هم است، بنابراین تفاوت پاسخ آنها به ترکیبات مختلف مواد تنظیم­کننده رشد و نوع محیط کشت دور از انتظار نیست. کبیرهاشمی و همکاران (1395) (7) نیز با بررسی باززایی گیاهچه از پینه در دو رقم خربزه ایرانی به روش درون شیشه­ای نشان دادند که اثر نوع رقم روی باززایی پینه­ها معنی­دار می­باشد (7).

سیتوکینین‌ها نقش اساسی در تقسیم سلولی داشته، باعث رفع غالبیت انتهایی شده و بر رشد ساقه اثر می‌گذارند. بر اساس گزارش پریس (1995) (21) و بایلیس (1985) (11)، علت همگرایی سیتوکینین با اکسین در تقسیم سلولی این است که اولاً، برای تقسیم سلول ابتدا باید بزرگ شدن سلول اتفاق بیفتد و به دنبال آن تقسیم سلولی انجام بگیرد و تا زمانی­که سلول به یک اندازه‌ مشخص نرسیده، تقسیم سلولی صورت نخواهد پذیرفت. ثانیاً، مراحل اولیه تقسیم سلولی نیازمند به اثر اکسین است (11 و 21). باید توجه داشت که تبدیل محیط کشت MS کامل به محیط کشتهای ½MS و MS¼ باعث می‌شود که اثر مواد تنظیم‌کننده رشد نیز متفاوت باشد، چرا که مواد مختلف موجود در محیط کشت رویهم اثرات هم‌افزایی یا متضاد دارند. نتایج تحقیق حاضر تا حدودی با نتایج تحقیق مینا و همکاران (2007) (19) مطابقت داشت هر چند به واسطه تغییر محیط کشت و جمعیت، مقادیر مواد تنظیم­کننده رشد متفاوت بودند. آنها گزارش داده‌اند که بیشترین باززایی هندوانه ابوجهل از ریزنمونه ساقه در محیط کشت MS کامل حاوی 5/0 میلی‌گرم در لیتر BAP و 5/0 میلی‌گرم در لیتر  NAA به دست می­آید. بررسی ریزازدیادی درون شیشه­ای گیاه دارویی پروانش نیز نشان داد که با افزایش غلظت کینتین درصد اندام­زایی و با افزایش غلظتNAA  تعداد ساقه به ازای هر ریزنمونه افزایش یافت. ترکیب مواد تنظیم‌کننده رشد یک میلی­گرم در لیتر NAA به همراه 1/0 میلی­گرم در لیتر کینتین با میانگین 13 گیاهچه بالاترین تعداد تولید گیاهچه را دارا بودند. همچنین بهترین مقدار BAP با 87 درصد اندام­زایی، غلظت 1/0 میلی­گرم در لیتر و بهترین ترکیب مواد تنظیم‌کننده رشد 1/0 میلی­گرم در لیتر BAP به همراه 2 میلی­گرم در لیتر NAA با 100 درصد اندام زایی بود (1). 

به­طورکلی، با توجه به مقایسه‌ای که بین دو ریزنمونه ساقه و برگ صورت گرفت، مشخص شد که ریزنمونه ساقه پاسخ بهتری به باززایی مستقیم در هر دو جمعیت دهدشت و گچساران نشان داده است. این نتیجه با نتایج به دست آمده توسط ساتیاوانی و همکاران (2011) (24) در گیاه هندوانه ابوجهل که از ریزنمونه ساقه جهت ریزازدیادی استفاده کرده بودند، مطابقت دارد که دلیل احتمالی آن را میزان غلظت مواد تنظیم‌کننده رشد درونی قطعات ریزنمونه می­تواند باشد. بررسی ریزازدیادی گیاه دارویی سرخارگل با استفاده از ریزنمونه­های کوتیلدون و هیپوکوتیل نیز نشان داد که بیشترین میزان پینه­زایی در ریزنمونه کوتیلدون به میزان 97 درصد و در ریزنمونه هیپوکوتیل به میزان 91 درصد بود (5).

باززایی یک فرآیند فوق‌العاده پیچیده است که عوامل متعدد کمی و کیفی مانند خصوصیات ژنتیکی گیاه، نوع ریزنمونه، سن ریزنمونه، میزان هورمونهای درون‌زا، اندازه ریزنمونه و مقدار تنظیم‌کننده‌های رشد و غیره بر آن تأثیر می‌گذارند (2). بر اساس نتایج به دست آمده و با استناد به یافته‌های دلپوزا و همکاران (2005) (15)، اثر سیتوکینین‌ها در کشت بافت بسیار قابل توجه است و اغلب همراه با اکسین جهت بهبود تقسیم سلولی و کنترل اندام‌زایی استفاده می‌شود (15). ثابت شده است که هورمونها با همدیگر برهمکنش داشته و می‌توانند اثرات همدیگر را بهبود بخشند. به­طور کلی تشکیل شاخساره چه به طور مستقیم از بافت ریزنمونه یا غیرمستقیم از پینه، توسط تعادل مواد تنظیم­کننده رشدی بین اکسین و سیتوکینین تنظیم می‌شود. بر اساس نتایج مسزاروس (2006((20)، غلظت مناسب از هر نوع تنظیم‌کننده رشد، تا حد زیادی بستگی به نوع گونه‌ گیاهی، شرایط کشت و ترکیبات محیط کشت دارد (20). ترکیب مواد تنظیم­کننده رشد معرفی شده در این آزمایش هم دارای این ویژگی است، به طوری که با افزودن اکسین به محیط کشت شاخساره‌زایی، تشکیل ساقه‌های جانبی از ریزنمونه‌های ساقه شروع و باعث افزایش رشد اندام کشت شده می‌گردد. از آنجا که افزودن اکسین در غلظتهای کم به محیط کشت ساقه‌زایی، باعث مهار اثر غلظتهای بالای سیتوکینین روی طویل شدن شاخه‌های جانبی می‌‌شود، لذا در این تحقیق نیز غلظت پایین NAA در برابر BAP بالا پاسخ بهتری به باززایی نشان داد. تأثیر NAA و BAP برای افزایش تولید شاخساره در گیاه ریحان (Basilicum polystachyon) (14) و هندوانه ابوجهل (18، 19، 23، 25 و 26) گزارش شده است. نتایج مشابهی نیز در رابطه با شاخساره‌زایی از ریزنمونه ساقه در محیط MS حاوی ترکیب هورمونی BAP و NAA در درختچه زراوند هندی Aristolochia sp.)) (22) و خربزه (Cucumis melo L.) (3) گزارش شده است. بر اساس نتایج به دست آمده در این تحقیق، کاربرد مقدار مشخصی BAP، باعث افزایش باززایی می‌شود که این نتیجه با یافته‌های کبیر هاشمی و همکاران (1395) نیز مطابقت دارد.

طبق تحقیقات بوربولیس و همکاران (2009) (13) که روی اثرات ژنوتیپ و تنظیم‌کننده‌های رشد در کشت ریزنمونه‌های محور زیرلپه کتان روغنی (Linum usitatissimum L.) صورت گرفت، مشخص شد که در بین ژنوتیپهای مورد مطالعه، تفاوت معنی‌داری از لحاظ پتانسیل تشکیل ریشه وجود دارد (13). نسبت بهینه تنظیم‌کننده‌های رشد برای تولید ریشه به ژنوتیپ یا جمعیت بستگی دارد. باززایی ریشه در حضور NAA و BAP در گیاه لوبیا Phaseolus vulgaris) ) (8) و غلظتهای متفاوتی ازIBA  در گیاه دارویی هندوانه ابوجهل (18، 19، 25 و 26) گزارش شده است. از آنجاکه هورمون NAA نقش به­سزایی در ایجاد ریشه دارد (8)، لذا در این تحقیق، از ترکیب این مواد تنظیم­کننده رشد و BAP در ریشه‌زایی هندوانه ابوجهل استفاده شد که نتیجه بخش بود.

نتیجه­گیری کلی

در باززایی مستقیم گیاهچه در جمعیت دهدشت ریزنمونه ساقه پاسخ بهتری نشان داده و ترکیب 5/1 میلی‌گرم در لیتر BAP به همراه 1 میلی‌گرم در لیتر NAA در محیط کشت ½MS بهترین ترکیب مواد تنظیم­کننده رشد و محیط کشت بود. در جمعیت گچساران نیز بیشترین درصد ساقه‌زایی (3/33 درصد) مربوط به ریزنمونه ساقه در ترکیب مواد تنظیم­کننده رشد 5/1 میلی‌گرم در لیتر BAP و 1 میلی‌گرم در لیتر NAA در محیط کشت ½MS بود. در مجموع، جمعیت دهدشت در مقایسه با جمعیت گچساران پاسخ بهتری به باززایی مستقیم نشان می‌دهد. در مرحله ریشه‌زایی نیز بهترین ترکیب، 5/0 میلی‌گرم در لیتر NAA و 5/0 میلی‌گرم در لیتر BAP برای گیاهچه‌های حاصل از باززایی مستقیم در هر دو جمعیت دهدشت و گچساران بود.

1- احمدی، ج.، ر. محمدی و ق. گروسی .1393. ریزازدیادی درون شیشه­ای گیاه دارویی پروانش (Catharanthus roseus (Linn.) G. Don) از طریق اندام­زایی ساقه. مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)، 27 (1): 14-25.

2- پیریک آر. ال. ام. 1376. مبانی کشت بافت گیاهی (برگردان از عبدالرضا باقری). انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد. 252 صفحه.

3- خیرآبادی، م. ا.، م. لطفی، م. توحیدفر، د. نادری و ش. صداقت‌فر. 1389. بررسی تاثیر عمر دانهالی بر باززایی مستقیم شاخه در خربزه ایرانی، پنجمین همایش ایده‌های نو در کشاورزی- دانشگاه آزاد اسلامی واحد خوراسگان، اصفهان، ایران.

4- دوازده امامی، س. و ن. مجنون حسینی. 1386 . زراعت و تولید برخی گیاهان دارویی و ادویه­ای. انتشارات دانشگاه تهران، 300 صفحه.

5- زبرجدی، ع.، م. ج. معتمدی، ا. طراوت و ا. اسماعیلی. 1392. ریزازدیادی گیاه دارویی سرخارگل (Echinacea purpurea L.) با استفاده از قطعات کوتیلدون و هیپوکوتیل. مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)، 26(3):
 311-319.

6- عصاره، م. ح. و ح. سردابی. 1386. اکالیپتوس (شناخت، معرفی و ازدیاد با استفاده از فناوری‌های نوین). چاپ اول. تهران، انتشارات موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور. 368 صفحه.

7- کبیرهاشمی، س. م.، ع. قنبری، و ع. کاشی. 1395. اثر تنظیم­کننده­های رشد گیاهی بر باززایی گیاهچه از پینه دو رقم خربزه (Cucumis melo L.) ایرانی به روش درون شیشه­ای. مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)، 29(1):
 159-168.

8- کرمی، م.، م. ب. باقریه نجار، و م. اقدسی. 1392. بهینه سازی شرایط باززایی گیاه لوبیا (Phaseolus vulgaris L.)، زیست‍شناسی گیاهی، 15: 1-14.

9- میرلوحی، ف.، و م. خیام نکوئی. 1383. فرهنگ واژگان کشت بافت گیاهی. کرج، سازمان تحقیقات و آموزش کشاورزی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، 364 صفحه.

 

10- Bankole S. A., Osho A., Joda A. O., Enikuomehin A. O. 2005. Effect of drying methods on the quality and storability of Egusi Melon seeds (Colocynthis citrullus L.). Afri. J. Biotechnol, 4: 799-803.

11- Bayliss, M. 1985. Control of cell division in cultured cells. In: Bryant J. A and Francis D (eds)   The cell division cycle in plants. Cambridge: Cambrige Univercity Press, pp. 157-178.

12- Beegum, S. A., K. P. Martin, C. L. Zhang, I. K. Nishitha, M. Ligimol, A. Slater, and P. V. Madhusoodanan. 2007. Organogenesis from leaf and internode explants of Ophiorrhiza prostrata, an anticancer drug (camptothecin) producing plant. Electron J. Biotechnol, 10 (1): 114–123.

13- Burbulis, N., A. Blinstrubiene, and R. Kupriene. 2009. Regeneration of adventitious shoots of linseed (Linum usitatissimum L.) from hypocotyle explants. Zemdirbyste-Agricul, 96 (3): 168-175.

14- Chakraborty, D., K. Bhattacharya, A. Bandyopadhyay and K. Gupta. 2006. Studies on the germination behavior of Basilicum polystachyon- an ethnobotanically important medicinal plant. Iranian J. Medi. Aroma. Plants, 25: 58-62.

15- Del-Poza, J. C., M. A. Lopeza-Matas E. Ramireza-Parra and C. Gutierrez. 2005. Hormonal control of the plant cell cycle. Physiol. Planta, 123: 173-183.

16- Evan, D. E., Coleman, J. O. D. and Kearns, A. 2003. Plant Cell Culture. Bios Scie. Publishers. pp: 153-158.

17- Gharehmatrossian S. 2015. Evaluation of callus induction and plant regeneration in citrullus colocynthis (L.) Schard. Iranian J. Plant Physiol, 5(2): 1333-1338.

18- Meena M., Meena R., and Patni V. 2010. High frequency plant regeneration from shoot tip explants of Citrulluscolocynthis an important medicinal herb. Afri. J. Biotechnol, 9 (31): 5037- 5041.

19- Meena M. Ch., Meena R. K. and V. Patni. 2014. High frequency plant regeneration from shoot tip explants of Citrullus colocynthis (Linn.) Schrad.–An important medicinal herb. J. Pharmacog. and Phytochem, 2 (6): 53-56.

20- Meeszaros, A. 2006. Application of methods suitable for improving the efficiency of in vitro propagathin on Horticultural Plants. Ph.D. Thesis. Corvinus University of Budapest, 26 (2): 156-189.

21- Preece, J. E. 1995. Can nutrient salts partially substitute for plant prowth regulators. Plant  Tiss. Cult. Biotech, 1: 26-37.

22- Rama Krishna D., T. Shasthree. 2015. Adventitious Rooting and Proliferation from Different Explants of Citrullus colocynthis (L.) Schrad an Endangered Medicinally Important Cucurbit. Asian J. Biotech, 7 (2): 88-95.

23- Rani Mallick. S., R. Chandra Jena and K. Chandra Samal. 2012. Rapid in vitro Multiplication of an Endangered Medicinal Plant Sarpgandha (Rauwolfia serpentina). American J. Plant Sci,3: 437-442.

24- Satyavani. K., T. Ramanathan and S. Gurudeeban. 2011. Effect of plant growth regulators on callus inducthion and plantlet regeneration of Bitter Apple (Citrullus colosynthis) from stem explant. Asian J. Biotech, 10: 508-602.

25- Savitha R., Shasthree T., Sudhakar, Mallaiah B. 2010. High frequency of plantlet regeneration and multiple shoot induction from leaf and stem explant of citrullus colosynthis (L.) schrad, an endangered medicinal cucurbit. International J. Pharma and Bio Sci, 1(2): 1-8.

26- Verma K. S., Kachhwaha S. and S. L. Kothari. 2013. In vitro plant regeneration of Citrullus colocynthis (L.) Schard. And assessment of genetic fidelity using ISSR and RAPD markers. Indian J. Biotech, 12: 409-414.