نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 عضو هیات علمی بخش تحقیقات جنگلها و مراتع، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی استان کرمانشاه، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرمانشاه، ایران

2 مدرس دانشگاه پیام نور

3 کارشناس ارشد دانشگاه ایلام

چکیده

تنوع‌ژنتیکی 12 ژنوتیپ از گونه مرتعی Lolium perenne با استفاده از نشانگر‌های مولکولی و بیوشیمیایی مورد بررسی قرار گرفت. برای هر ژنوتیپ پروتئین‌های محلول برگ به روش Laemmli استخراج، و با ژل پلی آکریل آمید 12% مورد بررسی قرار گرفتند. تعداد 12 باند برای 12 ژنوتیپ مورد بررسی مشاهده شد، که از 12 باند حاصل تعداد 6 باند چند شکل بود و در 6 باند نیز چند شکلی مشاهده نشد. بیشترین تعداد باند مربوط به ژنوتیپ Tyrone با 12 باند و کمترین تعداد باند مربوط به ژنوتیپ Green Gold با 6 باند بود. نتایج تجزیه کلاستر و تجزیه به مختصات اصلی ژنوتیپ‌های مورد مطالعه را در سه دسته قرار داد. با استفاده از 12 آغازگر ISSR تنوع ژنتیکی ژنوتیپ‌ها مورد بررسی قرار گرفت که از این 12 آغازگر 10 عدد دارای باندهای قابل امتیاز ‌دهی بودند. آغازگرهای ISSR در مجموع توانستند 62 باند تولید کنند که از این تعداد، 15 باند یک شکل، سایر باندها چند شکل بودند. میانگین تعداد باند تولید شده توسط هر آغازگر برای 12 ژنوتیپ برابر 2/6 بود. آغازگر IS9 بیشترین تعداد باند (تعداد 11 باند) و آغازگر IS15 کمترین تعداد باند (تعداد 3 باند) را نشان دادند. بر اساس مارکر ISSR چندشکلی مطلوبی در بین ژنوتیپ‌ها مشاهده شد و آغازگرهای IS9، IS10، IS13 و IS16 به عنوان آغازگرهای مناسب برای بررسی‌های گونه چچم دائمی، تعیین شد. بررسی تنوع ژنتیکی بر اساس مارکر ISSR برای ژنوتیپ‌های مورد مطالعه تطابق متوسطی با نتایج مطالعات بیوشیمیایی داشت.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The study of genetic variation for Lolium perenne using molecular and biochemical markers

نویسنده [English]

  • hooshmand safari 1

1 Faculty Member of Research Department of Forests and Rangelands, Kermanshah Agricultural and Natural Resources Research and Education Center, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Kermanshah, I.R. of Iran

چکیده [English]

Genetic variations were study for 12 accessions of Lolium perenne using molecular and biochemical markers. Soluble proteins were extracted for each population by Laemmli′s method and electrophoresis was done using polyacrilamid gel. The numbers of 12 bands were observed for genotypes, which the numbers of 6 bands were polymorph. The highest number of band belonging to Tyrone with 12 bands and the genotype of Green Gold had the lowest number of band (6 bands). The results of cluster analysis and principal coordinate analysis were fall the genotypes in three groups. Genetic variation for accessions were surveyed using the number of 12 ISSR primers, that the number of 10 primers can be scored. The ISSR primers can be produced the number of 62 bands, which the polymorphism was showed for the number of 47 bands. The average of bands was 6.2 for each primer. The primer of IS9 showed the highest number of band (11 bands) and IS15 showed the lowest number of band (3 bands). A desirable polymorphism between genotype was observed based on ISSR markers, which the primers of IS9, IS10, IS13 and IS16 were determined for genetic variation study in Lolium perenne as desirable primers. Genetic variation based on ISSR marker had a average conformity with the results of protein surveys.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Lolium perenne
  • Genetic variation
  • soluble proteins
  • ISSR marker

بررسی تنوع ژنتیکی برخی از ژنوتیپهای چچم دائمی (Lolium perenne) با استفاده از نشانگرهای مولکولی و بیوشیمیایی

هوشمند صفری1*، هومن شیروانی2 و لیدا فریدونی3

1 کرمانشاه، مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی، بخش تحقیقات جنگلها و مراتع

2 تهران، دانشگاه پیام نور، گروه کشاورزی

3 ایلام، دانشگاه ایلام، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح نباتات

تاریخ دریافت: 17/6/95                تاریخ پذیرش: 17/3/96

چکیده

تنوع ژنتیکی 12 ژنوتیپ از گونه مرتعی Lolium perenneبا استفاده از نشانگرهای مولکولی و بیوشیمیایی مورد بررسی قرار گرفت. برای هر ژنوتیپ پروتئینهای محلول برگ به روش Laemmli استخراج، و با ژل پلی آکریل آمید 12 درصد مورد بررسی قرار گرفت. تعداد 12 باند برای 12 ژنوتیپ مورد بررسی مشاهده شد، که از 12 باند حاصل تعداد 6 باند چندشکل بود و در 6 باند نیز چند شکلی مشاهده نشد. بیشترین تعداد باند مربوط به ژنوتیپ Tyrone با 12 باند و کمترین تعداد باند مربوط به ژنوتیپ Green Gold با 6 باند بود. نتایج تجزیه کلاستر و تجزیه به مختصات اصلی ژنوتیپهای مورد مطالعه را در سه دسته قرار داد. با استفاده از 12 آغازگر ISSR تنوع ژنتیکی ژنوتیپها مورد بررسی قرار گرفت که از این 12 آغازگر 10 عدد دارای باندهای قابل امتیاز ­دهی بودند. آغازگرهای ISSR در مجموع توانستند 62 باند تولید کنند که از این تعداد، 15 باند یک شکل، سایر باندها چند شکل بودند. میانگین تعداد باند تولید شده توسط هر آغازگر برای 12 ژنوتیپ برابر 2/6 بود. آغازگر IS9 بیشترین تعداد باند (تعداد 11 باند) و آغازگر IS15 کمترین تعداد باند (تعداد 3 باند) را نشان دادند. بر اساس مارکر ISSR چندشکلی مطلوبی در بین ژنوتیپها مشاهده شد و آغازگرهای IS9، IS10، IS13 و IS16 به عنوان آغازگرهای مناسب برای بررسیهای گونه چچم دائمی، تعیین شدند. بررسی تنوع ژنتیکی بر اساس مارکر ISSR برای ژنوتیپهای مورد مطالعه تطابق متوسطی با نتایج مطالعات بیوشیمیایی داشت.

واژه های کلیدی: چچم دائمی، تنوع ژنتیکی، پروتئینهای محلول، مارکر ISSR

* نویسنده مسئول، تلفن: 09183305823 ،  پست الکترونیکی: Hooshmandp@yahoo.com

مقدمه 

 

بشر از روزگاران گذشته برای دستیابی به غذا کوششی پی­گیر را آغاز کرده است. آنچه مسلم است این است که انسان، هزاره­ها و سده­های بسیاری را با خوردن گیاهان خودرو گذرانده است. در حال حاضر تأمین غذا برای ژنوتیپ 7 میلیارد نفری جهان کاری بس مشکل است. روند افزایش ژنوتیپ در جهان این مشکل را بیشتر نمایان می­سازد. از آنجا که غذای انسان عمدتاً از کشاورزی و دامپروری تأمین می­شود و محدود بودن منابع آب، زمین، دام و مرتع، محدودیت مواد غذایی را در پی دارد، تولیدات به دست آمده از این منابع پاسخگوی نیازهای ژنوتیپ روز افزون نخواهد بود. مرتع یکی از منابع مهمی است که در تولید این فرآورده­ها نقش ارزنده­ای دارد. نقش گیاهان علوفه­ای در تعلیف دام، از اهمیت غیرقابل انکاری برخوردار است، ازاین رو، بذل توجه به کشت محصولات علوفه­ای با شیوه علمی، اهمیت خاصی می­یابد (30). گراسها از مهم ترین گیاهان مرتعی هستند که به لحاظ.تولید علوفه، احداث چراگاهها، حفاظت و جلوگیری از فرسایش خاک اهمیت زیادی دارند (23). جنس چچم (Lolium) شامل گونه­هایی است که از منطقه مدیترانه منشأ گرفته­اند (32) و بومی اروپا، مناطق معتدل آسیا و شمال آفریقا هستند، اما تقریباً از سرتاسر جهان معرفی شده است (19 و 25). به دلیل کیفیت بالای این گیاه عمده استفاده مهم از آن برای تغذیه گاو­های شیری و همچنین برای تمامی دامهایی که نیاز­های غذایی بالایی دارند مناسب است. در هر حال Lolium perenneاز نظر اقتصادی، از گونه­های علوفه­ای بسیار مهم در ایران هستند (21). تولید ارقام گیاهان علوفه­ای که علاوه بر عملکرد خوب دارای مواد غذایی مناسب برای انواع متفاوت دامها هستند یکی از اهداف مهم به­نژادگران و تولید کنندگان محصولات علوفه­ای می باشد (15). بررسی و تحلیل تنوع ژنتیکی در ذخائر توارثی موجود از مهم ترین مراحل پروژه­های به­نژادی است که امکان گروه­بندی و توصیف دقیق نمونه­ها را فراهم آورده و به­نژاد­گرها را در تشخیص زیر مجموعه­ها و نمونه­هایی که امکان استفاده مؤثر آنها در برنامه­های اصلاحی آتی وجود دارد یاری می­کند (22). ارزیابی و تعیین میزان تنوع ژنتیکی یکی از شاخصهای مهم برای انتخاب والدین در برنامه­های اصلاحی است. یکی از روشهای اصلاح گیاهان علوفه­ای، گزینش همراه با آزمایش نسل است، موفقیت در گزینش، بستگی به تنوع با ایجاد نوترکیبی ژنتیکی و هتروزیس دارد. با افزایش فاصله ژنتیکی بین گونه­های گراسها احتمال هتروزیس در برنامه­های تلاقی افزایش می­یابد (14 و 26). نشانگر­های مولکولی ابزار­های بسیار مفید و قوی در ارزیابی روابط خویشاوندی ژنتیک، انتخاب گیاهان برتر و بررسی شباهت یا تفاوت بین نمونه­های مختلف می­باشد. نشانگر­های مولکولی وابسته به DNA تحت تأثیر شرایط محیط قرار نمی­گیرند و تعداد زیادی از بین نشانگر­ها را می­توان به راحتی در کل ژنوم جستجو نمود (8). توالیهای بین ریز ماهواره­ها نشانگر­های مولکولی نیمه تصادفی  هستند (7). تکثیر در این نشانگر در حضور یک آغازگر مکمل با توالیهای SSR یا ریز ماهواره هدف انجام می­پذیرد (31). در مطالعات متعددی با استفاده از مارکر­های مولکولی تنوع ژنتیکی گونه­های چچم مورد بررسی قرار گرفته و گزارش شده که استفاده از نشانگرهای مولکولی روش کارآمدی جهت تعیین تنوع ژنتیکی ارقام چچم بوده است (13، 27 و 28). پروتئینهای گیاهی به دو گروه اصلی تقسیم می­شوند: 1- پروتئینهای غیر ساختاری یا آنزیمها و 2- پروتئینهای ساختاری و پروتئینهای ذخیره­ای بذر که از هر دو گروه این پروتئینها، برای مطالعات تنوع ژنتیکی و تغییرات درون ژنوتیپها استفاده می­شود (16) .تکنیک الکتروفورتیک پروتئینها نشان دهنده بسیاری از شباهت­ها و اختلافات ژنتیکی میان گیاهان مورد مقایسه هستند بخصوص در مورد گیاهان زراعی که رقمهای آنها برای آنالیز با ارزش هستند (17). در بسیاری از مطالعات جهت بررسی تنوع ژنتیکی از پروتئینهای محلول در برگ استفاده گردید و گزارش شده که الگوی باندی پروتئین روش کارآمدی جهت بررسی تنوع ژنتیکی و تفکیک گونه­ها می باشد (11 و 24). هدف از تحقیق حاضر بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای گونه چچم دائمی با استفاده از مارکر مولکولی ISSR و پروتئینهای محلول در برگ می­باشد.

مواد و روشها

به منظور ارزیابی تنوع­ژنتیکی براساس خصوصیات بیوشیمیایی و مولکولی تعداد 12 ژنوتیپ از سرده Lolium perenne از تیره گرامینه با توجه به کلیه بذرهای موجود در بانک ژن منابع طبیعی مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع  کشور تهیه گردید. مشخصات مواد ژنتیکی مورد مطالعه، با ذکر اسم، کد بانک ژن، منشاء و کد ژنوتیپ در جدول 1 نشان داده شده است. لازم به ذکر است تحقیقات آزمایشگاهی در آزمایشگاه بیوتکنولوژی مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان کرمانشاه انجام شد.

 

جدول 1- لیست ژنوتیپهای چچم چند ساله تهیه شده از بانک ژنمنابع طبیعی مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور به همراه کد بانک ژن و منشاء

کد ژنوتیپ

منشاء

اسم ژنوتیپ

کد بانک ژن

کد ژنوتیپ

منشاء

اسم ژنوتیپ

کد بانک ژن

1G

هلند

Aubisque

1309

7G

ایرلند جنوبی

Grenisle

1303

2G

ایرلند جنوبی

Green Gold

1307

8G

ایرلند شمالی

Tyrone

1312

3G

ایرلند جنوبی

Magician

1308

9G

دانمارک

Napoleon

1311

4G

هلند

Carat

1305

10G

ایرلند جنوبی

Fontoon

1310

5G

ایرلند

Gilford

1313

11G

نیو زیلند

Yatsyn

1302

6G

ایرلند شمالی

Moy

1301

12G

ایرلند شمالی

Spelga

1306


تجزیه مولکولی: استخراج DNA به روشCTAB  تغییر یافته (10) برای ژنوتیپها انجام گرفت. کمیت و کیفیت DNA استخراج شده با استفاده از ژل آگارز 8/0 درصد و روش اسپکتروفتومتری مشخص شد. واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR) در حجم 20 میکرولیتر (50 نانوگرم DNA الگو، 2 میلی مولار MgCl2، 05/0 میلی مولار از هر dNTP، 2/0 میکرومول آغازگر، یک واحد آنزیم Taq DNA Polymerase و بافر واکنش به غلظت x1) انجام شد. چرخه حرارتی شامل یک مرحله واسرشت سازی اولیه در دمای ۹۵ درجه سانتی­گراد و به مدت ۵ دقیقه و 40 سیکل حرارتی بود که در هر چرخه نیز، زمان و دمای واسرشت سازی به ترتیب ۳۰ ثانیه و ۹۵ درجه سانتی­گراد، زمان اتصال آغازگر 45 ثانیه و دمای آن برای هر آغازگر متفاوت بود. همچنین زمان و دمای توسعه رشته نیز به ترتیب ۶۰ ثانیه و ۷۲ درجه سانتی­گراد بود. توسعه نهایی به مدت ۵ دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتی­گراد انجام شد. در این آزمایش از ژل آگارز 2 درصد با بافر TBE x1 استفاده گردید. به منظور بررسی محصولات واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR) ابتدا میزان ۵ میکرولیتر بافر نمونه گذاری به DNA های تکثیر شده اضافه و سپس میزان ۱۰ میکرو لیتر از هر نمونه به درون چاهکهای ایجاد شده در ژل آگارز بارگذاری و با ولتاژ ۱۰۰ و میزان ۵/۲ ساعت حرکت صورت گرفت و سپس ژل را جهت رنگ آمیزی در محلول اتیدیوم برماید (یک میکروگرم در میکرو­لیتر) به مدت ۴۵-۳۰ دقیقه قرار داده و از دستگاه Gel Document جهت مشاهده باندها استفاده شد.

نجزیه بیوشیمیایی: جهت عصاره­گیری 5/0 گرم از برگ هر ژنوتیپ  را که در داخل گلدان کشت شده بودند، بریده و پس از توزین با 5/1 میلی­لیتر محلول عصاره­گیری (تریس، 6/5 گرم و گلیسین، 96/2 گرم، 3/8=pH) در داخل هاون چینی مخلوط و کاملاً ساییده شد (18). پس از 10 دقیقه سایش عصاره حاصل را در لوله­های آزمایش ریخته و در یخچال در دمای 4 درجه سانتی­گراد به  مدت 12 ساعت نگهداری گردید. سپس عصاره­ها جهت صاف کردن با دور 14000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند. محلول صاف شده رویی توسط میکروپیپت جدا شده و با محلول بافر نمونه به نسبت 1 : ­1 مخلوط گردید. سرانجام محلول مخلوط شده به میکروتیوپهای درب­دار اپندروف منتقل و در دستگاه بن ماری در درجه حرارت 95 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه گرم شد. نمونه­ها تا زمان مصرف در فریزر در دمای 20- درجه سانتی­گراد نگهداری گردید (18). الکتروفورز به روش ژل پلی اکریل امید به صورت ژل پایینی (12 درصد) و ژل بالایی یا متراکم کننده (4 درصد) انجام شد (18). پس از  بررسی کمیت و کیفیت پروتئینها میزان 70 میکرولیتر پروتئین نمونه به داخل چاهک تزریق و سیستم الکتروفورز به منبع تغذیه وصل گردید. هنگامی که نمونه در داخل ژل فوقانی قرار داشت از ولتاژ ثابت 110 و بعد از ورود نمونه به داخل ژل جداکننده ولتاژ را به 130 و مدت 5 ساعت استفاده گردید. پس از انجام الکتروفورز به منظور مشاهده باندهای پروتئینی، رنگ آمیزی با استفاده از کوماسی بلو به مدت 1 ساعت انجام گرفت. در پایان جهت آشکار شدن باندهای پروتئینی از محلول رنگ بر در چند مرحله به مدت 1 ساعت استفاده گردید.

تجزیه و تحلیل داده­ها: به منظور استفاده از اطلاعات الکتروفورزی در آنالیزهای آماری براساس داشتن باند­ (کد یک) یا نداشتن باند (کد صفر) نتایج حاصل برای پروتئین و نشانگر ISSR کدبندی شدند. تجزیه خوشه­ای­، ماتریس تشابه بر مبنای ضریب دایس و تجزیه به مختصات اصلی (PCo) داده­ها با استفاده از نرم افزارDarwin ، و تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) با استفاده از نرم افزار  GenAlEx 6.2 بر اساس ضرایب دایس انجام گرفت. محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC) برای نشانگر ISSR از طریق فرمول   (29) محاسبه گردید. 

 

kD175

kD130kD95

kD70

kD62

kD51

kD42

 

kD29

 

kD22

 

 

kD14

 

نتایج و بحث

نتایج حاصل از ارزیابی تنوع بر اساس الگوی باندی پروتئین: در شکل 1 باندهای حاصل از الکتروفورز ژل پروتئینهای استخراج شده از برگ ژنوتیپهای مورد بررسی ارائه شد. همچنان که ملاحظه می­گردد، اگر چه باندهای پروتئینی مشترک زیادی در داخل ژنوتیپهای مورد بررسی وجود داشت، اما در بعضی موارد نیز ژنوتیپها فاقد بعضی از باندها بودند که این موضوع می­تواند مربوط به عدم تولید پروتئین مورد نظر در  مرحله استخراج پروتئین باشد. در مجموع تعداد 12 باند برای 12 ژنوتیپ مورد بررسی مشاهده شد که بیشترین تعداد باند مربوط به ژنوتیپ  Tyrone(8G) با 12 باند و کمترین تعداد باند مربوط به ژنوتیپ Green Gold (2G) با 6 باند بود. بنابراین به خوبی مشخص است که تنوع بالایی برای باند­های پروتئینی در بین ژنوتیپها وجود نداشت. همچنین از 12 باند حاصل تعداد 6 باند چند شکل بود و در 6 باند نیز چند شکلی مشاهده نشد. علاوه بر این باند­های پروتئینی نه تنها از نظر محل قرار گرفتن روی ژل و وزن مولکولی، بلکه از لحاظ تراکم و شدت نیز با یکدیگر اختلاف نشان دادند.

 

 

شکل 1- تصویر الکتروفورز پروتین­های محلول در برگ ژنوتیپهای چچم چند ساله مورد مطالعه

نشان دهنده عدم وجود باند در ژل می­باشد


ماتریس تشابه ژنوتیپها براساس پروتئین برگ: ماتریس تشابه بر مبنای ضریب جاکارد برای باند­های حاصل از الکتروفورز پروتئینهای محلول در برگ ژنوتیپها محاسبه شد و در جدول 2 ارائه شده است. میانگین تشابه بین ژنوتیپها برابر 863/0 بود که بالا بودن تشابه بیانگر شباهت ژنتیکی بین ژنوتیپها برای پروتئینهای محلول در برگ بود و ضریب تشابه از 000/1 تا 667/0 متغیر بود. بیشترین تشابه بین دو ژنوتیپ Aubisque (1G) و Grenisle (7G) و همچنین بین سه ژنوتیپ Magician (3G)، Carat (4G) و Yatsyn (11G) مشاهده گردید، با ضریب تشابه 1 و کمترین تشابه بین ژنوتیپهای Moy (6G) و Napoleon (9G) با ضریب تشابه 737/0 و بین ژنوتیپهای Gilford (5G) و Green Gold (2G) با ضریب تشابه 706/0 و بین ژنوتیپ Tyrone (8G) با ژنوتیپهای Aubisque (1G)، Green Gold (2G) و Grenisle (7G) به ترتیب با ضرایب تشابه 737/0، 667/0 و 737/0 بود.

 

جدول 2- ماتریس تشابه ژنوتیپهای مورد بررسی برای پروتئینهای برگ بر اساس ضریب جاکارد

 

 ژنوتیپ 

Aubisque

Green Gold

Magician

Carat

Gilford

Moy

Grenisle

Tyrone

Napoleon

Fontoon

Yatsyn

Spelga

Aubisque

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Green Gold

923/0

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Magician

933/0

857/0

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Carat

933/0

857/0

00/1

1

 

 

 

 

 

 

 

 

Gilford

778/0

706/0

842/0

842/0

1

 

 

 

 

 

 

 

Moy

857/0

800/0

941/0

941/0

900/0

1

 

 

 

 

 

 

Grenisle

00/1

923/0

933/0

933/0

788/0

857/0

1

 

 

 

 

 

Tyrone

737/0

667/0

800/0

800/0

957/0

857/0

737/0

1

 

 

 

 

Napoleon

824/0

750/0

778/0

778/0

857/0

737/0

824/0

909/0

1

 

 

 

Fontoon

857/0

800/0

941/0

941/0

900/0

889/0

857/0

857/0

842/0

1

 

 

Yatsyn

933/0

857/0

00/1

00/1

842/0

941/0

933/0

800/0

778/0

941/0

1

 

Spelga

857/0

800/0

824/0

824/0

900/0

889/0

857/0

857/0

842/0

889/0

823/0

1


تجزیه خوشه­ای ژنوتیپها بر اساس پروتئین برگ: تجزیه خوشه­ای برای ژنوتیپها به منظور گروه­بندی آنها بر اساس تنوع باندهای پروتئینی بر اساس ضریب جاکارد و با روش UPGMA صورت گرفت (شکل 2) که ژنوتیپهای مورد مطالعه به 3 دسته تقسیم شدند، به طوری که گروه اول شامل ژنوتیپهای Green Gold (2G)، Grenisle (7G) و Aubisque (1G) بود. ژنوتیپهای Carat (4G)، Magician (3G)، Yatsyn (11G)، Moy (6G) و Fontoon (10G) در گروه دوم قرار داشتند و ژنوتیپهای Napoleon (9G)، Spelga (12G)، Tyrone (8G) و Gilford (5G) در گروه سوم قرار داشتند. همچنان که ملاحظه می­گردد، گروه­بندی حاصل از تجزیه خوشه­ای بر اساس باندهای پروتئینی توانست ژنوتیپها را در سه گروه متمایز قرار دهد و آنها را از هم تفکیک نماید.

تجزیه به مختصات اصلی بر اساس پروتئینهای برگ: تجزیه به مختصات اصلی برای ژنوتیپها بر اساس پروتئینهای برگ انجام شد و نمودار پراکنش ژنوتیپها بر اساس دو مختصات اول و دوم در شکل 3 ارائه شده است، همچنانکه ملاحظه می­گردد گروه­بندی حاصل از مختصات اول و دوم با گروه­بندی ژنوتیپها بر اساس تجزیه خوشه­ای (شکل 2) کاملاً مطابقت داشت و ژنوتیپهای Green Gold (2G)، Grenisle (7G) و Aubisque (1G) در یک گروه  قرار گرفتند. ژنوتیپهای Carat (4G)، Magician (3G)، Yatsyn (11G)، Moy (6G) و Fontoon (10G) در گروه دوم قرار داشتند و ژنوتیپهای Napoleon (9G)، Spelga (12G)، Tyrone (8G) و Gilford (5G) در گروه سوم قرار داشتند. بنابراین ژنوتیپهای هر گروه دارای بیشترین تشابه بر اساس پروتئینهای محلول بودند. از طرف دیگر ژنوتیپهای Green Gold (2G)، Grenisle (7G) با ژنوتیپهای Tyrone (8G) و Gilford (5G) بیشترین فاصله ژنتیکی بر اساس شکل 3 داشتند و ژنوتیپهای Carat (4G)، Magician (3G)، Yatsyn (11G)، Moy (6G) و Fontoon (10G) بیشترین فاصله با ژنوتیپهای Napoleon (9G) و Spelga (12G) داشتند.

 

 

شکل 2- دندروگرام حاصل از بررسی الکتروفورز پروتئینهای برگ در ژنوتیپهای مطالعه شده

 

شکل 3- نمودار پراکنش ژنوتیپهای مورد بررسی براساس دو محور مختصات اصلی اول و دوم


نتایج حاصل از تجزیه ISSR: تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای مورد مطالعه با استفاده از 12 آغازگر ISSR مورد بررسی قرار گرفت که از این 12 آغازگر 10 عدد دارای باند­های قابل امتیاز ­دهی بودند. آغازگر­های ISSR در مجموع توانستند 62 باند تولید کنند که از این تعداد، 15 باند یک شکل مشاهده شد و سایر باندها چند شکل بودند. میانگین تعداد باند تولید شده توسط هر آغازگر برای 12 ژنوتیپ برابر 2/6 بود. آغازگر IS9 بیشترین تعداد باند (تعداد 11 باند) و آغازگر IS15 کمترین تعداد باند (تعداد 3 باند) را نشان دادند. ژنوتیپ Spelga (12G) بیشترین باند (49 باند) و ژنوتیپ Fontoon (10G) کمترین باند (34 باند) را در بین ژنوتیپهای مورد بررسی داشتند. شکل 4 الگوی باندی 12 ژنوتیپ مورد بررسی به ترتیب با استفاده از آغازگر­های IS5 را نشان می­دهد. نتایج به دست آمده برای آغازگر­های استفاده شده در جدول 3 ارائه شده است.

 

جدول 3- درصد چند شکلی، تعداد کل باند و محتوای اطلاعات چند شکلی در آغازگرهاهای ISSR

نام آغازگر

توالی آغازگر (-3' 5')

تعداد مکان­های تکثیر شده

تعداد مکا­ن­های چند شکل

درصد چند شکلی

محتوی اطلاعات چند شکلی

IS3

GAGAGAGAGAGAGAGAYC

4

4

100

25/0

IS5

AGAGAGAGAGAGAGAGC'

11

8

73/72

30/0

IS9

CTCTCTCTCTCTCTCTG

4

4

100

36/0

IS10

GAGAGAGAGAGAGAGA Rc

8

8

100

33/0

IS11

ACACACACACACACACC

7

4

14/57

34/0

IS12

TGTGTGTGTGTGTGTGG

5

3

60

45/0

IS13

 AGAGAGAGAGAGAGAGYT

3

3

100

32/0

IS14

 GACAGACAGACAGACA

8

5

50/62

28/0

IS15

 GGATGGATGGATGGAT

8

4

50

33/0

IS16

DBDACACACACACACACA

4

4

100

34/0

میانگین

20/6

70/4

24/80

33/0

Y=(C,T), V=(A,C,G), D=(A,G,T), B=(C,G,T)

 

شکل 4- تصویر ژل الکتروفورزی ژنوتیپهای چچم چند ساله مورد بررسی برای آغازگر IS5


میانگین درصد چند شکل در بین ژنوتیپهای مورد بررسی برابر 24/80 درصد بود که کمترین درصد چند شکلی را آغازگر IS15 (50 درصد) و بیشترین درصد چند شکلی به آغازگر­های IS3، IS9، IS10، IS13 و  IS16اختصاص داشت، که میزان چند شکلی در این آغازگر­ها برابر 100 درصد بود.. میانگین PIC در آغازگر­های مورد بررسی برابر 335/0 بود که بیشترین میزان PIC مربوط به آغازگر IS12 بود که این آغازگر بهتر از سایر آغازگر­ها بر اساس شاخص PIC توانست فاصله ژنتیکی ژنوتیپها را مشخص کنند. آغازگر IS3 و IS14 با کمترین میزان PIC توانایی خوبی در جداسازی ژنوتیپها نداشتند. در مجموع پیشنهاد می­گردد از آغازگرهای IS9، IS10، IS13 و IS16 که شاخص PIC درصد چند چندشکلی بالایی را نشان دادند، برای آنالیز مجموعه ژرم پلاسم دیگر ژنوتیپهای لولیوم در تحقیقات بعدی استفاده کرد. آغازگر­های IS5، IS11، IS14 و IS15 با کمترین میزان PIC و درصد چند شکلی توانایی خوبی در جداسازی ژنوتیپها نداشتند. دیگر آغازگر­ها برای یکی از پارامترهای PIC یا درصد چندشکلی برتری نشان دادند. 

ماتریس تشابه: تشابه ژنتیکی ژنوتیپهای مورد بررسی با استفاده از ضریب تشابه دایس از 709/0 تا 873/0 متغیر بود (جدول 4)، میانگین تشابه بین ژنوتیپها برابر 792/0 بود که بالا بودن تشابه ژنتیکی یاد شده نشان دهنده تنوع ژنتیکی پایین در بین ژنوتیپهای چچم بر اساس آغازگر­های مورد بررسی می­باشد. بیشترین تشابه را ژنوتیپهای Aubisque (1G) با Grenisle (7G) و کمترین تشابه را ژنوتیپ Yatsyn (11G) با Grenisle (7G) داشتند.

 

جدول 4- ماتریس تشابه ژنوتیپها برای پرایمرهای ISSR استفاده شده بر اساس ضریب دایس

ژنوتیپ

Aubisque

Green Gold

Magician

Carat

Gilford

Moy

Grenisle

Tyrone

Napoleon

Fontoon

Yatsyn

Spelga

Aubisque

1

                     

Green Gold

822/0

1

                   

Magician

795/0

787/0

1

                 

Carat

714/0

825/0

782/0

1

               

Gilford

873/0

805/0

818/0

785/0

1

             

Moy

778/0

732/0

809/0

775/0

840/0

1

           

Grenisle

836/0

800/0

771/0

767/0

800/0

747/0

1

         

Tyrone

776/0

831/0

738/0

800/0

831/0

753/0

817/0

1

       

Napoleon

827/0

814/0

839/0

786/0

860/0

814/0

795/0

815/0

1

     

Fontoon

787/0

789/0

747/0

746/0

829/0

743/0

857/0

862/0

865/0

1

   

Yatsyn

747/0

736/0

766/0

800/0

767/0

782/0

709/0

756/0

791/0

784/0

1

 

Spelga

744/0

800/0

804/0

750/0

778/0

778/0

786/0

800/0

809/0

763/0

821/0

1


تجزیه خوشه­ای: دندروگرام حاصل از تجزیه خوشه­ای به روش UPGMA بر اساس ضریب تشابه دایس برای ژنوتیپها در شکل 5 ارائه شده است. همچنان که ملاحظه می­گردد ژنوتیپها در 3 گروه قرار گرفتند. گروه اول شامل ژنوتیپهای Yatsyn (11G)، Spelga (12G)، Magician (3G) و Moy (6G) بود، متوسط ضریب تشابه برای ژنوتیپهای این گروه 793/0 بود. ژنوتیپهای Carat (4G)، Green Gold (2G) و Tyrone (8G) گروه دوم بود، که متوسط ضریب تشابه برای این سه ژنوتیپ 819/0 به دست آمد. گروه سوم شامل پنج ژنوتیپ Aubisque (1G)، Gilford (5G)، Grenisle (7G)، Napoleon (9G) و Fontoon (10G) بود. برای این گروه متوسط ضریب تشابه این گروه 833/0 بود. بنابراین گروه چهارم دارای بیشترین تشابه بودند و ژنوتیپهای گروه اول دارای کمترین تشابه بودند. ماتریس تشابه برای گروههای حاصل از تجزیه خوشه­ای (جدول 5) نشان داد که بیشترین تشابه در بین ژنوتیپهای گروه 2 و 3 بود. کمترین تشابه در بین ژنوتیپهای گروه 2 و 1 وجود داشت.

جدول 5- شباهت گروههای حاصل از تجزیه خوشه­ای

گروه

گروه اول

گروه دوم

گروه سوم

گروه اول

000/1

 

 

گروه دوم

767/0

000/1

 

گروه سوم

778/0

795/0

000/1

 

 

 

شکل 5- دندروگرام حاصل از داده­های نشانگر ISSR برای ژنوتیپهای مورد مطالعه


تجزیه به مختصات اصلی (PCo): بر اساس داده­های حاصل از آغازگر­های مورد بررسی تجزیه به مختصات اصلی برای ژنوتیپها انجام شد، که نتایج نشان داد محور مختصات اول و دوم به ترتیب 51/24 و 27/19 درصد از واریانس موجود را توضیح دادند و در مجموع 78/43 درصد از واریانس با این دو محور بیان گردید. بر اساس مختصات اول و دوم دیاگرام پراکنشی ژنوتیپها رسم گردید (شکل 6)، که این دیاگرام با نتایج تجزیه خوشه­ای تا حدودی مطابقت داشت و ژنوتیپها به چهار گروه تقسیم شدند. با توجه به نمودار ژنوتیپهای Magician (3G) و Moy (6G) با بیشترین تشابه در یک گروه قرار داشتند و دارای بیشترین فاصله را با ژنوتیپهای Green Gold (2G)، Tyrone (8G)، Grenisle (7G) و Fontoon (10G) که در یک گروه قرار داشتند، بودند. همچنین ژنوتیپهای 1G، 5G و 9G (با تشابه بالا در یک گروه قرار داشتند) با ژنوتیپهای Aubisque (1G)، Gilford (5G) و Napoleon (9G) (با تشابه بالا در یک گروه قرار داشتند) بیشترین فاصله ژنتیکی بر اساس بای­پلات نشان دادند.

 

 

شکل 6- بای پلات ژنوتیپها برای نشانگر ISSR بر اساس محور مختصات اصلی اول و دوم


تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA): تجزیه واریانس مولکولی بر اساس گروه­بندی تجزیه خوشه­ای انجام شد (جدول 6)، که ژنوتیپها در داخل 3 گروه قرار گرفتند بر اساس آماره PhiPT در بین ژنوتیپها در سطح 5 درصد اختلاف معنی­دار وجود داشت به عبارت دیگر گروه­بندی به صورت صحیح انجام گرفته است. نتایج به دست آمده نشان داد که در میان کلاسترها تنوع بیشتر از بین گروهها می­باشد. بر این اساس تنوع در درون کلاسترها برابر 87 درصد و در بین کلاسترها تنوع برابر 13 درصد مشاهده گردید.

 

جدول 6- تجزیه واریانس مولکولی بر اساس نشانگر ISSR

منابع تغییرات

درجه آزادی

مجموع مربعات

میانگین مربعات

واریانس برآورد شده

درصد از واریانس

PhiPT

بین گروه

2

63/27

82/13

323/1

13%

133/0*

درون گروه

9

70/77

63/8

633/8

87%

 

کل

11

33/105

 

957/9

100%

 

*  اختلاف در سطح 5% معنی­دار


بحث و نتیجه­گیری

با توجه به نتایج به دست آمده ملاحظه شد که شباهت ژنوتیپها بر اساس پروتئینهای برگ بالا بود و بنابراین می­توان بیان داشت که تنوع ژنتیکی بالایی بر اساس پروتئینهای برگ در بین ژنوتیپها مشاهده نشد. جعفری و همکاران (1392) در بررسی ارتباط بین تنوع ژنتیکی و توزیع جغرافیایی میان 11 جمعیت وحشی
Dactylis glomerata توسط پروتئینهای کل گزارش کردند که همبستگی میان تنوع ژنتیکی و تنوع جغرافیایی بسیار کم بوده و از لحاظ آماری معنی دار نبوده است (1). Aiken  و همکاران (1998) با استفاده از پروتئینهای ذخیره­ای بذر گونه­های جنس فستوکا و لولیوم را طبقه­بندی کردند و بیان داشتند که پروفایل باند­های پروتئین با مناطق جمع­آوری گونه­ها تطابق نداشت (4). اما در هر حال گروه­بندی بر اساس پروتئینهای برگ تا حدودی دسته­های متمایزی از ژنوتیپها را نشان داد که باتوجه به این مسئله می­توان بیان داشت استفاده از بررسی پروتئینهای برگ در بررسی تنوع درون گونه­ای تا حدودی مؤثر است. Dinelli و Lucchese (1999) با استفاده ازSDS-PAGE  تنوع ژنتیکی بین و درون گونه­ای در جنس لولیوم را مورد بررسی قرار دادند و بیان داشتند که استفاده از پروتئینها می­تواند در جهت ارزیابی تنوع مفید واقع شود (9). Ahmed (1994) از تکنیک الکتروفورز ژل پلی‏آکریل‏آمید برای بررسی 7 گونه از جنس یونجه استفاده کرد و نتایج حاصل را با استفاده از تجزیه خوشه‏ای تحلیل نمود. او نشان داد که الکتروفورز روشی مؤثر برای ارزیابی روابط فنوتیپی در بین رده‏های انتخاب شده است و این تکنیک به طور وسیعی در مطالعات رده‏بندی جنسها و نیز ارزیابی تنوع بین گونه‏ها و درون گونه‏ها به کار برده می‏شود (3).

بر اساس مطالعات مولکولی چندشکلی مطلوبی بر اساس مارکر ISSR در بین ژنوتیپها مشاهده شد. عبدالهی و عزیزی (1393) نیز در مطالعه جمعیتهای مختلف یونجه چند شکلی بالای نشانگر مولکولی ISSR را گزارش نمودند (2). مناسب­ترین آغازگر­ها برای بررسیهای گونه چچم دائمی، آغازگر­های IS9، IS10، IS13 و IS16 بر اساس شاخص PIC تعیین شد، محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC) از صفر تا نیم در نشانگرهای غالب متغیر است و هرچه این عدد بزرگتر باشد بیانگر دلالت بر چندشکلی زیاد در یک جایگاه نشانگری دارد که در تفکیک و تمایز افراد نقش به سزایی دارد. Ghariani و همکاران (2003) به بررسی تنوع ژنتیکی 18 جمعیت Lolium perenne تونسیبا استفاده از نشانگر ISSR پرداختند. این نشانگر برای تخمین فاصله ژنتیکی میان ارقام در نظر گرفته شد داده­های حاصل میزان بالای تنوع ژنتیکی را Lolium perenneنشان داد (12). نتایج تنوع ژنتیکی بر اساس مارکر ISSR برای ژنوتیپهای مورد مطالعه تطابق متوسطی با نتایج مطالعات بیوشیمیایی داشت. بدین شرح که ژنوتیپهای Yatsyn (11G)، Magician (3G) و Moy (6G) با توجه به تجزیه بیوشیمیایی و تجزیه ISSR در یک گروه قرار داشتند، همچنین ژنوتیپهای Aubisque (1G) و Grenisle (7G) بر اساس هر دو روش شباهت ژنتیکی داشتند و همچنین ژنوتیپهای Gilford (5G) و Napoleon (9G) نیز بر اساس هر دو روش در یک گروه بودند. Hu و همکاران (2011) به بررسی تنوع ژنتیکی  Lolium perenneبا استفاده از نشانگر ISSR برای مقایسه تنوع ژنتیکی مابین واریته­های تجاری و ژرم پلاسم طبیعی که از اروپا، آفریقا، آسیا، و آمریکای شمالی جمع­آوری شده بودند پرداختند. یک تغییر ژنتیکی نسبتاً بالا در کل مجموعه مشخص شد. نتایج نشان­دهنده تنوع ژنتیکی پایین­تر در واریته­های تجاری نسبت به ژرم پلاسم طبیعی بود. بر اساس ضریب تشابه جاکارد، 12 گروه با یک نقطه برش متمایز شدند (13). بر اساس تجزیه خوشه­ای ژنوتیپها در سه گروه قرار گرفتند، که این نتیجه با دیاگرام حاصل از پراکنش ژنوتیپها بر اساس مقدار مختصات اول و دوم حاصل از تجزیه به مختصات اصلی تا حدودی مطابقت نشان داد، علت اینکه تطابق بالا مشاهده نشد این بود که دو مختصات اول تنها 78/43 درصد از تنوع موجود را توجیه نمود. در مجموع بر اساس آغازگر­های مورد استفاده و با توجه به تجزیه کلاستر و تجزیه به مختصات اصلی ژنوتیپهای Green Gold (2G) و Tyrone (8G) دارای بیشترین فاصله ژنتیکی با ژنوتیپهای Magician (3G) و Moy (6G) بودند. Pivoriene و همکاران (2008) به بررسی تنوع ژنتیکی 16 واریته  Lolium perenne و دو لاین اصلاح شده Festuloliumبا استفاده از نشانگر ISSR پرداختند. تشابه ژنتیکی در ماتریس محاسبه شده بین واریته­های L. perenneوFestuloliumو لاینهای اصلاح شده متغیر بودند. نتایج سطح قابل توجه تنوع ژنتیکی بین واریته­ها و لاینهای اصلاح شده توسط پلی مورفیسم ISSR ناشی از تغییرات نمونه­های DNA را نشان داد (27). Majidi و Mirlohi (2010) به بررسی تشابه ژنتیکی 42 جمعیت از 8 گونه ایرانی Festuca، Lolium، BromusوAgropyron با استفاده از نشانگرهایAFLP  پرداختند. بیان داشتند که ضرایب تشابه ژنتیکی جاکارد میان جمعیتها متغیر بود که نشان دهنده سطوح بالای تنوع ژنتیکی بین و داخل گونه­ای است. آنالیز خوشه­ای و تجزیه به مختصات اصلی به طور واضح تفاوت میان ذخایر ژنتیکی را نشان داد (20). از کاربرد­های تجزیه واریانس مولکولی می­توان در تعیین تفاوت ژنتیکی بین ژنوتیپها و تعیین حد مطلوب خوشه در تجزیه خوشه­ای اشاره کرد، به این صورت که در هر گروه در نقطه برش دندروگرام به عنوان یک ژنوتیپ و ژنوتیپهای درون آن به عنوان افراد ژنوتیپ در نظر گرفته می­شود و برای هر نقطه برش یک تجزیه واریانس انجام می گیرد. نقطه­ای که بیشترین تمایز بین گروهها به وجود می آید، به عنوان نقطه مناسب برش دندروگرام انتخاب خواهد شد. بر اساس تجزیه واریانس مولکولی گروههای حاصل از تجزیه کلاستر مشاهده شد که واریانس بین گروهها در سطح 5 درصد معنی­دار بود، اما بر اساس واریانس برآورد شده سهم واریانس بین گروهها تنها 13 درصد از تنوع کل بود.Bolaric  و همکاران (b2005) به بررسی تنوع ژنتیکی 22 رقم Lolium perenne و توصیف رابطه میان ارقام در شرایط اصلاح از راه دور با استفاده از نشانگرهای  RAPDپرداختند. تجزیه و تحلیل واریانس مولکولی (AMOVA) نشان داد تنوع زیادی در درون (66 درصد) و بین ارقام (34 درصد) وجود داشت (6). Bolaric و همکاران (a2005) به ارزیابی خصوصیت مولکولی از طریق تنوع ژنتیکی در اکوتیپهای لهستانی  Lolium perenne، و مقایسه رابطه این گروه و اکوتیپهای آلمانی و واریته­های اروپایی پرداختند. در یک آنالیز مشترک با 19 اکوتیپ لهستانی، 22 اکوتیپ آلمانی و 22 واریته اروپایی 172 نشانگر پلی­مورفیک  RAPD می­توان دید. فاصله ژنتیکی میان اکوتیپهای لهستانی متغییر بود. آنالیز واریانس مولکولی (AMOVA) تغییرات بیشتری داخل جمعیتها نسبت به بین جمعیتها نشان داد. اکوتیپهای لهستانی شامل بالاترین تغییرات داخل جمعیتی بودند (5). Vieira و همکاران (2004) به بررسی تعیین خصوصیت تنوع ژنتیکی و ساختار 4 جمعیت Lolium multiflorumبا استفاده از نشانگر RAPD پرداختند. مقدار شاخص تنوع ژنتیکی کلی به دست آمده بالا بود، که نشان­دهنده وجود تنوع ژنتیکی وسیع در 4 جمعیت بود. آنالیز ساختار ژنتیکی نشان داد که تنوع داخل جمعیتی بیشتر از تنوع بین جمعیتی بود (33).

1- جعفری، ع ا.، صالحی شانجانی ، پ.، کوهی، ل.، بخشی خانیکی، غ ر.، 1392. بررسی ارتباط بین تنوع ژنتیکی و توزیع جغرافیایی میان 11 جمعیت وحشی Dactylis glomerata توسط پروتئینهای کل. مجله پژوهش­های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران). 26 (3): 278-288.

2- عبدالهی مندوکانی، ب.، عزیزی، ح.، 1393. شناسایی نشانگرهای ISSR پیوسته با صفات مورفولوژیک در جمعیت­های یونجه زراعی (Medicago sativa L.). مجله پژوهش­های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران). 27 (2): 260-268.

 

3- Ahmed, M F. (1994). A study of the cyto-taxonomy for conservation of genetic resources of forage legumes (Medicago species) in Omayed Biosphere Reserve. Scientific Report, University of Alexandria, Egypt. Blackstock, W.P., and M.P. Weir, 1999. Proteomies: quantitative and physical mapping of cellular protein. Trends in Biotechnology, 17: 121-127. 

4- Aiken, S G., Gardiner, S E., Bassett, CM. H., Wilson, B L., Consau, L. L. (1998). Implications from SDS-PAGE analyses of seed proteins in the classification of taxa of Festuca and Lolium (Poaceae). Biochemical Systematics and Ecology, 26(5): 511-533.

5- Bolaric, S., Barth, S., Melchinger, A E., Posselt., U K. (2005a). Genetic diversity in European perennial ryegrass cultivar investigated with RAPD markers. Plant Boching, 124: 161-166.

6- Bolaric, S., Barth, S., Melchinger, A E., Posselt1, U K. (2005b). Molecular characterization of genetic diversity in European germplasm or perennial ryegrass. Euphytic, 146: 39-44.

7- Brantestam, A. K, Botheme, R. V, Dayteg, Ch.,  Rashall, I., Tuvesson, S., Weibull, J. (2004). Inter simple sequence repeat analysis of diversity and relationships in cultivated burly of Nordic and Baltic origin. Hereditas, 141: 186-192.

8- Chawla, H S. (2000). Introduction to Plant Biotechnology. Science Publishers Inc. USA.

9- Dinelli, G., Lucchese, C. (1999). Comparison between capillary and polyacrylamide gel electrophoresis for identification of Lolium species and cultivars. Electrophoresis, 20(12): 2524-32.

10- Doyle, j j, Doyle, j l. (1987). A rapd DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem bull, 19: 11-15.

11- Fareghi, S. H., Farshadfar, M., Farshadfar, E. (2007). Study of chemical composition and nutrition value of perennial Lucerne (Medicago sativa L.) and genetic diversity based on SDS-PAGE markers. Iranian Journal of Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research, 15: 196-210. (In Farsi with English abstract).

12- Ghariani, S., Trifi-Farah, N., Chakroun, M., Marghali, S., Marrakchi, M. (2003). Genetic diversity in Tunisian Perennial ryegrass revealed by ISSR markers. Genetic Resources and Crop Evolution, 50(8): 809-815.

13- Hu, T., Li, H., Li, D., Sun, j., Fu, j. (2011). Assessing genetic diversity of perennial ryegrass (Lolium perenne L.) from four continents by intersimple sequence repeat (ISSR) markers. African Journal of Biotechnology, 10(83): 19365-19374.

14- Humphreys, M O. (1991). A genetic approach to the multivariate differentiation of perennial ryegrass (Lolium perenne L.) populations. Heredity, 66: 437-443.

15- Jung, G A., kocker, R E., Groos, C F., Berg, C C., Benntt, O L. (1976). Non-structural carbohydrates in the spring herbage of temperate grasses. Crop Science, 16: 353-359.

16- Krishnan, H B., Sleper, D A. (1997). Identification of tall fescue cultivars by sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel electrophoresis of seed protein. Crop Science, 37:  215-219.

17- Ladizinsky, G. (1983). Study of evolutionary problems by means of seed protein electrophoresis. "In seed proteins, Biocheistry, Genetics, Nutritive value". (Gottschalk, W., Muller, H. P., eds). P 481-489.

18- Laemmli, U K. (1970). Cleavage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685.

19- Loos, B P. (1993). Morphological variation in Lolium (Poaceae) as a measure of speciesrelationships. Plant Systematic and Evolution, 188: 87-99.

20- Majidi, M M., Mirlohi, A. (2010). Genetic similarities among Iranian populations of Festuca, Lolium, Bromus and Agropyron using amplified fragments length polymorphism (AFLP) markers. Iranian Journal of Biotechnology, 8(1): 16-23. (In Farsi with English abstract).

21- Mirjalili, S A., Bennett, S., Poorazizi, E. (2008). A phenetic analysis on the genus Lolium (Poaceae) in Iran. Plant Systematic and Evolution, 274: 203-208. (In Farsi with English abstract).

22- Mohammadi, S A., Prasanna, B M. (2003). Analysis of genetic diversity in crop plant: Salient statistical tools and considerations. Crop Science, 43: 1235-1248.

23- Moradi, P., Jafari, A A. (2006). Comparative study of forage quality in 26 Dactylis glomerata genotypes in order to produce synthetic varieties in Zanjan provienc. Iranian Journal of Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research, 14: 175-180 (In Farsi with English abstract).

24- Mukhlesur, R. M. D., Hirata, Y. (2004). Genetic diversity in Brassicaspecies using SDS-PAGE analysis. Journal of Biological Sciences, 4: 234-238.

25- Parsa, A. (1950). Flora de 1'Iran. Vol. V. Publication Du Ministere De 1'Education. Museum D'Historie Naturele De Tehran.

26- Peters, J P., Martinelli, J A. (1989). Hierarchical cluster analysis as a tool manages variation in germplasm collections. Theoretical and Applied Genetics, 78: 42-48.

27- Pivoriene, O., Pasakinskiene, I. (2008). Genetic diversity assessment in perennial ryegrass and Festulolium by ISSR fingerprinting. Agriculture, 95(2): 125–133.

28- Pivoriene, O., Pašakinskiene, I., Brazauskas, G., Lideikyte. L., Jensen, L. B., Lübberstedt, T. (2008). Inter-simple sequence repeats (ISSR) loci mapping in the genome of perennial ryegrass. Biologija. 54 (1): 17–21

29- Powell, W., Morgante, M., Andre, C., Hanafey, M., Vogel, J., Tingey, S., Rafalski, A .(1996). The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Molecular Breeding, 2: 225-238.

30- Rastegar, M E. (2007). Cultivation of forage crops, Nopardazan Publications, Tehran. (In Farsi with English abstract).

31- Surve-Iyer, R S., Adams, G C., Lezzon, A F., Jones, A L. (1995). Isozyme detection and variation in Ieucostoma species from prunus and malus. Mycologia, 87: 471-482.

32- Tsvelev, N N. (1989). The system of grasses and their evolution. Botanical Review, 55(3): 141-204.

33- Vieira, E A., Castro, C M., Oliveira, A Cd., Irajá, F., Carvalho, Fd., Zimmer, P D., Martins, L F. (2004). Genetic structure of annual ryegrass (Lolium multiflorum) populations estimated by RAPD. Scientia Agricola, 61(4): 407-413.