نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 عضو هیات علمی بخش تحقیقات جنگلها و مراتع، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی استان کرمانشاه، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرمانشاه، ایران
2 مدرس دانشگاه پیام نور
3 کارشناس ارشد دانشگاه ایلام
چکیده
تنوعژنتیکی 12 ژنوتیپ از گونه مرتعی Lolium perenne با استفاده از نشانگرهای مولکولی و بیوشیمیایی مورد بررسی قرار گرفت. برای هر ژنوتیپ پروتئینهای محلول برگ به روش Laemmli استخراج، و با ژل پلی آکریل آمید 12% مورد بررسی قرار گرفتند. تعداد 12 باند برای 12 ژنوتیپ مورد بررسی مشاهده شد، که از 12 باند حاصل تعداد 6 باند چند شکل بود و در 6 باند نیز چند شکلی مشاهده نشد. بیشترین تعداد باند مربوط به ژنوتیپ Tyrone با 12 باند و کمترین تعداد باند مربوط به ژنوتیپ Green Gold با 6 باند بود. نتایج تجزیه کلاستر و تجزیه به مختصات اصلی ژنوتیپهای مورد مطالعه را در سه دسته قرار داد. با استفاده از 12 آغازگر ISSR تنوع ژنتیکی ژنوتیپها مورد بررسی قرار گرفت که از این 12 آغازگر 10 عدد دارای باندهای قابل امتیاز دهی بودند. آغازگرهای ISSR در مجموع توانستند 62 باند تولید کنند که از این تعداد، 15 باند یک شکل، سایر باندها چند شکل بودند. میانگین تعداد باند تولید شده توسط هر آغازگر برای 12 ژنوتیپ برابر 2/6 بود. آغازگر IS9 بیشترین تعداد باند (تعداد 11 باند) و آغازگر IS15 کمترین تعداد باند (تعداد 3 باند) را نشان دادند. بر اساس مارکر ISSR چندشکلی مطلوبی در بین ژنوتیپها مشاهده شد و آغازگرهای IS9، IS10، IS13 و IS16 به عنوان آغازگرهای مناسب برای بررسیهای گونه چچم دائمی، تعیین شد. بررسی تنوع ژنتیکی بر اساس مارکر ISSR برای ژنوتیپهای مورد مطالعه تطابق متوسطی با نتایج مطالعات بیوشیمیایی داشت.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
The study of genetic variation for Lolium perenne using molecular and biochemical markers
نویسنده [English]
1 Faculty Member of Research Department of Forests and Rangelands, Kermanshah Agricultural and Natural Resources Research and Education Center, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Kermanshah, I.R. of Iran
چکیده [English]
Genetic variations were study for 12 accessions of Lolium perenne using molecular and biochemical markers. Soluble proteins were extracted for each population by Laemmli′s method and electrophoresis was done using polyacrilamid gel. The numbers of 12 bands were observed for genotypes, which the numbers of 6 bands were polymorph. The highest number of band belonging to Tyrone with 12 bands and the genotype of Green Gold had the lowest number of band (6 bands). The results of cluster analysis and principal coordinate analysis were fall the genotypes in three groups. Genetic variation for accessions were surveyed using the number of 12 ISSR primers, that the number of 10 primers can be scored. The ISSR primers can be produced the number of 62 bands, which the polymorphism was showed for the number of 47 bands. The average of bands was 6.2 for each primer. The primer of IS9 showed the highest number of band (11 bands) and IS15 showed the lowest number of band (3 bands). A desirable polymorphism between genotype was observed based on ISSR markers, which the primers of IS9, IS10, IS13 and IS16 were determined for genetic variation study in Lolium perenne as desirable primers. Genetic variation based on ISSR marker had a average conformity with the results of protein surveys.
کلیدواژهها [English]
بررسی تنوع ژنتیکی برخی از ژنوتیپهای چچم دائمی (Lolium perenne) با استفاده از نشانگرهای مولکولی و بیوشیمیایی
هوشمند صفری1*، هومن شیروانی2 و لیدا فریدونی3
1 کرمانشاه، مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی، بخش تحقیقات جنگلها و مراتع
2 تهران، دانشگاه پیام نور، گروه کشاورزی
3 ایلام، دانشگاه ایلام، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح نباتات
تاریخ دریافت: 17/6/95 تاریخ پذیرش: 17/3/96
چکیده
تنوع ژنتیکی 12 ژنوتیپ از گونه مرتعی Lolium perenneبا استفاده از نشانگرهای مولکولی و بیوشیمیایی مورد بررسی قرار گرفت. برای هر ژنوتیپ پروتئینهای محلول برگ به روش Laemmli استخراج، و با ژل پلی آکریل آمید 12 درصد مورد بررسی قرار گرفت. تعداد 12 باند برای 12 ژنوتیپ مورد بررسی مشاهده شد، که از 12 باند حاصل تعداد 6 باند چندشکل بود و در 6 باند نیز چند شکلی مشاهده نشد. بیشترین تعداد باند مربوط به ژنوتیپ Tyrone با 12 باند و کمترین تعداد باند مربوط به ژنوتیپ Green Gold با 6 باند بود. نتایج تجزیه کلاستر و تجزیه به مختصات اصلی ژنوتیپهای مورد مطالعه را در سه دسته قرار داد. با استفاده از 12 آغازگر ISSR تنوع ژنتیکی ژنوتیپها مورد بررسی قرار گرفت که از این 12 آغازگر 10 عدد دارای باندهای قابل امتیاز دهی بودند. آغازگرهای ISSR در مجموع توانستند 62 باند تولید کنند که از این تعداد، 15 باند یک شکل، سایر باندها چند شکل بودند. میانگین تعداد باند تولید شده توسط هر آغازگر برای 12 ژنوتیپ برابر 2/6 بود. آغازگر IS9 بیشترین تعداد باند (تعداد 11 باند) و آغازگر IS15 کمترین تعداد باند (تعداد 3 باند) را نشان دادند. بر اساس مارکر ISSR چندشکلی مطلوبی در بین ژنوتیپها مشاهده شد و آغازگرهای IS9، IS10، IS13 و IS16 به عنوان آغازگرهای مناسب برای بررسیهای گونه چچم دائمی، تعیین شدند. بررسی تنوع ژنتیکی بر اساس مارکر ISSR برای ژنوتیپهای مورد مطالعه تطابق متوسطی با نتایج مطالعات بیوشیمیایی داشت.
واژه های کلیدی: چچم دائمی، تنوع ژنتیکی، پروتئینهای محلول، مارکر ISSR
* نویسنده مسئول، تلفن: 09183305823 ، پست الکترونیکی: Hooshmandp@yahoo.com
مقدمه
بشر از روزگاران گذشته برای دستیابی به غذا کوششی پیگیر را آغاز کرده است. آنچه مسلم است این است که انسان، هزارهها و سدههای بسیاری را با خوردن گیاهان خودرو گذرانده است. در حال حاضر تأمین غذا برای ژنوتیپ 7 میلیارد نفری جهان کاری بس مشکل است. روند افزایش ژنوتیپ در جهان این مشکل را بیشتر نمایان میسازد. از آنجا که غذای انسان عمدتاً از کشاورزی و دامپروری تأمین میشود و محدود بودن منابع آب، زمین، دام و مرتع، محدودیت مواد غذایی را در پی دارد، تولیدات به دست آمده از این منابع پاسخگوی نیازهای ژنوتیپ روز افزون نخواهد بود. مرتع یکی از منابع مهمی است که در تولید این فرآوردهها نقش ارزندهای دارد. نقش گیاهان علوفهای در تعلیف دام، از اهمیت غیرقابل انکاری برخوردار است، ازاین رو، بذل توجه به کشت محصولات علوفهای با شیوه علمی، اهمیت خاصی مییابد (30). گراسها از مهم ترین گیاهان مرتعی هستند که به لحاظ.تولید علوفه، احداث چراگاهها، حفاظت و جلوگیری از فرسایش خاک اهمیت زیادی دارند (23). جنس چچم (Lolium) شامل گونههایی است که از منطقه مدیترانه منشأ گرفتهاند (32) و بومی اروپا، مناطق معتدل آسیا و شمال آفریقا هستند، اما تقریباً از سرتاسر جهان معرفی شده است (19 و 25). به دلیل کیفیت بالای این گیاه عمده استفاده مهم از آن برای تغذیه گاوهای شیری و همچنین برای تمامی دامهایی که نیازهای غذایی بالایی دارند مناسب است. در هر حال Lolium perenneاز نظر اقتصادی، از گونههای علوفهای بسیار مهم در ایران هستند (21). تولید ارقام گیاهان علوفهای که علاوه بر عملکرد خوب دارای مواد غذایی مناسب برای انواع متفاوت دامها هستند یکی از اهداف مهم بهنژادگران و تولید کنندگان محصولات علوفهای می باشد (15). بررسی و تحلیل تنوع ژنتیکی در ذخائر توارثی موجود از مهم ترین مراحل پروژههای بهنژادی است که امکان گروهبندی و توصیف دقیق نمونهها را فراهم آورده و بهنژادگرها را در تشخیص زیر مجموعهها و نمونههایی که امکان استفاده مؤثر آنها در برنامههای اصلاحی آتی وجود دارد یاری میکند (22). ارزیابی و تعیین میزان تنوع ژنتیکی یکی از شاخصهای مهم برای انتخاب والدین در برنامههای اصلاحی است. یکی از روشهای اصلاح گیاهان علوفهای، گزینش همراه با آزمایش نسل است، موفقیت در گزینش، بستگی به تنوع با ایجاد نوترکیبی ژنتیکی و هتروزیس دارد. با افزایش فاصله ژنتیکی بین گونههای گراسها احتمال هتروزیس در برنامههای تلاقی افزایش مییابد (14 و 26). نشانگرهای مولکولی ابزارهای بسیار مفید و قوی در ارزیابی روابط خویشاوندی ژنتیک، انتخاب گیاهان برتر و بررسی شباهت یا تفاوت بین نمونههای مختلف میباشد. نشانگرهای مولکولی وابسته به DNA تحت تأثیر شرایط محیط قرار نمیگیرند و تعداد زیادی از بین نشانگرها را میتوان به راحتی در کل ژنوم جستجو نمود (8). توالیهای بین ریز ماهوارهها نشانگرهای مولکولی نیمه تصادفی هستند (7). تکثیر در این نشانگر در حضور یک آغازگر مکمل با توالیهای SSR یا ریز ماهواره هدف انجام میپذیرد (31). در مطالعات متعددی با استفاده از مارکرهای مولکولی تنوع ژنتیکی گونههای چچم مورد بررسی قرار گرفته و گزارش شده که استفاده از نشانگرهای مولکولی روش کارآمدی جهت تعیین تنوع ژنتیکی ارقام چچم بوده است (13، 27 و 28). پروتئینهای گیاهی به دو گروه اصلی تقسیم میشوند: 1- پروتئینهای غیر ساختاری یا آنزیمها و 2- پروتئینهای ساختاری و پروتئینهای ذخیرهای بذر که از هر دو گروه این پروتئینها، برای مطالعات تنوع ژنتیکی و تغییرات درون ژنوتیپها استفاده میشود (16) .تکنیک الکتروفورتیک پروتئینها نشان دهنده بسیاری از شباهتها و اختلافات ژنتیکی میان گیاهان مورد مقایسه هستند بخصوص در مورد گیاهان زراعی که رقمهای آنها برای آنالیز با ارزش هستند (17). در بسیاری از مطالعات جهت بررسی تنوع ژنتیکی از پروتئینهای محلول در برگ استفاده گردید و گزارش شده که الگوی باندی پروتئین روش کارآمدی جهت بررسی تنوع ژنتیکی و تفکیک گونهها می باشد (11 و 24). هدف از تحقیق حاضر بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای گونه چچم دائمی با استفاده از مارکر مولکولی ISSR و پروتئینهای محلول در برگ میباشد.
مواد و روشها
به منظور ارزیابی تنوعژنتیکی براساس خصوصیات بیوشیمیایی و مولکولی تعداد 12 ژنوتیپ از سرده Lolium perenne از تیره گرامینه با توجه به کلیه بذرهای موجود در بانک ژن منابع طبیعی مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور تهیه گردید. مشخصات مواد ژنتیکی مورد مطالعه، با ذکر اسم، کد بانک ژن، منشاء و کد ژنوتیپ در جدول 1 نشان داده شده است. لازم به ذکر است تحقیقات آزمایشگاهی در آزمایشگاه بیوتکنولوژی مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان کرمانشاه انجام شد.
جدول 1- لیست ژنوتیپهای چچم چند ساله تهیه شده از بانک ژنمنابع طبیعی مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور به همراه کد بانک ژن و منشاء |
|||||||
کد ژنوتیپ |
منشاء |
اسم ژنوتیپ |
کد بانک ژن |
کد ژنوتیپ |
منشاء |
اسم ژنوتیپ |
کد بانک ژن |
1G |
هلند |
Aubisque |
1309 |
7G |
ایرلند جنوبی |
Grenisle |
1303 |
2G |
ایرلند جنوبی |
Green Gold |
1307 |
8G |
ایرلند شمالی |
Tyrone |
1312 |
3G |
ایرلند جنوبی |
Magician |
1308 |
9G |
دانمارک |
Napoleon |
1311 |
4G |
هلند |
Carat |
1305 |
10G |
ایرلند جنوبی |
Fontoon |
1310 |
5G |
ایرلند |
Gilford |
1313 |
11G |
نیو زیلند |
Yatsyn |
1302 |
6G |
ایرلند شمالی |
Moy |
1301 |
12G |
ایرلند شمالی |
Spelga |
1306 |
تجزیه مولکولی: استخراج DNA به روشCTAB تغییر یافته (10) برای ژنوتیپها انجام گرفت. کمیت و کیفیت DNA استخراج شده با استفاده از ژل آگارز 8/0 درصد و روش اسپکتروفتومتری مشخص شد. واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) در حجم 20 میکرولیتر (50 نانوگرم DNA الگو، 2 میلی مولار MgCl2، 05/0 میلی مولار از هر dNTP، 2/0 میکرومول آغازگر، یک واحد آنزیم Taq DNA Polymerase و بافر واکنش به غلظت x1) انجام شد. چرخه حرارتی شامل یک مرحله واسرشت سازی اولیه در دمای ۹۵ درجه سانتیگراد و به مدت ۵ دقیقه و 40 سیکل حرارتی بود که در هر چرخه نیز، زمان و دمای واسرشت سازی به ترتیب ۳۰ ثانیه و ۹۵ درجه سانتیگراد، زمان اتصال آغازگر 45 ثانیه و دمای آن برای هر آغازگر متفاوت بود. همچنین زمان و دمای توسعه رشته نیز به ترتیب ۶۰ ثانیه و ۷۲ درجه سانتیگراد بود. توسعه نهایی به مدت ۵ دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد انجام شد. در این آزمایش از ژل آگارز 2 درصد با بافر TBE x1 استفاده گردید. به منظور بررسی محصولات واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) ابتدا میزان ۵ میکرولیتر بافر نمونه گذاری به DNA های تکثیر شده اضافه و سپس میزان ۱۰ میکرو لیتر از هر نمونه به درون چاهکهای ایجاد شده در ژل آگارز بارگذاری و با ولتاژ ۱۰۰ و میزان ۵/۲ ساعت حرکت صورت گرفت و سپس ژل را جهت رنگ آمیزی در محلول اتیدیوم برماید (یک میکروگرم در میکرولیتر) به مدت ۴۵-۳۰ دقیقه قرار داده و از دستگاه Gel Document جهت مشاهده باندها استفاده شد.
نجزیه بیوشیمیایی: جهت عصارهگیری 5/0 گرم از برگ هر ژنوتیپ را که در داخل گلدان کشت شده بودند، بریده و پس از توزین با 5/1 میلیلیتر محلول عصارهگیری (تریس، 6/5 گرم و گلیسین، 96/2 گرم، 3/8=pH) در داخل هاون چینی مخلوط و کاملاً ساییده شد (18). پس از 10 دقیقه سایش عصاره حاصل را در لولههای آزمایش ریخته و در یخچال در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 12 ساعت نگهداری گردید. سپس عصارهها جهت صاف کردن با دور 14000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند. محلول صاف شده رویی توسط میکروپیپت جدا شده و با محلول بافر نمونه به نسبت 1 : 1 مخلوط گردید. سرانجام محلول مخلوط شده به میکروتیوپهای دربدار اپندروف منتقل و در دستگاه بن ماری در درجه حرارت 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه گرم شد. نمونهها تا زمان مصرف در فریزر در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری گردید (18). الکتروفورز به روش ژل پلی اکریل امید به صورت ژل پایینی (12 درصد) و ژل بالایی یا متراکم کننده (4 درصد) انجام شد (18). پس از بررسی کمیت و کیفیت پروتئینها میزان 70 میکرولیتر پروتئین نمونه به داخل چاهک تزریق و سیستم الکتروفورز به منبع تغذیه وصل گردید. هنگامی که نمونه در داخل ژل فوقانی قرار داشت از ولتاژ ثابت 110 و بعد از ورود نمونه به داخل ژل جداکننده ولتاژ را به 130 و مدت 5 ساعت استفاده گردید. پس از انجام الکتروفورز به منظور مشاهده باندهای پروتئینی، رنگ آمیزی با استفاده از کوماسی بلو به مدت 1 ساعت انجام گرفت. در پایان جهت آشکار شدن باندهای پروتئینی از محلول رنگ بر در چند مرحله به مدت 1 ساعت استفاده گردید.
تجزیه و تحلیل دادهها: به منظور استفاده از اطلاعات الکتروفورزی در آنالیزهای آماری براساس داشتن باند (کد یک) یا نداشتن باند (کد صفر) نتایج حاصل برای پروتئین و نشانگر ISSR کدبندی شدند. تجزیه خوشهای، ماتریس تشابه بر مبنای ضریب دایس و تجزیه به مختصات اصلی (PCo) دادهها با استفاده از نرم افزارDarwin ، و تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) با استفاده از نرم افزار GenAlEx 6.2 بر اساس ضرایب دایس انجام گرفت. محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC) برای نشانگر ISSR از طریق فرمول (29) محاسبه گردید.
|
نتایج و بحث
نتایج حاصل از ارزیابی تنوع بر اساس الگوی باندی پروتئین: در شکل 1 باندهای حاصل از الکتروفورز ژل پروتئینهای استخراج شده از برگ ژنوتیپهای مورد بررسی ارائه شد. همچنان که ملاحظه میگردد، اگر چه باندهای پروتئینی مشترک زیادی در داخل ژنوتیپهای مورد بررسی وجود داشت، اما در بعضی موارد نیز ژنوتیپها فاقد بعضی از باندها بودند که این موضوع میتواند مربوط به عدم تولید پروتئین مورد نظر در مرحله استخراج پروتئین باشد. در مجموع تعداد 12 باند برای 12 ژنوتیپ مورد بررسی مشاهده شد که بیشترین تعداد باند مربوط به ژنوتیپ Tyrone(8G) با 12 باند و کمترین تعداد باند مربوط به ژنوتیپ Green Gold (2G) با 6 باند بود. بنابراین به خوبی مشخص است که تنوع بالایی برای باندهای پروتئینی در بین ژنوتیپها وجود نداشت. همچنین از 12 باند حاصل تعداد 6 باند چند شکل بود و در 6 باند نیز چند شکلی مشاهده نشد. علاوه بر این باندهای پروتئینی نه تنها از نظر محل قرار گرفتن روی ژل و وزن مولکولی، بلکه از لحاظ تراکم و شدت نیز با یکدیگر اختلاف نشان دادند.
شکل 1- تصویر الکتروفورز پروتینهای محلول در برگ ژنوتیپهای چچم چند ساله مورد مطالعه
نشان دهنده عدم وجود باند در ژل میباشد
ماتریس تشابه ژنوتیپها براساس پروتئین برگ: ماتریس تشابه بر مبنای ضریب جاکارد برای باندهای حاصل از الکتروفورز پروتئینهای محلول در برگ ژنوتیپها محاسبه شد و در جدول 2 ارائه شده است. میانگین تشابه بین ژنوتیپها برابر 863/0 بود که بالا بودن تشابه بیانگر شباهت ژنتیکی بین ژنوتیپها برای پروتئینهای محلول در برگ بود و ضریب تشابه از 000/1 تا 667/0 متغیر بود. بیشترین تشابه بین دو ژنوتیپ Aubisque (1G) و Grenisle (7G) و همچنین بین سه ژنوتیپ Magician (3G)، Carat (4G) و Yatsyn (11G) مشاهده گردید، با ضریب تشابه 1 و کمترین تشابه بین ژنوتیپهای Moy (6G) و Napoleon (9G) با ضریب تشابه 737/0 و بین ژنوتیپهای Gilford (5G) و Green Gold (2G) با ضریب تشابه 706/0 و بین ژنوتیپ Tyrone (8G) با ژنوتیپهای Aubisque (1G)، Green Gold (2G) و Grenisle (7G) به ترتیب با ضرایب تشابه 737/0، 667/0 و 737/0 بود.
جدول 2- ماتریس تشابه ژنوتیپهای مورد بررسی برای پروتئینهای برگ بر اساس ضریب جاکارد |
|
|||||||||||
ژنوتیپ |
Aubisque |
Green Gold |
Magician |
Carat |
Gilford |
Moy |
Grenisle |
Tyrone |
Napoleon |
Fontoon |
Yatsyn |
Spelga |
Aubisque |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Green Gold |
923/0 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Magician |
933/0 |
857/0 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Carat |
933/0 |
857/0 |
00/1 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Gilford |
778/0 |
706/0 |
842/0 |
842/0 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
Moy |
857/0 |
800/0 |
941/0 |
941/0 |
900/0 |
1 |
|
|
|
|
|
|
Grenisle |
00/1 |
923/0 |
933/0 |
933/0 |
788/0 |
857/0 |
1 |
|
|
|
|
|
Tyrone |
737/0 |
667/0 |
800/0 |
800/0 |
957/0 |
857/0 |
737/0 |
1 |
|
|
|
|
Napoleon |
824/0 |
750/0 |
778/0 |
778/0 |
857/0 |
737/0 |
824/0 |
909/0 |
1 |
|
|
|
Fontoon |
857/0 |
800/0 |
941/0 |
941/0 |
900/0 |
889/0 |
857/0 |
857/0 |
842/0 |
1 |
|
|
Yatsyn |
933/0 |
857/0 |
00/1 |
00/1 |
842/0 |
941/0 |
933/0 |
800/0 |
778/0 |
941/0 |
1 |
|
Spelga |
857/0 |
800/0 |
824/0 |
824/0 |
900/0 |
889/0 |
857/0 |
857/0 |
842/0 |
889/0 |
823/0 |
1 |
تجزیه خوشهای ژنوتیپها بر اساس پروتئین برگ: تجزیه خوشهای برای ژنوتیپها به منظور گروهبندی آنها بر اساس تنوع باندهای پروتئینی بر اساس ضریب جاکارد و با روش UPGMA صورت گرفت (شکل 2) که ژنوتیپهای مورد مطالعه به 3 دسته تقسیم شدند، به طوری که گروه اول شامل ژنوتیپهای Green Gold (2G)، Grenisle (7G) و Aubisque (1G) بود. ژنوتیپهای Carat (4G)، Magician (3G)، Yatsyn (11G)، Moy (6G) و Fontoon (10G) در گروه دوم قرار داشتند و ژنوتیپهای Napoleon (9G)، Spelga (12G)، Tyrone (8G) و Gilford (5G) در گروه سوم قرار داشتند. همچنان که ملاحظه میگردد، گروهبندی حاصل از تجزیه خوشهای بر اساس باندهای پروتئینی توانست ژنوتیپها را در سه گروه متمایز قرار دهد و آنها را از هم تفکیک نماید.
تجزیه به مختصات اصلی بر اساس پروتئینهای برگ: تجزیه به مختصات اصلی برای ژنوتیپها بر اساس پروتئینهای برگ انجام شد و نمودار پراکنش ژنوتیپها بر اساس دو مختصات اول و دوم در شکل 3 ارائه شده است، همچنانکه ملاحظه میگردد گروهبندی حاصل از مختصات اول و دوم با گروهبندی ژنوتیپها بر اساس تجزیه خوشهای (شکل 2) کاملاً مطابقت داشت و ژنوتیپهای Green Gold (2G)، Grenisle (7G) و Aubisque (1G) در یک گروه قرار گرفتند. ژنوتیپهای Carat (4G)، Magician (3G)، Yatsyn (11G)، Moy (6G) و Fontoon (10G) در گروه دوم قرار داشتند و ژنوتیپهای Napoleon (9G)، Spelga (12G)، Tyrone (8G) و Gilford (5G) در گروه سوم قرار داشتند. بنابراین ژنوتیپهای هر گروه دارای بیشترین تشابه بر اساس پروتئینهای محلول بودند. از طرف دیگر ژنوتیپهای Green Gold (2G)، Grenisle (7G) با ژنوتیپهای Tyrone (8G) و Gilford (5G) بیشترین فاصله ژنتیکی بر اساس شکل 3 داشتند و ژنوتیپهای Carat (4G)، Magician (3G)، Yatsyn (11G)، Moy (6G) و Fontoon (10G) بیشترین فاصله با ژنوتیپهای Napoleon (9G) و Spelga (12G) داشتند.
شکل 2- دندروگرام حاصل از بررسی الکتروفورز پروتئینهای برگ در ژنوتیپهای مطالعه شده
شکل 3- نمودار پراکنش ژنوتیپهای مورد بررسی براساس دو محور مختصات اصلی اول و دوم
نتایج حاصل از تجزیه ISSR: تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای مورد مطالعه با استفاده از 12 آغازگر ISSR مورد بررسی قرار گرفت که از این 12 آغازگر 10 عدد دارای باندهای قابل امتیاز دهی بودند. آغازگرهای ISSR در مجموع توانستند 62 باند تولید کنند که از این تعداد، 15 باند یک شکل مشاهده شد و سایر باندها چند شکل بودند. میانگین تعداد باند تولید شده توسط هر آغازگر برای 12 ژنوتیپ برابر 2/6 بود. آغازگر IS9 بیشترین تعداد باند (تعداد 11 باند) و آغازگر IS15 کمترین تعداد باند (تعداد 3 باند) را نشان دادند. ژنوتیپ Spelga (12G) بیشترین باند (49 باند) و ژنوتیپ Fontoon (10G) کمترین باند (34 باند) را در بین ژنوتیپهای مورد بررسی داشتند. شکل 4 الگوی باندی 12 ژنوتیپ مورد بررسی به ترتیب با استفاده از آغازگرهای IS5 را نشان میدهد. نتایج به دست آمده برای آغازگرهای استفاده شده در جدول 3 ارائه شده است.
جدول 3- درصد چند شکلی، تعداد کل باند و محتوای اطلاعات چند شکلی در آغازگرهاهای ISSR |
|||||
نام آغازگر |
توالی آغازگر (-3' 5') |
تعداد مکانهای تکثیر شده |
تعداد مکانهای چند شکل |
درصد چند شکلی |
محتوی اطلاعات چند شکلی |
IS3 |
GAGAGAGAGAGAGAGAYC |
4 |
4 |
100 |
25/0 |
IS5 |
AGAGAGAGAGAGAGAGC' |
11 |
8 |
73/72 |
30/0 |
IS9 |
CTCTCTCTCTCTCTCTG |
4 |
4 |
100 |
36/0 |
IS10 |
GAGAGAGAGAGAGAGA Rc |
8 |
8 |
100 |
33/0 |
IS11 |
ACACACACACACACACC |
7 |
4 |
14/57 |
34/0 |
IS12 |
TGTGTGTGTGTGTGTGG |
5 |
3 |
60 |
45/0 |
IS13 |
AGAGAGAGAGAGAGAGYT |
3 |
3 |
100 |
32/0 |
IS14 |
GACAGACAGACAGACA |
8 |
5 |
50/62 |
28/0 |
IS15 |
GGATGGATGGATGGAT |
8 |
4 |
50 |
33/0 |
IS16 |
DBDACACACACACACACA |
4 |
4 |
100 |
34/0 |
میانگین |
20/6 |
70/4 |
24/80 |
33/0 |
Y=(C,T), V=(A,C,G), D=(A,G,T), B=(C,G,T)
شکل 4- تصویر ژل الکتروفورزی ژنوتیپهای چچم چند ساله مورد بررسی برای آغازگر IS5
میانگین درصد چند شکل در بین ژنوتیپهای مورد بررسی برابر 24/80 درصد بود که کمترین درصد چند شکلی را آغازگر IS15 (50 درصد) و بیشترین درصد چند شکلی به آغازگرهای IS3، IS9، IS10، IS13 و IS16اختصاص داشت، که میزان چند شکلی در این آغازگرها برابر 100 درصد بود.. میانگین PIC در آغازگرهای مورد بررسی برابر 335/0 بود که بیشترین میزان PIC مربوط به آغازگر IS12 بود که این آغازگر بهتر از سایر آغازگرها بر اساس شاخص PIC توانست فاصله ژنتیکی ژنوتیپها را مشخص کنند. آغازگر IS3 و IS14 با کمترین میزان PIC توانایی خوبی در جداسازی ژنوتیپها نداشتند. در مجموع پیشنهاد میگردد از آغازگرهای IS9، IS10، IS13 و IS16 که شاخص PIC درصد چند چندشکلی بالایی را نشان دادند، برای آنالیز مجموعه ژرم پلاسم دیگر ژنوتیپهای لولیوم در تحقیقات بعدی استفاده کرد. آغازگرهای IS5، IS11، IS14 و IS15 با کمترین میزان PIC و درصد چند شکلی توانایی خوبی در جداسازی ژنوتیپها نداشتند. دیگر آغازگرها برای یکی از پارامترهای PIC یا درصد چندشکلی برتری نشان دادند.
ماتریس تشابه: تشابه ژنتیکی ژنوتیپهای مورد بررسی با استفاده از ضریب تشابه دایس از 709/0 تا 873/0 متغیر بود (جدول 4)، میانگین تشابه بین ژنوتیپها برابر 792/0 بود که بالا بودن تشابه ژنتیکی یاد شده نشان دهنده تنوع ژنتیکی پایین در بین ژنوتیپهای چچم بر اساس آغازگرهای مورد بررسی میباشد. بیشترین تشابه را ژنوتیپهای Aubisque (1G) با Grenisle (7G) و کمترین تشابه را ژنوتیپ Yatsyn (11G) با Grenisle (7G) داشتند.
جدول 4- ماتریس تشابه ژنوتیپها برای پرایمرهای ISSR استفاده شده بر اساس ضریب دایس
ژنوتیپ |
Aubisque |
Green Gold |
Magician |
Carat |
Gilford |
Moy |
Grenisle |
Tyrone |
Napoleon |
Fontoon |
Yatsyn |
Spelga |
Aubisque |
1 |
|||||||||||
Green Gold |
822/0 |
1 |
||||||||||
Magician |
795/0 |
787/0 |
1 |
|||||||||
Carat |
714/0 |
825/0 |
782/0 |
1 |
||||||||
Gilford |
873/0 |
805/0 |
818/0 |
785/0 |
1 |
|||||||
Moy |
778/0 |
732/0 |
809/0 |
775/0 |
840/0 |
1 |
||||||
Grenisle |
836/0 |
800/0 |
771/0 |
767/0 |
800/0 |
747/0 |
1 |
|||||
Tyrone |
776/0 |
831/0 |
738/0 |
800/0 |
831/0 |
753/0 |
817/0 |
1 |
||||
Napoleon |
827/0 |
814/0 |
839/0 |
786/0 |
860/0 |
814/0 |
795/0 |
815/0 |
1 |
|||
Fontoon |
787/0 |
789/0 |
747/0 |
746/0 |
829/0 |
743/0 |
857/0 |
862/0 |
865/0 |
1 |
||
Yatsyn |
747/0 |
736/0 |
766/0 |
800/0 |
767/0 |
782/0 |
709/0 |
756/0 |
791/0 |
784/0 |
1 |
|
Spelga |
744/0 |
800/0 |
804/0 |
750/0 |
778/0 |
778/0 |
786/0 |
800/0 |
809/0 |
763/0 |
821/0 |
1 |
تجزیه خوشهای: دندروگرام حاصل از تجزیه خوشهای به روش UPGMA بر اساس ضریب تشابه دایس برای ژنوتیپها در شکل 5 ارائه شده است. همچنان که ملاحظه میگردد ژنوتیپها در 3 گروه قرار گرفتند. گروه اول شامل ژنوتیپهای Yatsyn (11G)، Spelga (12G)، Magician (3G) و Moy (6G) بود، متوسط ضریب تشابه برای ژنوتیپهای این گروه 793/0 بود. ژنوتیپهای Carat (4G)، Green Gold (2G) و Tyrone (8G) گروه دوم بود، که متوسط ضریب تشابه برای این سه ژنوتیپ 819/0 به دست آمد. گروه سوم شامل پنج ژنوتیپ Aubisque (1G)، Gilford (5G)، Grenisle (7G)، Napoleon (9G) و Fontoon (10G) بود. برای این گروه متوسط ضریب تشابه این گروه 833/0 بود. بنابراین گروه چهارم دارای بیشترین تشابه بودند و ژنوتیپهای گروه اول دارای کمترین تشابه بودند. ماتریس تشابه برای گروههای حاصل از تجزیه خوشهای (جدول 5) نشان داد که بیشترین تشابه در بین ژنوتیپهای گروه 2 و 3 بود. کمترین تشابه در بین ژنوتیپهای گروه 2 و 1 وجود داشت.
جدول 5- شباهت گروههای حاصل از تجزیه خوشهای |
|||
گروه |
گروه اول |
گروه دوم |
گروه سوم |
گروه اول |
000/1 |
|
|
گروه دوم |
767/0 |
000/1 |
|
گروه سوم |
778/0 |
795/0 |
000/1 |
شکل 5- دندروگرام حاصل از دادههای نشانگر ISSR برای ژنوتیپهای مورد مطالعه
تجزیه به مختصات اصلی (PCo): بر اساس دادههای حاصل از آغازگرهای مورد بررسی تجزیه به مختصات اصلی برای ژنوتیپها انجام شد، که نتایج نشان داد محور مختصات اول و دوم به ترتیب 51/24 و 27/19 درصد از واریانس موجود را توضیح دادند و در مجموع 78/43 درصد از واریانس با این دو محور بیان گردید. بر اساس مختصات اول و دوم دیاگرام پراکنشی ژنوتیپها رسم گردید (شکل 6)، که این دیاگرام با نتایج تجزیه خوشهای تا حدودی مطابقت داشت و ژنوتیپها به چهار گروه تقسیم شدند. با توجه به نمودار ژنوتیپهای Magician (3G) و Moy (6G) با بیشترین تشابه در یک گروه قرار داشتند و دارای بیشترین فاصله را با ژنوتیپهای Green Gold (2G)، Tyrone (8G)، Grenisle (7G) و Fontoon (10G) که در یک گروه قرار داشتند، بودند. همچنین ژنوتیپهای 1G، 5G و 9G (با تشابه بالا در یک گروه قرار داشتند) با ژنوتیپهای Aubisque (1G)، Gilford (5G) و Napoleon (9G) (با تشابه بالا در یک گروه قرار داشتند) بیشترین فاصله ژنتیکی بر اساس بایپلات نشان دادند.
شکل 6- بای پلات ژنوتیپها برای نشانگر ISSR بر اساس محور مختصات اصلی اول و دوم
تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA): تجزیه واریانس مولکولی بر اساس گروهبندی تجزیه خوشهای انجام شد (جدول 6)، که ژنوتیپها در داخل 3 گروه قرار گرفتند بر اساس آماره PhiPT در بین ژنوتیپها در سطح 5 درصد اختلاف معنیدار وجود داشت به عبارت دیگر گروهبندی به صورت صحیح انجام گرفته است. نتایج به دست آمده نشان داد که در میان کلاسترها تنوع بیشتر از بین گروهها میباشد. بر این اساس تنوع در درون کلاسترها برابر 87 درصد و در بین کلاسترها تنوع برابر 13 درصد مشاهده گردید.
جدول 6- تجزیه واریانس مولکولی بر اساس نشانگر ISSR |
||||||
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
مجموع مربعات |
میانگین مربعات |
واریانس برآورد شده |
درصد از واریانس |
PhiPT |
بین گروه |
2 |
63/27 |
82/13 |
323/1 |
13% |
133/0* |
درون گروه |
9 |
70/77 |
63/8 |
633/8 |
87% |
|
کل |
11 |
33/105 |
|
957/9 |
100% |
|
* اختلاف در سطح 5% معنیدار |
بحث و نتیجهگیری
با توجه به نتایج به دست آمده ملاحظه شد که شباهت ژنوتیپها بر اساس پروتئینهای برگ بالا بود و بنابراین میتوان بیان داشت که تنوع ژنتیکی بالایی بر اساس پروتئینهای برگ در بین ژنوتیپها مشاهده نشد. جعفری و همکاران (1392) در بررسی ارتباط بین تنوع ژنتیکی و توزیع جغرافیایی میان 11 جمعیت وحشی
Dactylis glomerata توسط پروتئینهای کل گزارش کردند که همبستگی میان تنوع ژنتیکی و تنوع جغرافیایی بسیار کم بوده و از لحاظ آماری معنی دار نبوده است (1). Aiken و همکاران (1998) با استفاده از پروتئینهای ذخیرهای بذر گونههای جنس فستوکا و لولیوم را طبقهبندی کردند و بیان داشتند که پروفایل باندهای پروتئین با مناطق جمعآوری گونهها تطابق نداشت (4). اما در هر حال گروهبندی بر اساس پروتئینهای برگ تا حدودی دستههای متمایزی از ژنوتیپها را نشان داد که باتوجه به این مسئله میتوان بیان داشت استفاده از بررسی پروتئینهای برگ در بررسی تنوع درون گونهای تا حدودی مؤثر است. Dinelli و Lucchese (1999) با استفاده ازSDS-PAGE تنوع ژنتیکی بین و درون گونهای در جنس لولیوم را مورد بررسی قرار دادند و بیان داشتند که استفاده از پروتئینها میتواند در جهت ارزیابی تنوع مفید واقع شود (9). Ahmed (1994) از تکنیک الکتروفورز ژل پلیآکریلآمید برای بررسی 7 گونه از جنس یونجه استفاده کرد و نتایج حاصل را با استفاده از تجزیه خوشهای تحلیل نمود. او نشان داد که الکتروفورز روشی مؤثر برای ارزیابی روابط فنوتیپی در بین ردههای انتخاب شده است و این تکنیک به طور وسیعی در مطالعات ردهبندی جنسها و نیز ارزیابی تنوع بین گونهها و درون گونهها به کار برده میشود (3).
بر اساس مطالعات مولکولی چندشکلی مطلوبی بر اساس مارکر ISSR در بین ژنوتیپها مشاهده شد. عبدالهی و عزیزی (1393) نیز در مطالعه جمعیتهای مختلف یونجه چند شکلی بالای نشانگر مولکولی ISSR را گزارش نمودند (2). مناسبترین آغازگرها برای بررسیهای گونه چچم دائمی، آغازگرهای IS9، IS10، IS13 و IS16 بر اساس شاخص PIC تعیین شد، محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC) از صفر تا نیم در نشانگرهای غالب متغیر است و هرچه این عدد بزرگتر باشد بیانگر دلالت بر چندشکلی زیاد در یک جایگاه نشانگری دارد که در تفکیک و تمایز افراد نقش به سزایی دارد. Ghariani و همکاران (2003) به بررسی تنوع ژنتیکی 18 جمعیت Lolium perenne تونسیبا استفاده از نشانگر ISSR پرداختند. این نشانگر برای تخمین فاصله ژنتیکی میان ارقام در نظر گرفته شد دادههای حاصل میزان بالای تنوع ژنتیکی را Lolium perenneنشان داد (12). نتایج تنوع ژنتیکی بر اساس مارکر ISSR برای ژنوتیپهای مورد مطالعه تطابق متوسطی با نتایج مطالعات بیوشیمیایی داشت. بدین شرح که ژنوتیپهای Yatsyn (11G)، Magician (3G) و Moy (6G) با توجه به تجزیه بیوشیمیایی و تجزیه ISSR در یک گروه قرار داشتند، همچنین ژنوتیپهای Aubisque (1G) و Grenisle (7G) بر اساس هر دو روش شباهت ژنتیکی داشتند و همچنین ژنوتیپهای Gilford (5G) و Napoleon (9G) نیز بر اساس هر دو روش در یک گروه بودند. Hu و همکاران (2011) به بررسی تنوع ژنتیکی Lolium perenneبا استفاده از نشانگر ISSR برای مقایسه تنوع ژنتیکی مابین واریتههای تجاری و ژرم پلاسم طبیعی که از اروپا، آفریقا، آسیا، و آمریکای شمالی جمعآوری شده بودند پرداختند. یک تغییر ژنتیکی نسبتاً بالا در کل مجموعه مشخص شد. نتایج نشاندهنده تنوع ژنتیکی پایینتر در واریتههای تجاری نسبت به ژرم پلاسم طبیعی بود. بر اساس ضریب تشابه جاکارد، 12 گروه با یک نقطه برش متمایز شدند (13). بر اساس تجزیه خوشهای ژنوتیپها در سه گروه قرار گرفتند، که این نتیجه با دیاگرام حاصل از پراکنش ژنوتیپها بر اساس مقدار مختصات اول و دوم حاصل از تجزیه به مختصات اصلی تا حدودی مطابقت نشان داد، علت اینکه تطابق بالا مشاهده نشد این بود که دو مختصات اول تنها 78/43 درصد از تنوع موجود را توجیه نمود. در مجموع بر اساس آغازگرهای مورد استفاده و با توجه به تجزیه کلاستر و تجزیه به مختصات اصلی ژنوتیپهای Green Gold (2G) و Tyrone (8G) دارای بیشترین فاصله ژنتیکی با ژنوتیپهای Magician (3G) و Moy (6G) بودند. Pivoriene و همکاران (2008) به بررسی تنوع ژنتیکی 16 واریته Lolium perenne و دو لاین اصلاح شده Festuloliumبا استفاده از نشانگر ISSR پرداختند. تشابه ژنتیکی در ماتریس محاسبه شده بین واریتههای L. perenneوFestuloliumو لاینهای اصلاح شده متغیر بودند. نتایج سطح قابل توجه تنوع ژنتیکی بین واریتهها و لاینهای اصلاح شده توسط پلی مورفیسم ISSR ناشی از تغییرات نمونههای DNA را نشان داد (27). Majidi و Mirlohi (2010) به بررسی تشابه ژنتیکی 42 جمعیت از 8 گونه ایرانی Festuca، Lolium، BromusوAgropyron با استفاده از نشانگرهایAFLP پرداختند. بیان داشتند که ضرایب تشابه ژنتیکی جاکارد میان جمعیتها متغیر بود که نشان دهنده سطوح بالای تنوع ژنتیکی بین و داخل گونهای است. آنالیز خوشهای و تجزیه به مختصات اصلی به طور واضح تفاوت میان ذخایر ژنتیکی را نشان داد (20). از کاربردهای تجزیه واریانس مولکولی میتوان در تعیین تفاوت ژنتیکی بین ژنوتیپها و تعیین حد مطلوب خوشه در تجزیه خوشهای اشاره کرد، به این صورت که در هر گروه در نقطه برش دندروگرام به عنوان یک ژنوتیپ و ژنوتیپهای درون آن به عنوان افراد ژنوتیپ در نظر گرفته میشود و برای هر نقطه برش یک تجزیه واریانس انجام می گیرد. نقطهای که بیشترین تمایز بین گروهها به وجود می آید، به عنوان نقطه مناسب برش دندروگرام انتخاب خواهد شد. بر اساس تجزیه واریانس مولکولی گروههای حاصل از تجزیه کلاستر مشاهده شد که واریانس بین گروهها در سطح 5 درصد معنیدار بود، اما بر اساس واریانس برآورد شده سهم واریانس بین گروهها تنها 13 درصد از تنوع کل بود.Bolaric و همکاران (b2005) به بررسی تنوع ژنتیکی 22 رقم Lolium perenne و توصیف رابطه میان ارقام در شرایط اصلاح از راه دور با استفاده از نشانگرهای RAPDپرداختند. تجزیه و تحلیل واریانس مولکولی (AMOVA) نشان داد تنوع زیادی در درون (66 درصد) و بین ارقام (34 درصد) وجود داشت (6). Bolaric و همکاران (a2005) به ارزیابی خصوصیت مولکولی از طریق تنوع ژنتیکی در اکوتیپهای لهستانی Lolium perenne، و مقایسه رابطه این گروه و اکوتیپهای آلمانی و واریتههای اروپایی پرداختند. در یک آنالیز مشترک با 19 اکوتیپ لهستانی، 22 اکوتیپ آلمانی و 22 واریته اروپایی 172 نشانگر پلیمورفیک RAPD میتوان دید. فاصله ژنتیکی میان اکوتیپهای لهستانی متغییر بود. آنالیز واریانس مولکولی (AMOVA) تغییرات بیشتری داخل جمعیتها نسبت به بین جمعیتها نشان داد. اکوتیپهای لهستانی شامل بالاترین تغییرات داخل جمعیتی بودند (5). Vieira و همکاران (2004) به بررسی تعیین خصوصیت تنوع ژنتیکی و ساختار 4 جمعیت Lolium multiflorumبا استفاده از نشانگر RAPD پرداختند. مقدار شاخص تنوع ژنتیکی کلی به دست آمده بالا بود، که نشاندهنده وجود تنوع ژنتیکی وسیع در 4 جمعیت بود. آنالیز ساختار ژنتیکی نشان داد که تنوع داخل جمعیتی بیشتر از تنوع بین جمعیتی بود (33).