نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 عضو هیات علمی دانشگاه/دانشگاه کاشان

2 دانشگاه آزاد زنجان سازمان انتقال خون کاشان

چکیده

هپاتیت B از جمله ویروس‌های شایعی است که یکی از راه‌های انتقال آن خون و فرآورده‌های خونی می‌باشد. هدف از این پژوهش طراحی آزمونی است بر اساس واکنش زنجیره‌ای پلی‌مرازی (PCR) که بتوان از آن به منظور تشخیص ویروس هپاتیت B در نمونه‌های بالینی استفاده نمود.
در این مطالعه یک نمونه‌ی خون با بار مشخص ویروس تهیه شد تا قابلیت جفت پرایمر طراحی شده در تشخیص ویروس مورد ارزیابی قرار گیرد. همچنین اختصاصیت آن نیز علاوه بر بررسی بیوانفورماتیکی، با آزمون علیه سه ویروس شایع دیگر تا حدی تأیید گردید. همچنین از این روش در غربالگری مراجعین سازمان انتقال خون کاشان نیز استفاده گردید و نتایج آن با نتایج حاصل از روش متداول در این سازمان مقایسه شد.
نتایج این مطالعه نشان داد که جفت پرایمر طراحی شده بطور اختصاصی ژنوم ویروس هپاتیت B را تکثیر می‌نماید و حساسیت آن در حدود 100 ذره‌ی ویروس در هر میلی‌لیتر خون است که نزدیک به سه برابر حساس‌تر از روش الایزای متداول در سازمان انتقال خون است. همچنین در نمونه‌های بالینی، نتایج آزمون PCR کاملا مطابقت داشت با نتایج سازمان انتقال خون کاشان پس از انجام آزمون‌های تأییدی. آزمون طراحی شده، فاقد نتایج مثبت کاذب بود که علاوه بر جلوگیری از حذف داوطلبین سالم اهداء خون، در کاهش هزینه‌های سازمان هم می‌تواند نقش بسزایی داشته باشد. بنابراین به نظر می‌رسد بتوان آن را جایگزین روش جاری غربالگری این ویروس نمود که اولا هزینه‌ی انجام آن بسیار پایین‌تر می‌باشد و ثانیا بخشی از واجدین شرایط، از اهداء خون منع نمی‌گردند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The designation of PCR test to detect hepatitis B virus and evaluate the performance of this test in screening applicants of blood transfusion organization

نویسنده [English]

  • Rohollah Nakhaei Sistani 1

چکیده [English]

Hepatitis B virus (HBV) is of common viruses that transmitted by blood and blood products. The aim of this study is to design a polymerase chain reaction-based test to detect HBV in clinical samples. In this study, one blood sample with known load of HBV is prepared to assess the ability of designed primer pair. The specificity of the primer pair was somewhat confirmed by testing against three common virus types, in addition to bioinformatics analysis. The test was also used to screen applicants of blood transfusion organization of Kashan and its results compared with results of a current method used by this organization.
The results of this study showed that the designed primer pair specifically amplifies the HBV genome and its sensitivity is 100 particle per ml of blood, which is more sensitive than the results of the ELISA method currently used in blood transfusion organization. In clinical samples, however, the results of the polymerase chain reaction (PCR) test were completely in accordant with the results obtained by blood transfusion organization after confirmatory tests.
The designed test has no false positive results in contrast to ELISA, which, in addition to preventing the exclusion of healthy volunteer blood donors, could also have a significant role in reducing costs of the organization. So, it seems that it can replace the current screening method of this virus, that firstly the cost of doing it is much lower and secondly a part of bona fide person are not prevented from donating blood.

کلیدواژه‌ها [English]

  • PCR
  • ELISA
  • hepatitis B

طراحی آزمون PCR جهت تشخیص ویروس هپاتیت B و ارزیابی عملکرد این آزمون در غربالگری مراجعین به سازمان انتقال خون کاشان

روح الله نخعی سیستانی1*و سید مهدی سادات الحسینی2و3

1کاشان، دانشگاه کاشان، دانشکده شیمی، گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی 

2زنجان، دانشگاه آزاد اسلامی واحد زنجان، گروه ژنتیک مولکولی

3 کاشان، سازمان انتقال خون کاشان  

تاریخ دریافت: 3/6/95                  تاریخ پذیرش: 9/12/95

چکیده

هپاتیت B از جمله ویروسهای شایعی است که یکی از راههای انتقال آن خون و فرآورده­های خونی می­باشد. هدف از این پژوهش طراحی آزمونی است بر اساس واکنش زنجیره­ای پلی­مرازی (PCR) که بتوان از آن به منظور تشخیص ویروس هپاتیت B در نمونه­های بالینی استفاده نمود. در این مطالعه یک نمونه خون با بار مشخص ویروس تهیه شد تا قابلیت جفت پرایمر طراحی شده در تشخیص ویروس مورد ارزیابی قرار گیرد. همچنین اختصاصیت آن نیز علاوه بر بررسی بیوانفورماتیکی، با آزمون علیه سه ویروس شایع دیگر تا حدی تأیید گردید. همچنین از این روش در غربالگری مراجعین سازمان انتقال خون کاشان نیز استفاده گردید و نتایج آن با نتایج حاصل از روش متداول در این سازمان مقایسه شد. نتایج این مطالعه نشان داد که جفت پرایمر طراحی شده به طور اختصاصی ژنوم ویروس هپاتیت B را تکثیر می­نماید و حساسیت آن در حدود 100 ذره ویروس در هر میلی­لیتر خون است که نزدیک به سه برابر حساس­تر از روش الایزای متداول در سازمان انتقال خون است. همچنین در نمونه­های بالینی، نتایج آزمون PCR کاملاً با نتایج تأیید شده سازمان انتقال خون کاشان مطابقت داشت. آزمون طراحی شده، فاقد نتایج مثبت کاذب بود که علاوه بر جلوگیری از حذف داوطلبین سالم اهدای خون، در کاهش هزینه­های سازمان هم می­تواند نقش به سزایی داشته باشد. بنابراین به نظر می­رسد بتوان آن را جایگزین روش جاری غربالگری این ویروس نمود که اولاً هزینه انجام آن بسیار پایین­تر می­باشد و ثانیاً بخشی از واجدین شرایط، از اهدای خون منع نمی­گردند.

واژه های کلیدی: واکنش زنجیره­ای پلی­مرازی ، الایزا، هپاتیت B

* نویسنده مسئول، تلفن: 03155913045 ، پست الکترونیکی: r.nakhaei@kashanu.ac.ir

مقدمه

 

بیماری هپاتیت B یکی از مشکلات عمده سلامت در دنیا و کشور ایران بوده و عامل یکی از شدیدترین عفونتهای ویروسی کبدی در جهان می­باشد (8). این ویروس هر ساله مسئول مرگ حدود یک تا دو میلیون نفر در سراسر جهان است (16) و تخمین زده می­شود که حدود 300 میلیون ناقل هپاتیت B در سراسر جهان (به جز افرادی که از وضعیت خود آگاهی ندارند) وجود دارد (3 و 14). ویروس هپاتیت B باعث بیماری هپاتیت مزمن، سیروز کبدی و سرطان کبد می­شود (14). هپاتیت B می­تواند از طریق تزریق خون منتقل شود. این عفونت در موارد حاد منجر به مرگ و میر و در موارد مزمن می­تواند منجر به هپاتیت مزمن، سیروز کبدی و کارسینومای سلولهای کبدی شود (9). انتقال HBV از طریق تزریق خون نقش عمده­ای را در شیوع این ویروس در سراسر جهان در چند دهه گذشته ایفاء کرده است و هنوز هم به عنوان یک تهدید در کشورهای در حال توسعه که دارای شیوع بیشتری هستند به حساب می­آید (12). به گفته سازمان بهداشت جهانی (WHO شیوع هپاتیت B در بین اهداکنندگان خون در سال 2015 در کشورهای توسعه یافته 02/0 درصد، کشورهای در حال توسعه 64/0 درصد و کشورهای کمتر توسعه یافته 59/3 درصد تخمین زده می شود (17).

بررسی حضور آنتی ژن سطحی S (Hepatitis B surface antigen، HBsAg) شایع­ترین روش جهت شناسایی ویروس هپاتیت B است. اگر چه در اوایل آلودگی می­تواند جواب منفی کاذب ایجاد کند اما یک تا 3 ماه بعد از آلودگی با ویروس، تشخیص دقیق­تری را ارائه می­دهد (14). در بسیاری از کشورهای پیشرفته از آزمون آزمون اسیدهای نوکلئیک (Nucleic acid test، NAT) به همراه آزمونهای سرولوژیکی جهت شناسایی بهتر ویروس HBV و دیگر عوامل عمده ویروسی مثل Hepatitis C virus (HCV) و Human immunodeficiency virus (HIV) در راستای افزایش ایمنی خون استفاده می­شود. در خصوص بیماری هپاتیت B در حال پیشرفت، استفاده از DNAی هپاتیت B به جای HBs Ag به تشخیص سریع­تر و دقیق­تری می­انجامد که می­تواند باعث جلوگیری از انتقال HBV به واسطه تزریق خونهای دارای عفونت نهفته هپاتیت B، یا خونهای دارای ویروس هپاتیت B با آنتی ژن سطحی S تغییر یافته شود (12).

عفونت مزمن HBV  به تداوم حضور HBs Ag به همراه ژنومHBV  بیش از 6 ماه در سرم بیمار گفته می­شود. حدود 80 درصد افراد با عفونت مزمن به دلیل عدم بروز علائم از بیماری خود آگاهی ندارند. علاوه بر این، تعداد کمی از افراد HBs Ag منفی دارای عفونت نهفتهHBV هستند که این افراد دارای HBV DNA در کبد هستند اما ژنوم ویروس ممکن است در سرم آنها وجود نداشته باشد در حالی که شاخصهای سرولوژیکی مثل HBs Ag و Anti-HBc می­تواند مثبت یا منفی باشد (14). عفونت نهفته Occult hepatitis B virus infection  (OBI) به حضور HBV DNA در سرم یا کبد شخص بیمار با شاخص آنتی ژن سطحی S منفی گفته می­شود و معمولاً در این هنگام میزان HBV DNA در سرم کمتر ازIU/ml200 می­باشد (12).

بدون شک از مهم­ترین اهداف سازمان انتقال خون بررسی هر چه دقیق­تر حضور پاتوژنهای بیماری­زا از جمله عفونتهای حاد هپاتیت می­باشد. که با وجود غربالگری خونهای اهدایی از نظر هپاتیت B سازمان انتقال خون شاهد حضور این ویروس در خونهای انتقالی می باشد. در این مطالعه سعی شد آزمون PCR طراحی شده با آزمون الایزای سازمان انتقال خون، مورد مقایسه قرار گیرد.

مواد و روشها

نمونه­ها: یک نمونه خونی دارای ویروس با بار مشخص (یک میلیارد ذره در هر ml) از آزمایشگاه تخصصی ویروس شناسی کیوان (تهران، خیابان شهید بهشتی، بعد از سینما آزادی به طرف خیابان ولی عصر، پلاک 498، طبقه همکف) به عنوان هدیه دریافت شد. همچنین از تعداد 20 فردی که قبلاً توسط سازمان انتقال خون کاشان به عنوان مبتلای قطعی تشخیص داده شده بودند و 300 نفر از بین مراجعه کنندگان به سازمان ظرف یک ماه که به صورت تصادفی سیستماتیک انتخاب شدند و همچنین 20 بیمار تالاسمی و 30 بیمار دیالیزی که در زمره دریافت کنندگان دایمی خون از سازمان هستند، نمونه گیری انجام گردید.

بررسی حضور آنتی ژن S ویروس هپاتیت B: جهت انجام آزمون الایزا برای ویروس HBV از کیت Murex HBs Ag Version 3 که در سازمان انتقال خون استفاده می­شود و توسط دستگاه اتوماسیون داوینچی (Davinci) ساخت کشور فرانسه استفاده شد. این آزمایش بر روی سرم انجام گرفت. جهت به دست آوردن سرم از لوله ژل­دار Vacuum collection system (VACUTEST KIMA، ایتالیا) استفاده شد بدین ترتیب که خون به طور مستقیم توسط این لوله­ها جمع­آوری گردید و پس از گذشت زمان 30 دقیقه از خون­گیری در دمای اتاق، لوله­ها در دور rpm 2000 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شدند. سپس سرم از بخش بالای ژل لوله جمع­آوری گردید.

استخراج DNA: طبق  روش کار کیت استخراج اسید نوکلئیک ( (Nucleic acid extraction kitبا نام تجاری RIBO-prep شرکت AmpliSens، DNA مورد نیاز از پلاسمای اهداکنندگان و بیماران تهیه شد. به منظور استخراج DNA از پلاسمای خون استفاده گردید. جهت تهیه پلاسما از لوله­های EDTAK2 Tube PET (Narang، چین) استفاده شد. بدین منظور نمونه­های خون به لوله­های جمع­آوری انتقال داده شد و به خوبی تکان داده شد تا با ماده ضد انعقاد مخلوط گردد. سپس به مدت 5 دقیقه در rpm 2000 و دمای اتاق سانتریفیوژ شد و پلاسما برداشت گردید.

DNAی استخراج شده توسط بررسی جذب نوری در طول موج 280 تعیین کمیت، و با بررسی نسبت جذب 260 به 280 تعیین کیفیت گردید.

طراحی آغازگر: طراحی پرایمر بر اساس ناحیه با حداکثر همولوژی ژنوم این ویروس در بین کلیه توالیهای گزارش شده پایگاه نوکلئوتید در NCBI با تکیه بر توالیهای مربوط به ایران و کشورهای همسایه انجام گرفت. به منظور یافتن این ناحیه، پس از به دست آوردن توالیهای تک­تک این ژنومها از نرم­افزار ClustalW جهت انجام همردیفی چندگانه استفاده شد. توالی پرایمرهای طراحی شده در زیر ذکر شده است:

HBV forward Primer: 5ʹ-TTG TCC TCC AAC TTG TCC TG-3ʹ

HBV reverse Primer: 5ʹ-CCA ATA CCA CAT CAT CCA TAT AGC -3ʹ

پرایمر پیش­رو منطبق بر موقعیت 346 تا 365 ژنوم ویروس

و پرایمر برگشتی در موقعیت 757 تا 734 ژنوم ویروس است.

انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز: واکنش PCR با غلظت 1X از بافر PCR، mM 5/2 از MgCl2، mM 2/0 از هر کدام از dNTPها، pM 4/0 از هر کدام از پرایمرها، 1U از آنزیم Taq DNA polymerase شرکت سیناژن و در حجم 20 میکرولیتر انجام گرفت.

برنامه PCR یک مرحله  5 دقیقه­ای در دمای 95 درجه سانتی گراد جهت جدا شدن اولیه رشته­ها، و 35 چرخه شامل مرحله واسرشت در دمای 95 درجه سانتی­گراد به مدت 30 ثانیه، مرحله اتصال در دمای 4/59 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، مرحله طویل شدن در دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت 45 ثانیه و در پایان یک مرحله 10 دقیقه­ای دمای پیشروی نهایی در 72 درجه سانتی گراد قرار داده شد. سپس محصولات PCR با مادهFluoro Dye DNA Fluorescent Loading Dye رنگ آمیزی و در ژل آگارز 1درصد الکتروفورز شدند. طول آمپلیگون bp 412 است. نتیجه کارتوسط دستگاه GEL DOC مشاهده شد. در تمامی واکنشها از نمونه کنترل مثبت (تهیه شده از آزمایشگاه تخصصی ویروس شناسی کیوان) استفاده گردید.

Real-Time PCR: به منظور بررسی صحت نتایج PCR نمونه­هایی که نتایج آنها با آزمون الایزا مغایرت داشت از آزمون Real-Time PCR استفاده گردید. این آزمایش در آزمایشگاه آریا آزما (قم، میدان سعدی، ساختمان کیمیا) و با استفاده از کیت Geneproof (GeneProof، روسیه)، بر اساس دستورالعمل کیت و توسط کارکنان همان آزمایشگاه انجام گردید.

آزمون حساسیت: به منظور تعیین سطح حساسیت کیت مورد استفاده، هم از سرم (الایزا) و هم از خون کامل (PCR) نمونه مثبت رقتهای متوالی تهیه و آزمونهای الایزا و PCR بر روی آنها انجام  شد.

نتایج

به منظور تعیین سطح حساسیت کیت الایزای مورد استفاده، رقتهای 10/1 تا 1.000.000/1 تهیه شد و با قرائت جذب و مقایسه با پارامتر cut-off همچنان مثبت بود. در ادامه 10 نمونه با رقتهای 1.000.000/1 تا 10.000.000/1 تهیه شد و نهایتاً مشخص گردید که کیت Murex  تا رقت 3.000.000/1 به حضور HBs Ag حساس است.

در آزمون الایزا از 300 نمونه مجهول مراجعه کننده به سازمان انتقال خون، 295 مورد فاقد واکنش و 5 مورد حساس اعلام شد که این 5 نمونه وارد مرحله آزمون تأییدی شدند که با استفاده از دو آزمون HBc Ab  وHBs Ag Confirmatory Test در نهایت تنها یک مورد به عنوان نمونه مثبت، تأیید شد. در مورد بیماران تالاسمی و دیالیزی کلیه نمونه­ها منفی بود (جدول1).

 

جدول 1- نتایج آزمون الایزا HBs Ag در نمونه­های مورد بررسی

 

تعداد کل افراد مورد بررسی

تعداد افراد الایزا مثبت

داوطلبین سالم اهداء کننده خون

300

5

بیماران همودیالیزی

30

0

بیماران مبتلا به تالاسمی

20

0

بیماران HBs Ag مثبت

20

20

 

نتیجه واکنش PCR برای 300 داوطلب سالم اهداء کننده­ی خون، یک مورد مثبت و برای کلیه­ی افراد دیالیزی و تالاسمی منفی شد (جدول 2). از 20 نمونه­ی HBs Ag مثبت گزارش شده توسط سازمان در سال­های قبل، 18 مورد تأیید شد اما 2 مورد منفی نشان داده شد (شکل 1).

 

جدول 2- نتایج آزمون PCR در نمونه­های مورد مطالعه

 

تعداد کل افراد مورد بررسی

تعداد افراد  HBV DNA  مثبت

داوطلبین سالم اهداء کننده خون

300

1

بیماران همودیالیزی

30

0

بیماران مبتلا به تالاسمی

20

0

بیماران HBs Ag  مثبت

20

18

 

 

شکل 1- الکتروفورز محصول PCR قطعه 412 جفت بازی از ژن S ویروس HBV: از سمت چپ تصویر چاهک 1 کنترل مثبت. چاهک 2 کنترل منفی چاهک 11 نشانگر وزن مولکولی 100 bp (SMOBIO). چاهک 4 و 7: نمونه­های HBV-DNA منفی. سایر چاهکها نمونه­های مثبت شناسایی شده توسط PCR.

 

جهت اطمینان از صحت نتایج، 2 نمونه منفی به همراه 2 نمونه مثبت در بخش مولکولی آزمایشگاه رازی قم توسط Real-Time PCR با کیت تجاری Gene Proof که دقت آن تا 10 کپی در هر میلی لیتر بود  تکرار  شد  و  نتایج  تأیید

گردید (شکل 2).

 

 

شکل2- نتیجه آزمون Real-Time PCR برای نمونه­های مثبت:  H3 (نمودار زرد رنگ) و  H6(نمودار سبز رنگ) که از چرخه 36 به بعد مثبت شدن آن با اوج گرفتن نمودار نمایان می­شود و نمونه­های منفی) H2  نمودار آبی) و H5 (نمودار بنفش) که بدون تغییر تا انتها ادامه دارند.

 

در بررسی حساسیت آزمون طراحی شده بر اساس تعداد ذرات ویروس موجود در سرم خون با تهیه رقتهای مختلف از DNA، تا 10 میلیون بار رقت قابل شناسایی بود که با توجه به غلظت نمونه مثبت، تا 100 ذره ویروس در هر میلی لیتر خون (چاهک 8) توسط آزمون طراحی شده قابل شناسایی است. نتیجه آزمون در شکل 3 قابل مشاهده است.

 

 

شکل 3- الکتروفورز محصول PCR قطعه 412 جفت بازی از ژن S ویروس HBV: از سمت چپ تصویر چاهک 1 : نشانگر وزن مولکولی 100 bp (SMOBIO).چاهک 2 تا 8 نمونه کنترل مثبت به ترتیب با رقتهای 1 تا 7-10 بار با فواصل ده برابری رقیق شده­اند.

 

به منظور ارزیابی اختصاصی بودن روش به کار رفته جهت شناسایی ویروس HBV، از ژنوم سه ویروس DNAیی­ شامل سایتومگالوویروسCMV))، ویروس هرپس سیمپلکس  (HSV)و ویروس اپشتن-بار (EBV) استفاده شد که نتایج نشان می­داد هیچ کدام از این سه ویروس با این پرایمرهای طراحی شده تکثیر نمی­شوند (داده­ها نشان داده نشده است).

از محصول PCR  نمونه­های مثبت مقدار 3µl روی ژل آگارز 1 درصد الکتروفورز شد و پس از تأیید اندازه باند مربوطه، جهت تعیین توالی به شرکت 1st BASE مالزی فرستاده شد. ﺗﻮالیهای ارﺳﺎﻟﻲ ﺑﻌﺪ از ﻋﻤﻞ ﺗﻌﻴﻴﻦ ﺗﻮاﻟﻲ، ﺑﺎ ﺗﻮالیهای ﺛﺒﺖ ﺷﺪه در ﺑﺎﻧﻚ ژﻧﻮﻣﻲ NCBI، بلست (Blast) ﺷﺪ. نتایج حاصل از بلست نشان داد که محصول PCR پرایمرهای طراحی شده، با توالی ژن S ویروس هپاتیت B ثبت شده در پایگاه NCBI، 99 درصد همولوژی دارند.

بحث

هپاتیت B یک بیماری با عامل ویروسی از خانواده هپادنا ویریده می­باشد. این بیماری به عنوان یک مشکل بهداشتی در دنیا و ایران مطرح است. به دلیل انتقال راحت بیماری از راههای مختلف نظیر مخاط، پوست آسیب دیده، مادر به جنین، رفتارهای پرخطر و فقدان شیوع فصلی خاص، بیماری در سراسر دنیا و در تمام سنین قابل مشاهده است. اصلی­ترین راه انتقال بیماری از راه تزریق خون و همچنین تماسهای نزدیک می­باشد. از سال 1960 به بعد جهت تشخیص موارد بیماری از روشهای تشخیص سرولوژیکی مختلف مانند روش الایزا، رادیوایمونواسی، لومینسانس و PCR برای تشخیص و شناسایی این عفونت استفاده شده است که هر کدام از این روشها محاسن و معایبی دارند (1و7). روش الایزا از حساسیت بالایی برخوردار است اما بروز جهش در قسمت مرکزی پروموتور در ناحیه پایین دست HBe Ag و تغییر نوکلئوتید A به G موجب می­گردد که حتی با وجود مقادیر زیادی از ذرات ویروسی در سرم و آلوده بودن فرد، بیشتر کیتهای تشخیصی الایزا قادر به شناسایی این موارد نباشند. بنابراین روش سرولوژیک، روش مناسبی برای پیگیری و کنترل بیماری نیست. روشهایی بر مبنای PCR­ مانند PCR و Nested PCR از حساسیت بالایی نسبت به روشهای سرولوژیک برخوردار بوده و قادر به شناسایی حتی copy/ml 10-1 در نمونه می­باشند. لذا این روشها برای تشخیص و پیگیری عفونت  به خصوص عفونتهای مزمن بسیار مناسب هستند.

آزمون HBs Ag منفی در بیمارانی که از نظر DNAی HBV مثبت هستند، می­تواند دلایل مختلفی داشته باشد. از جمله آنها وقوع جهش در ژن S و یا انجام آزمون در مراحل اولیه عفونت که حتی در صورت آلوده بودن فرد جواب منفی کاذب ایجاد می­شود. آزمون HBs Ag 2 تا 4 هفته بعد از عفونت در سرم مثبت می­شود، در حالی که HBV DNA از هفته اول عفونت مثبت می­گردد.

سازمان انتقال خون، به منظور غربالگری اهداکنندگان از نظر هپاتیت B با استفاده از کیت Murex افراد را دسته بندی می­کند، تعداد زیادی از افراد به این آزمون واکنش نمی­دهند و خون این دسته از افراد به صورت فرآورده­های خونی فاقد شاخصهای ویروسی در اختیار مراکز درمانی قرار می­گیرد (حالت 1). نمونه­های واکنش داده با این کیت از چرخه اهدای خون خارج می­شوند (حالت 2).

سپس به منظور اطمینان یافتن از آلوده بودن نمونه­های واکنش داده با کیت فوق، یکی از آزمونهای تکمیلی زیر انجام می شود:

1) آزمون Confirm (HBs Ag Confirmatory) که برای تأیید حضور آنتی ژن سطحی S هپاتیتB  در نمونه­های سرم یا پلاسما که با کیت Murex HBs Ag مثبت شده، به کار می­رود.

2) آزمون Anti-Hbc : مدتی پس از آلودگی، تیتر Anti-Hbc در خون فرد مبتلا افزایش یافته و ممکن است تا پایان عمر حتی پس از بهبودی ثابت بماند.

 در هر حال افرادی که آزمون تکمیلی آنها مثبت شود بیمار تلقی شده و جهت مشاوره به پزشک معرفی می­شوند. به دلایل ذکر شده برای هر آزمون، پزشک مربوطه جهت اطمینان از حضور ویروس در بدن و بررسی مقدار تیتر ویروس به منظور شروع درمان، Real-time PCR را پیشنهاد می­دهد و در صورت بالا بودن نسخه­های ویروس، درمان را شروع می­نماید. این فرآیندها علاوه بر زمان­بر بودن و افزایش هزینه، معایب دیگری نیز دارند.

ممکن است افرادی باشند که به Murex Hbs Ag  پاسخ منفی بدهند اما DNA ویروس و Anti-Hbc در آنها مثبت باشد که در این صورت افراد بیمار از غربالگری سازمان عبور کرده و خون آلوده وارد سیستم انتقال خون شده به افراد نیازمند به دریافت خون تزریق می­شود و بدین ترتیب باعث انتشار این بیماری خواهد شد. در این صورت با استفاده از روشهای مولکولی می­توان حضور ویروس را تأیید نمود. از سوی دیگر ممکن است افرادی باشند که بهبود یافته باشند و دیگر ویروسی در بدن آنها نباشد اما به دلیل حساسیت بالای کیت مورد استفاده به عنوان بیمار معرفی شوند و از چرخه اهداء خون حذف گردند. بنابراین اگر در ابتدا به جای انجام آزمون سرولوژیک الایزا آزمون PCR­ انجام شود، در یک مرحله می­توان به حضور یا عدم حضور ویروس در افراد پی برد. بنابراین افرادی تحت عنوان مثبت کاذب از چرخه اهداء خون خارج نمی­شوند یا با خونهای آلوده درمجموعه دهندگان خون باقی نمی­مانند.

در پژوهش حاضر نیز مزیت آزمون PCR بر الایزا تأیید شد چرا که که از بین 5 نمونه واکنش داده در Murex Hbs Ag تنها یک نمونه در مرحله دوم با آزمونهای تکمیلی مثبت اعلام شد. این در حالی است که با واکنش PCR در یک مرحله، همان یک نمونه تشخیص داده شد. بنابراین 4 نمونه مثبت کاذب در عین سالم بودن از چرخه اهداء خارج می­شوند و با وجود تمام هزینه­هایی که سازمان در قبال این افراد صرف می­نماید اما این اهداکنندگان را از دست می­دهد و این خود سالانه خسارت هنگفتی را به سازمان تحمیل می­نماید.

در این مطالعه، نمونه الایزا منفی که با آزمون PCR مثبت تعیین شود، یا به اصطلاح عفونت هپاتیت مخفی، یافت نشد. اما در مطالعات زیر که در داخل و خارج کشور در سالهای اخیر روی خونهای اهدایی انجام شده چنین مواردی اتفاق افتاده است. پورآذر و همکاران در سال 2005 روی  545 نمونه خون اهداشده که از نظر HBs Ag  منفی بودند آزمون anti-HBc و HBV DNA انجام دادند که 43 نفر (8 درصد) anti-HBc مثبت و از این 43 نفر 5 نفر HBV DNA مثبت بودند (11). بهبهانی و همکاران در سال 2005 روی 2000  نمونه خون اهدایی که HBs Ag آنها منفی گزارش شده بود آزمون anti-HBc انجام دادند که 131 مورد (55/6 درصد) مثبت و از این تعداد 16 مورد (2/12 درصد) HBV DNA مثبت بودند (2). واعظ جلیلی در تحقیقی در سال 2011 روی 1000 نمونه خون اهداء شده که HBs Ag آنها منفی بود آزمون anti-HBc انجام داد که 80 نمونه (8 درصد) مثبت و از این 80 نمونه 50 درصد دارای HBV DNA  بودند (15). هنینگ در سال 2002 از میان 14251 اهداء کننده بار اول، 216 مورد (25/1 درصد) که  anti-HBc مثبت داشتند. 205 نمونه مورد آزمون HBV DNA قرار گرفتند که 17 مورد مثبت بود (5). کلینمن در سال 2003 روی 395 نمونه خون HBs Ag منفی آزمون PCR انجام داد که 4 مورد (7/3 درصد) مثبت و حاوی HBV DNA بود (6).

حصونا و همکارانش در مطالعه ای که در سال 2011 در مصر روی 5410 نمونه خون اهداء شده که  HBsAg آنها منفی گزارش شده و سالم تشخیص داده شده بودند آزمون HBV DNA انجام دادند که در نهایت 48 مورد (9/0 درصد) از این نمونه ها مثبت بودند (4). در پژوهشی که اخیراً توسط اولوئینکا در نیجریه روی 429 اهداء کننده خون انجام شد 72 مورد (17 درصد) HBV DNA به عنوان عفونت نهفته خون تشخیص داده شد (10). زیانلین یه و همکارانش نیز در مطالعه­ای روی 1033 اهداء کننده خون مراجعه کننده به مرکز اهدای خون شنژن در جنوب چین در سال 2014 آزمون anti-HBc و HBV DNA انجام دادند که از این تعداد 14 مورد دارای عفونت نهفته HBV  بودند (18).

در این پژوهش غربالگری HBV DNA روی گیرندگان خون و فرآورده­های خونی که بیماران تالاسمی وهمودیالیزی می­باشند انجام داده شد و مورد مثبتی مشاهده نگردید که یک دلیل آن را می­توان واکسینه بودن این بیماران در برابر HBV دانست. در مطالعه­ای که توسط زهره شریفی در سال 2009 در مرکز انتقال خون تهران بر روی 99 کودک تالاسمی صورت گرفت نتایج حاصل با نتایج این پژوهش همخوانی داشت (13). این افراد در 3 نوبت واکسن نوترکیب دریافت کرده بودند. به دلیل این که بیماران تالاسمی مکررا تزریق خون دارند، لذا از گروههای پرخطر محسوب می­شوند. در این بررسی از روش الایزا و Nested PCR جهت بررسی عفونت هپاتیت B استفاده گردید. از 99 کودک، 89 نفر بعد از واکسیناسیون از نظر HBs Ab مثبت بوده، اما در بررسی با روش Nested PCR از نظر وجود HBV DNA تمام 99 نفر منفی بودند و مورد مثبتی یافت نگردید (13).

در مجموع، آزمون PCR طراحی شده در این پژوهش در مطالعات مقدماتی توانست با حساسیت بالاتر نسبت کیت تجاری الایزای سازمان انتقال خون و با اختصاصیت کامل، نمونه­های آلوده به ویروس هپاتیت B را تشخیص دهد. بنابراین به نظر می­رسد اگر مطالعات تکمیلی به خصوص درباره اختصاصیت آن علیه سایر پاتوژنها تأیید گردد می تواند جایگزین الایزا گردد و در نتیجه هزینه­ها را کاهش دهد و تنها با یک مرحله آزمایش وجود ویروس را در نمونه تأیید نماید. به علاوه از حذف بی دلیل اهداء کنندگان مجاز جلوگیری به عمل آید.

1- Alavian, S.M., Keyvani, H., Rezaei, M., Ashayeri, N. and Sadeghi, H.M., 2006. Preliminary report of hepatitis B virus genotype prevalence in Iran. World journal of gastroenterology, 12(32), p.5211.

2- Behzad-Behbahani, A., Mafi-Nejad, A., Tabei, S.Z., Lankarani, K.B., Rashidi, M, Rasouli, M., Pourabbas, B., Torab, A. and Salah, A.R., 2015. Indication of anti-HBc antibody screening and HBV-DNA detection in diagnosing latent hepatitis B virus infection. Iranian Journal of Medical Sciences, 30(1), pp.28-33.

3- Gulia, S.P., Panda, S., Sitaramam, E. and Reddy, K.P., 2011. Seroprevalence of Hepatitis B Virus infection among blood donors in local population. Internet. J. Pathol, 12(1).

4- Hassuna, N.A., Mohamed, Z.M., Eleuoon, S.M.A. and Hamid, M.A., 2015. Prevalence of Hepatitis B Virus (HBV), Hepatitis C Virus (HCV) Infection and their Co-infection among Blood Donors in Minia Governorate, Egypt. British Journal of Medicine & Medical Research, 5(8), pp.987-993.

5- Hennig, H., Puchta, I., Luhm, J., Schlenke, P., Goerg, S. and Kirchner, H., 2002. Frequency and load of hepatitis B virus DNA in first-time blood donors with antibodies to hepatitis B core antigen. Blood, 100(7), pp.2637-2641.

6- Kleinman, S.H., Kuhns, M.C., Todd, D.S., Glynn, S.A., McNamara, A., DiMarco, A., Study, F.T.R.E.D. and Busch, M.P., 2003. Frequency of HBV DNA detection in US blood donors testing positive for the presence of anti‐HBc: implications for transfusion transmission and donor screening. Transfusion, 43(6), pp.696-704.

7- Kluwer W. 2010, HBV vaccine Side Effects, Drug Information, Medical Journal, 7, pp.103-105.

8- Lavanchy D., 2004. Hepatitis B virus epidemiology, disease burden, treatment, and current and emerging prevention and control measures. Journal Viral Hepatology, 11, pp.97-107.

9- Nwobegahay, J.M., Njukeng, P.A., Kengne, M. and Roger, C., 2016. Prevalence of Hepatitis B virus infection among blood donors at the Yaounde Military Hospital, Cameroon. Microbiology Research International. 4(2), pp.6-10.

10- Oluyinka, O.O., Van Tong, H., Tien, S.B., Fagbami, A.H., Adekanle, O., Ojurongbe, O., Bock, C.T., Kremsner, P.G. and Velavan, T.P., 2015. Occult hepatitis B virus infection in Nigerian blood donors and hepatitis B virus transmission risks. PloS one, 10(7), p.e0131912.

11- Pourazar, A., Salehi, M., Jafarzadeh, A., Kazemi Arababadi, M., Oreizi, F. and Shariatinezhad, K., 2005. Detection of HBV DNA in HBsAg negative normal blood donors. Iranian Journal of Immunology, 2(3), pp.172-176.  

12- Romanò, L., Velati, C., Cambiè, G., Fomiatti, L., Galli, C., Zanetti, A.R. and SIMTI study group for HBV infection among first-time blood donors, 2013. Hepatitis B virus infection among first-time blood donors in Italy: prevalence and correlates between serological patterns and occult infection. Blood Transfus, 11(2), pp.281-288.

13- Sharifi, Z., Milani, S. and Shooshtari, M.M., 2010. Study on efficacy of hepatitis B immunization in vaccinated beta-thalassemia children in Tehran. Iranian journal of pediatrics, 20(2), p.211.

14- Sosa-Jurado, F., Rosas-Murrieta, N.H., Guzman-Flores, B., Zempoaltecalt, C.P., Torres, A.P.S., Rosete, L.R., Bernal-Soto, M., Marquez-Dominguez, L., Melendez-Mena, D., Torres, M.A.M. and Delgado, M.T.L., 2016. Prevalence of Serologic Hepatitis B Markers in Blood Donors From Puebla, Mexico: The Association of Relatively High Levels of Anti-Core Antibodies With the Detection of Surface Antigen and Genomic DNA. Hepatitis Monthly, 16(6):e36942.

15- Vaezjalali, M., Rashidpour, S., Rezaee, H., Hajibeigi, B., Zeidi, M., Gachkar, L., Aghamohamad, S., Najafi, R. and Goudarzi, H., 2013. Hepatitis B viral DNA among HBs antigen negative healthy blood donors. Hepatitis monthly, 13(3): e6590.

16- WHO, 2013 WHO urges governments to act on hepatitis threat [Internet]. WHO. Available from: http://www.who.int/mediacentre /news/releases/2013/hepatitis_threat_20130724/en/.

17- WHO, 2015. Media Centre. Blood safety and availability. [Internet]. WHO. Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets /fs279/en/.

18- Ye, X., Li, T., Xu, X., Du, P., Zeng, J., Zhu, W., Yang, B., Li, C. and Allain, J.P., 2016. Characterisation and follow-up study of occult hepatitis B virus infection in anti-HBc-positive qualified blood donors in southern China. Blood transfusion= Trasfusione del sangue, pp.1-7.