نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشجوی دکتری دانشگاه گیلان
2 استادیار بیوشیمی گروه زیست شناسی دانشکده علوم دانشگاه گیلان
3 عضو هیئت علمی/دانشگاه تربیت مدرس
4 عضو هیئت علمی/دانشگاه گیلان
چکیده
پروتئازهای خانواده ترمولیزین زیر مجموعهای از سوپر فامیلی متالوپروتئازهای روی میباشند. این خانواده دارای یک یون روی بوده که نقش مهمی در عملکرد آنزیم داشته و همچنین شامل تعداد متفاوتی کلسیم بوده که در پایداری آنها موثر است. عملکرد آنزیمهای این خانواده به حرکتهای کانفورماسیونی ویژهی جایگاه فعال بستگی دارد. جایگاه فعال در این خانواده بین دو دمین انتهای آمینو و انتهای کربوکسی واقع شده و پیشنهاد شده است که این خانواده در هنگام کاتالیز متحمل حرکت hinge-bending شده که منجر به بسته و باز شدن شکاف جایگاه فعال شده و احتمال بروز تغییرات ساختاری را در حین فرآیند کاتالیز مطرح میسازد. در این مطالعه فعالیت آنزیمی ترمولیزین در مقایسه با الاستاز حاصل از سودوموناس آئروجینوزا مورد بررسی قرار گرفته و تغییرات ساختاری آنزیمها با استفاده از شبیهسازی مولکولی مطالعه گردید. نتایج نشان داد که از یک طرف، ترمولیزین به دلیل کاهش زاویه لولا نسبت به الاستاز دارای تمایل بیشتری نسبت به سوبسترا بوده و از طرف دیگر، بازتر بودن دهانه جایگاه فعال در الاستاز نشاندهنده آزادی حرکت بیشتر باقی-ماندههای کاتالیتیک در الاستاز و در نتیجه بالاتر بودن ثابت سرعت کاتالیتیک می باشد. در مجموع، کارآیی کاتالیتیک دو آنزیم در دمای 60 درجه تفاوت چندانی را نشان نمیدهد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
The relationship of angle between N- and C-terminal domains and the activity of thermolysin and elastase
نویسنده [English]
2 assistant professor in the field of biochemistry
چکیده [English]
Thermolysin- like proteases (TLPs) belong to subset of Zn-metalloproteases superfamily. The family includes a zinc ion which plays a critival role in the function of enzyme and some different calcium ions to improve stability of the structure. The enzyme function of this family depends on specific conformational motions of active site. The active site in this family is located between N-terminal and C-terminal domain and it has been proposed that TLPs endure a hinge-bending motion during catalysis resulting in “closure” and “opening” of the active-site cleft and raise the probability of structural changes during catalytic process. In this study, the activity of thermolysin compared with elastase achieved from Pseudomonas aeruginosa was investigated and structural changes of the enzymes were investigated by molecular dynamics simulation. The results disclosed that, on one hand- due to reduced hinge-angle- thermolysin tends to greater affinity to the substrate, however, the open mouth of active site represents more freedom of movements of catalytic residues in elastase and therefore catalytic rate constant (kcat) is higher. In general, catalytic efficiency of two enzymes does not reveal much difference at 60 °C.
کلیدواژهها [English]
ارتباط زاویه بین دمینهای انتهای آمینو و انتهای کربوکسی با فعالیت آنزیمی ترمولیزین و الاستاز
عبدالعلی وارسته1، سید محسن اصغری1*، مجید تقدیر2 و محمودرضا آقامعالی1
1 رشت، دانشگاه گیلان، دانشکده علوم پایه
2 تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی
تاریخ دریافت: 10/5/95 تاریخ پذیرش: 21/6/95
چکیده
پروتئازهای خانواده ترمولیزین زیر مجموعهای از سوپر فامیلی متالوپروتئازهای روی میباشند. این خانواده دارای یک یون روی بوده که نقش مهمی در عملکرد آنزیم داشته و همچنین شامل تعداد متفاوتی کلسیم بوده که در پایداری آنها مؤثر است. عملکرد آنزیمهای این خانواده به حرکتهای کانفورماسیونی ویژه جایگاه فعال بستگی دارد. جایگاه فعال در این خانواده بین دو دمین انتهای آمینو و انتهای کربوکسی واقع شده و پیشنهاد شده است که این خانواده در هنگام کاتالیز متحمل حرکت hinge-bending شده که منجر به بسته و باز شدن شکاف جایگاه فعال شده و احتمال بروز تغییرات ساختاری را در حین فرآیند کاتالیز مطرح می سازد. در این مطالعه فعالیت آنزیمی ترمولیزین در مقایسه با الاستاز حاصل از سودوموناس آئروجینوزا مورد بررسی قرار گرفته و تغییرات ساختاری آنزیمها با استفاده از شبیهسازی مولکولی مطالعه گردید. نتایج نشان داد که از یک طرف، ترمولیزین به دلیل کاهش زاویه لولا نسبت به الاستاز دارای تمایل بیشتری نسبت به سوبسترا بوده و از طرف دیگر، بازتر بودن دهانه جایگاه فعال در الاستاز نشاندهنده آزادی حرکت بیشتر باقیماندههای کاتالیتیک در الاستاز و در نتیجه بالاتر بودن ثابت سرعت کاتالیتیک می باشد. در مجموع، کارآیی کاتالیتیک دو آنزیم در دمای 60 درجه تفاوت چندانی را نشان نمیدهد.
واژه های کلیدی: ترمولیزین، فعالیت آنزیمی، زاویه لولا، شبیهسازی دینامیک مولکولی.
* نویسنده مسئول، تلفن: 01333333647، پست الکترونیکی: sm_asghari@guilan.ac.ir
مقدمه
پروتئازهای خانواده ترمولیزین متعلق به سوپرفامیلی متالوپروتئازهای روی میباشند. عملکرد بهینه این آنزیمها در pH خنثی بوده و دارای یک یون روی هستند که برای فعالیت آنزیم ضروری میباشد (11). این خانواده از آنزیمها تعداد متفاوتی کلسیم ساختاری داشته که در پایداری آنها حائز اهمیت است (1، 7 و 15). در آنزیمهای این خانواده جایگاه فعال بین دو دمین انتهای آمینو و انتهای کربوکسی واقع شده است و به نظر میرسد که جایگاه فعال آنزیم در حالت عدم اتصال به مهارکننده، بازتر از حالت متصل به مهارکننده میباشد. این تفاوت احتمال بروز تغییرات ساختاری طی فرآیند کاتالیز را مطرح میسازد (9). این جا به جایی آشکار دمینها خمش زاویه لولا (hinge-bending) نام دارد. این فرآیند شامل چرخش یک دمین نسبت به دمین دیگر است که در نتیجه خمشدن یک هلیکس بین دمینی اتفاق میافتد. این خمش به صورتی است که زاویه لولا در هنگام اتصال سوبسترا به آنزیم کمتر از حالت عدم اتصال به نظر میرسد (9، 10، 16 و 17). میزان خمش زاویه لولا در آنزیمهای مختلف خانواده ترمولیزین متفاوت گزارش شده است و بیشترین تفاوت آن به اندازه 16 درجه گزارش شده است (9).
ترمولیزین (EC 3.4.24.27) یک متالوپروتئاز ترموفیل بوده و از باکتری باسیلوس ترموپروتئولیتیکوس به دست میآید. این آنزیم برای فعالیت به یک یون روی و برای پایداری ساختمانی به 4 یون کلسیم نیاز دارد (8 و 12) و تمایل به هیدورلیز پیوندهای پپتیدی در محل آمینواسیدهای آبگریز دارد (3). الاستاز سودوموناس آئروجینوزا یک متالوپروتئاز خنثی و دارای یک اتم روی کاتالیتیک است(2). ساختار سوم مولکول الاستاز مشابه ترمولیزین بوده و حدود 28 درصد همسانی توالی آمینواسیدی در این دو پروتئین وجود دارد (شکل1). تقریباً تمام باقیماندههای جایگاه فعال آن که با سوبسترا میانکنش دارند در دو پروتئین یکسان هستند. دو پروتئاز از دو دمین انتهای آمینو که غنی از صفحات بتا و انتهای کربوکسی که غنی از صفحات آلفا می باشد، تشکیل شدهاند (14).
در مطالعه حاضر، فعالیت آنزیمی ترمولیزین و الاستاز بر روی سوبسترای کازئین در دمای 60 درجه سانتیگراد مورد مقایسه قرار گرفت. از سوی دیگر ساختار جایگاه فعال دو آنزیم، پس از شبیه سازی دینامیک مولکولی در دمای 60 درجه سانتیگراد، از نظر زاویه لولا مورد مقایسه و ارزیابی قرار گرفته است.
مواد و روشها
مواد: آنزیم ترمولیزین از شرکت سیگما (St. Louis, MO. USA)، الاستاز به صورت نوترکیب تولید و خالص شد. سایر مواد استفاده شده از شرکت مرک آلمان (Darmstadt, Germany ) خریداری شد.
خالصسازی الاستاز نوترکیب: ژن الاستاز Pseudomonas aeruginosa در pET21a+ کلون شده و در سویه PTCC1430 از باکتری E.coli بیان گردید. به منظور خالصسازی آنزیم از ستون کروماتوگرافی تمایلی نیکل آگارز استفاده گردید. نمونه پروتئینی روی ستونی که توسط بافر شستشو حاوی، فسفات دی هیدروژن سدیم 50 میلیمولار، کلرید سدیم 300 میلیمولار، ایمیدازول 20 میلیمولار با 8 pH به تعادل رسیده بود، برده شد و پس از شستشو با همان بافر، جهت جداسازی پروتئین از ستون، از بافر شستشوی فسفات دی هیدروژن سدیم 50 میلیمولار، کلرید سدیم 300 میلیمولار، ایمیدازول 250 میلیمولار با 8 pH استفاده شد.
سنجش فعالیت کازئینولیتیک: برای تعیین فعالیت پروتئازی از سنجش فعالیت کازئینولیتیک استفاده شد (13). 20 میکرولیتر از محلول آنزیمی به غلظت مشخصی از بافر تریس، کلرید کلسیم و PMSF اضافه شده و سپس مقدار مشخصی از محلول کازئین 1 درصد (وزنی/حجمی) به آن اضافه گردیده و به مدت 10 دقیقه در دمای 60 درجه سانتیگراد انکوبه شد. سپس 250 میکرولیتر محلول تری کلرو استیک اسید (TCA) 10 درصد (وزنی/حجمی) به مخلوط واکنش اضافه شده تا واکنش متوقف شود. پس از گذشت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد، مخلوط واکنش در rpm 14000 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ گردیده و جذب 280 نانومتر محلول رویی به عنوان معیاری از فعالیت آنزیمی در نظر گرفته شد.
ساختار بلور آنزیمهای مربوطه از پایگاه ذخیره اطلاعات PDB با کدهای 1TLX و 1EZM به ترتیب برای ترمولیزین و الاستاز به دست آمد و پس از بررسی، به عنوان ساختار اولیه برای شبیه سازی دینامیک مولکولی مورد استفاده قرار گرفت. مطالعات ساختاری با استفاده از نرمافزارهای Swiss-PDB viewer 4.0.1 و Pymol 1.3 انجام شد.
شبیهسازی دینامیک مولکولی با استفاده از نرم افزار AMBER 12 (5) و به وسیله میدان نیروی ff12sb (6) انجام شد. پروتئین در لایهای از مولکولهای آب TIP3P به ضخامت 8 آنگستروم قرار گرفت و بار سطحی آن نیز با افزودن یونهای سدیم و کلر خنثی گردید. کاهش انرژی روی ساختار با 500 گام و به روش steepest descent انجام گردید. دینامیک مولکولی در سه مرحله و به صورت زیر انجام گرفت. ابتدا دما به تدریج در شرایط حجم ثابت از صفر کلوین تا 333 کلوین در مدت زمان 100 پیکو ثانیه بالا برده شد. در مرحله بعد سیستم به مدت 100 پیکو ثانیه در فشار ثابت به تعادل رسانده شد و در مرحله سوم شبیهسازی، دینامیک مولکولی در فشار ثابت به مدت 10 نانو ثانیه در دمای 333 کلوین انجام شد. نتایج شبیهسازی نیز به صورت ریشه میانگین مجذور انحراف ها (RMSD) و ریشه میانگین مجذور نوسانات (RMSF) مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج
مقایسه فعالیت آنزیمی: نتایج حاصل از فعالیت دو آنزیم، نشاندهنده کارآیی کاتالیتیکی تقریباً برابر دو آنزیم میباشد. همانگونه که در جدول 1 نشان داده شده است، Km ترمولیزین در مقایسه با الاستاز کمتر بوده و از طرف دیگر، kcat الاستاز بیشتر از ترمولیزین میباشد، ولی، کارآیی کاتالیتیکی (kcat/Km) دو آنزیم تقریباً مشابه بوده که بر عملکرد مشابه دو آنزیم در دمای 60 درجه دلالت دارد.
شکل 1- ساختار الاستاز (pdb code:1EZM) (A) و ترمولیزین (pdb code:1TLX) (B). یون روی به رنگ سفید و یون کلسیم به رنگ خاکستری نشان داده شده است.
جدول1- مقایسه پارامترهای سنتیکی ترمولیزین و الاستاز در دمای 60 درجه سانتیگراد.
|
Km (mM) |
kcat (s-1×10-3) |
kcat/Km (mM-1s-1×10-3) |
TLN |
171/0 |
7/128 |
6/752 |
Elastase |
228/0 |
1/176 |
4/772 |
مطالعات شبیهسازی دینامیک مولکولی: شکل 2 نشاندهنده RMSD کربن آلفای مربوط به ترمولیزین و الاستاز در دمای 60 درجه سانتیگراد طی زمان 10 نانوثانیه است. همانگونه که در شکل مشاهده میشود ساختارها طی شبیهسازی به ثبات رسیده و از پایداری قابل قبولی برخوردارند و ساختارهای مورد نظر انحراف قابل ملاحظهای را از ساختار اولیه نشان نمیدهند.
شکل 2- تغییرات RMSD ترمولیزین (تیره) و الاستاز (روشن) در زمان 10 نانوثانیه در دمای 60 درجه سانتیگراد. با توجه به شکل ساختارها پس از گذشت زمان مورد نظر به پایداری رسیده اند.
از طرف دیگر، بررسی رفتار دینامیکی اتمهای کربن آلفا در ساختار، حاوی اطلاعات کافی جهت بررسی حرکتهای مهم در پروتئینها بوده و منعکس کننده حرکتهای کلی ساختار میباشد. بنابراین نوسانات کربنهای آلفا (RMSF) جهت بررسی حرکتها و انعطافپذیری ساختاری در نظر گرفته شد (شکل 3).
بهعلاوه، جدول 2 تغییر زاویه لولا و RMSD نواحی مختلف دو پروتئین را با هم مقایسه میکند. طبق دادههای این جدول، زاویه لولا در ترمولیزین 16 درجه بستهتر از الاستاز میباشد. همچنین، مقادیر RMSD دمین انتهای آمینی 3/2 آنگستروم، دمین انتهای کربوکسی 1/1 آنگستروم و کل دو پروتئین 8/1 آنگستروم میباشد.
شکل 3- نمودار تغییرات RMSF کربن آلفا پروتئینهای ترمولیزین (تیره) و الاستاز (روشن) در زمان 10 نانوثانیه در دمای 60 درجه سانتیگراد.
جدول 2- مقایسه زاویه لولا و RMSD در ترمولیزین و الاستاز.
|
|
RMSD بین اتمهای کربن آلفا در دمینها |
|||
مقایسه |
تغییر زاویه لولا (درجه) |
دمین انتهای آمینی (Å) |
دمین انتهای کربوکسی (Å) |
تغییر کل |
|
TLN vs Elastase |
16 |
3/2 |
1/1 |
8/1 |
|
همچنین، انعطافپذیری زنجیره جانبی باقیماندههای کاتالیتیک دو آنزیم با هم مقایسه گردید. همانگونه که در شکل 4 مشاهده میشود در غالب آمینواسیدها انعطافپذیری زنجیره جانبی در الاستاز بیشتر از ترمولیزین میباشد. هر چند در مواردی مانند آسپاراژین 112 و آلانین 113 انعطافپذیری زنجیرههای جانبی یکسان میباشد.
شکل 4- مقایسه انعطافپذیری زنجیره جانبی آمینواسیدهای کاتالیتیک در ترمولیزین و الاستاز. نمودارهای قرمز مربوط به الاستاز و نمودارهای آبی مربوط به ترمولیزین میباشند. شماره آمینواسیدها بر اساس پروتئین ترمولیزین میباشد.
بحث
در این مطالعه ساختار و فعالیت دو آنزیم ترمولیزین و الاستاز بررسی گردید. بر اساس پارامترهای سنتیکی به دست آمده Km آنزیم ترمولیزین 171/0 و الاستاز 228/0 بوده است. بر این اساس تمایل ترمولیزین برای اتصال به سوبسترا بالاتر میباشد. از سوی دیگر، بررسی زاویه لولا که در برگیرنده جایگاه فعال این آنزیمهاست پیشنهاد میکند که زاویه لولا در آنزیم ترمولیزین به مراتب (به اندازه 16 درجه) بستهتر از زاویه لولا در آنزیم الاستاز است. مطالعات پیشین نشان میدهند که کاهش زاویه لولا موجب کاهش نوسانات در جایگاه فعال میشود (17 و 4) که این مسئله موجب میگردد تعداد ساختارهای متصل شونده به سوبسترا محدودتر شده و اتصال به سوبسترا با راندمان بهتری انجام شود. بنابراین آنزیم ترمولیزین به سبب کاهش زاویه لولا نسبت به الاستاز دارای تمایل بیشتری برای اتصال به سوبسترا میباشد.
همچنین، دادههای سنتیکی نشاندهنده ثابت سرعت کاتالیتیک (kcat) بالاتر آنزیم الاستاز در مقایسه با ترمولیزین بوده است. ثابت سرعت واکنش کاتالیز ارتباط تنگاتنگی با حرکت باقیماندههای کاتالیتیک در جایگاه فعال دارد. بر اساس نتایج حاصل از مقایسه میزان حرکات ستون فقرات پروتئین در محل آمینواسیدهای کاتالیتیک، تقریباً در تمام موارد الاستاز از حرکات بیشتری برخوردار است. از سوی دیگر، همانگونه که اشاره شد، دهانه جایگاه فعال آنزیم در آنزیم الاستاز بازتر از ترمولیزین میباشد. این امر مؤید این است که باقیماندههای کاتالیتیک در الاستاز از آزادی حرکت بیشتری نسبت به ترمولیزین برخوردارند. بنابراین حرکات بیشتر آمینواسیدهای کاتالیتیک موجب گردیده که الاستاز ثابت سرعت کاتالیتیک بیشتری را نشان دهد. در مجموع، با توجه به اینکه کارآیی کاتالیتیک آنزیم متأثر از هر دو پارامتر kcat و Km آنزیم است و با توجه به در نظر گرفتن این یافته که یکی از این دو در الاستاز و دیگری در ترمولیزین مطلوبتر است، کارآیی کاتالیتیک دو پروتئین در دمای 60 درجه سانتیگراد تفاوت چندانی را نشان نمیدهد.