نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 استادیار بیوشیمی گروه زیست شناسی دانشکده علوم دانشگاه گیلان

2 دانشجوی دکتری دانشگاه گیلان

3 عضو هیئت علمی/دانشگاه تربیت مدرس

4 عضو هیئت علمی/دانشگاه گیلان

چکیده

پروتئاز‌های خانواده ترمولیزین زیر مجموعه‌ای از سوپر فامیلی متالوپروتئاز‌های روی می‌باشند. این خانواده دارای یک یون روی بوده که نقش مهمی در عملکرد آنزیم داشته و همچنین شامل تعداد متفاوتی کلسیم بوده که در پایداری آن‌ها موثر است. عملکرد آنزیم‌های این خانواده به حرکت‌های کانفورماسیونی ویژه‌ی جایگاه فعال بستگی دارد. جایگاه فعال در این خانواده بین دو دمین انتهای آمینو و انتهای کربوکسی واقع شده و پیشنهاد شده است که این خانواده در هنگام کاتالیز متحمل حرکت hinge-bending شده که منجر به بسته و باز شدن شکاف جایگاه فعال شده و احتمال بروز تغییرات ساختاری را در حین فرآیند کاتالیز مطرح می‌سازد. در این مطالعه فعالیت آنزیمی ترمولیزین در مقایسه با الاستاز حاصل از سودوموناس آئروجینوزا مورد بررسی قرار گرفته و تغییرات ساختاری آنزیم‌ها با استفاده از شبیه‌سازی مولکولی مطالعه گردید. نتایج نشان داد که از یک طرف، ترمولیزین به دلیل کاهش زاویه لولا نسبت به الاستاز دارای تمایل بیشتری نسبت به سوبسترا بوده و از طرف دیگر، باز‌تر بودن دهانه جایگاه فعال در الاستاز نشان‌دهنده آزادی حرکت بیشتر باقی-مانده‌های کاتالیتیک در الاستاز و در نتیجه بالاتر بودن ثابت سرعت کاتالیتیک می باشد. در مجموع، کارآیی کاتالیتیک دو آنزیم در دمای 60 درجه تفاوت چندانی را نشان نمی‌دهد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The relationship of angle between N- and C-terminal domains and the activity of thermolysin and elastase

نویسنده [English]

  • seyed mohsen asghari 1

1 assistant professor in the field of biochemistry

چکیده [English]

Thermolysin- like proteases (TLPs) belong to subset of Zn-metalloproteases superfamily. The family includes a zinc ion which plays a critival role in the function of enzyme and some different calcium ions to improve stability of the structure. The enzyme function of this family depends on specific conformational motions of active site. The active site in this family is located between N-terminal and C-terminal domain and it has been proposed that TLPs endure a hinge-bending motion during catalysis resulting in “closure” and “opening” of the active-site cleft and raise the probability of structural changes during catalytic process. In this study, the activity of thermolysin compared with elastase achieved from Pseudomonas aeruginosa was investigated and structural changes of the enzymes were investigated by molecular dynamics simulation. The results disclosed that, on one hand- due to reduced hinge-angle- thermolysin tends to greater affinity to the substrate, however, the open mouth of active site represents more freedom of movements of catalytic residues in elastase and therefore catalytic rate constant (kcat) is higher. In general, catalytic efficiency of two enzymes does not reveal much difference at 60 °C.

کلیدواژه‌ها [English]

  • thermolysin
  • enzyme activity
  • Hinge-bending
  • molecular dynamics simulation

ارتباط زاویه بین دمین­های انتهای آمینو و انتهای کربوکسی با فعالیت آنزیمی ترمولیزین و الاستاز

عبدالعلی وارسته1، سید محسن اصغری1*، مجید تقدیر2 و محمودرضا آقامعالی1

1 رشت، دانشگاه گیلان، دانشکده علوم پایه

2 تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی

تاریخ دریافت: 10/5/95                تاریخ پذیرش: 21/6/95

چکیده

پروتئاز­های خانواده ترمولیزین زیر مجموعه­ای از سوپر فامیلی متالوپروتئاز­های روی می­باشند. این خانواده دارای یک یون روی بوده که نقش مهمی در عملکرد آنزیم داشته و همچنین شامل تعداد متفاوتی کلسیم بوده که در پایداری آنها مؤثر است. عملکرد آنزیمهای این خانواده به حرکتهای کانفورماسیونی ویژه جایگاه فعال بستگی دارد. جایگاه فعال در این خانواده بین دو دمین انتهای آمینو و انتهای کربوکسی واقع شده و پیشنهاد شده است که این خانواده در هنگام کاتالیز متحمل حرکت hinge-bending شده که منجر به بسته و باز شدن شکاف جایگاه فعال شده و احتمال بروز تغییرات ساختاری را در حین فرآیند کاتالیز مطرح می سازد. در این مطالعه فعالیت آنزیمی ترمولیزین در مقایسه با الاستاز حاصل از سودوموناس آئروجینوزا مورد بررسی قرار گرفته و تغییرات ساختاری آنزیمها با استفاده از شبیه­سازی مولکولی مطالعه گردید. نتایج نشان داد که از یک طرف، ترمولیزین به دلیل کاهش زاویه لولا نسبت به الاستاز دارای تمایل بیشتری نسبت به سوبسترا بوده و از طرف دیگر، باز­تر بودن دهانه جایگاه فعال در الاستاز نشان­دهنده آزادی حرکت بیشتر باقی­مانده­های کاتالیتیک در الاستاز و در نتیجه بالاتر بودن ثابت سرعت کاتالیتیک می باشد. در مجموع، کارآیی کاتالیتیک دو آنزیم در دمای 60 درجه تفاوت چندانی را نشان نمی­دهد.

واژه های کلیدی: ترمولیزین، فعالیت آنزیمی، زاویه لولا، شبیه­سازی دینامیک مولکولی.

* نویسنده مسئول، تلفن: 01333333647، پست الکترونیکی: sm_asghari@guilan.ac.ir

مقدمه

 

پروتئاز­های خانواده ترمولیزین متعلق به سوپرفامیلی متالوپروتئاز­های روی می­باشند. عملکرد بهینه این آنزیمها در pH خنثی بوده و دارای یک یون روی هستند که برای فعالیت آنزیم ضروری می­باشد (11). این خانواده از آنزیمها تعداد متفاوتی کلسیم ساختاری داشته که در پایداری آنها حائز اهمیت است (1، 7 و 15). در آنزیمهای این خانواده جایگاه فعال بین دو دمین انتهای آمینو و انتهای کربوکسی واقع شده است و به نظر می­رسد که جایگاه فعال آنزیم در حالت عدم اتصال به مهارکننده، بازتر از حالت متصل به مهارکننده می­باشد. این تفاوت احتمال بروز تغییرات ساختاری طی فرآیند کاتالیز را مطرح می­سازد (9). این جا به جایی آشکار دمین­ها خمش زاویه لولا (hinge-bending) نام دارد. این فرآیند شامل چرخش یک دمین نسبت به دمین دیگر است که در نتیجه خم­شدن یک هلیکس بین دمینی اتفاق می­افتد. این خمش به صورتی است که زاویه لولا در هنگام اتصال سوبسترا به آنزیم کمتر از حالت عدم اتصال به نظر می­رسد (9، 10، 16 و 17). میزان خمش زاویه لولا در آنزیمهای مختلف خانواده ترمولیزین متفاوت گزارش شده است و بیشترین تفاوت آن به اندازه 16 درجه گزارش شده است (9).

ترمولیزین (EC 3.4.24.27) یک متالو­پروتئاز ترموفیل بوده و از باکتری باسیلوس ترموپروتئولیتیکوس به دست می­آید. این آنزیم برای فعالیت به یک یون روی و برای پایداری ساختمانی به 4 یون کلسیم نیاز دارد (8 و 12) و تمایل به هیدورلیز پیوند­های پپتیدی در محل آمینو­اسید­های آب­گریز دارد (3). الاستاز سودوموناس آئروجینوزا یک متالوپروتئاز خنثی و دارای یک اتم روی کاتالیتیک است(2). ساختار سوم مولکول الاستاز مشابه ترمولیزین بوده و حدود 28 درصد همسانی توالی آمینواسیدی در این دو پروتئین وجود دارد (شکل1). تقریباً تمام باقی­مانده­های جایگاه فعال آن که با سوبسترا میانکنش دارند در دو پروتئین یکسان هستند. دو پروتئاز از دو دمین انتهای آمینو که غنی از صفحات بتا و انتهای کربوکسی که غنی از صفحات آلفا می باشد، تشکیل شده­اند (14).

در مطالعه حاضر، فعالیت آنزیمی ترمولیزین و الاستاز بر روی سوبسترای کازئین در دمای 60 درجه سانتی­گراد مورد مقایسه قرار گرفت. از سوی دیگر ساختار جایگاه فعال دو آنزیم، پس از شبیه سازی دینامیک مولکولی در دمای 60 درجه سانتی­گراد، از نظر زاویه لولا مورد مقایسه و ارزیابی قرار گرفته است.

مواد و روشها

مواد: آنزیم ترمولیزین از شرکت سیگما (St. Louis, MO. USA)، الاستاز به صورت نوترکیب تولید و خالص شد. سایر مواد استفاده شده از شرکت مرک آلمان (Darmstadt, Germany ) خریداری شد.

خالص­سازی الاستاز نوترکیب: ژن الاستاز Pseudomonas aeruginosa در pET21a+ کلون شده و در سویه PTCC1430 از باکتری E.coli بیان گردید. به منظور خالص­سازی آنزیم از ستون کروماتوگرافی تمایلی نیکل آگارز استفاده گردید. نمونه پروتئینی روی ستونی که توسط بافر شستشو حاوی، فسفات دی هیدروژن سدیم 50 میلی­مولار، کلرید سدیم 300 میلی­مولار، ایمیدازول 20 میلی­مولار با 8 pH به تعادل رسیده بود، برده شد و پس از شستشو با همان بافر، جهت جداسازی پروتئین از ستون، از بافر شستشوی فسفات دی هیدروژن سدیم 50 میلی­مولار، کلرید سدیم 300 میلی­مولار، ایمیدازول 250 میلی­مولار با 8 pH استفاده شد.

سنجش فعالیت کازئینولیتیک: برای تعیین فعالیت پروتئازی از سنجش فعالیت کازئینولیتیک استفاده شد (13). 20 میکرو­لیتر از محلول آنزیمی به غلظت مشخصی از بافر تریس، کلرید کلسیم و PMSF اضافه شده و سپس مقدار مشخصی از محلول کازئین 1 درصد (وزنی/حجمی) به آن اضافه گردیده و به مدت 10 دقیقه در دمای 60 درجه سانتی­گراد انکوبه شد. سپس 250 میکرو­لیتر محلول تری کلرو استیک اسید (TCA) 10 درصد (وزنی/حجمی) به مخلوط واکنش اضافه شده تا واکنش متوقف شود. پس از گذشت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی­گراد، مخلوط واکنش در rpm 14000 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ گردیده و جذب 280 نانومتر محلول رویی به عنوان معیاری از فعالیت آنزیمی در نظر گرفته شد.

ساختار بلور آنزیمهای مربوطه از پایگاه ذخیره اطلاعات PDB با کد­های 1TLX و 1EZM به ترتیب برای ترمولیزین و الاستاز به دست آمد و پس از بررسی، به عنوان ساختار اولیه برای شبیه سازی دینامیک مولکولی مورد استفاده قرار گرفت. مطالعات ساختاری با استفاده از نرم­افزارهای Swiss-PDB viewer 4.0.1 و Pymol 1.3 انجام شد.

شبیه­سازی دینامیک مولکولی با استفاده از نرم افزار AMBER 12 (5) و به وسیله میدان نیروی ff12sb (6) انجام شد. پروتئین در لایه­ای از مولکولهای آب TIP3P به ضخامت 8 آنگستروم قرار گرفت و بار سطحی آن نیز با افزودن یونهای سدیم و کلر خنثی گردید. کاهش انرژی روی ساختار با 500 گام و به روش steepest descent انجام گردید. دینامیک مولکولی در سه مرحله و به صورت زیر انجام گرفت. ابتدا دما به تدریج در شرایط حجم ثابت از صفر کلوین تا 333 کلوین در مدت زمان 100 پیکو ثانیه بالا برده شد. در مرحله بعد سیستم به مدت 100 پیکو ثانیه در فشار ثابت به تعادل رسانده شد و در مرحله سوم شبیه­سازی، دینامیک مولکولی در فشار ثابت به مدت 10 نانو ثانیه در دمای 333 کلوین انجام شد. نتایج شبیه­سازی نیز به صورت ریشه میانگین مجذور انحراف ها (RMSD) و ریشه میانگین مجذور نوسانات (RMSF) مورد بررسی قرار گرفت.

نتایج

مقایسه فعالیت آنزیمی: نتایج حاصل از فعالیت دو آنزیم، نشان­دهنده کارآیی کاتالیتیکی تقریباً برابر دو آنزیم می­باشد. همان­گونه که در جدول 1 نشان داده شده است، Km ترمولیزین در مقایسه با الاستاز کمتر بوده و از طرف دیگر، kcat الاستاز بیشتر از ترمولیزین می­باشد، ولی، کارآیی کاتالیتیکی (kcat/Km) دو آنزیم تقریباً مشابه بوده که بر عملکرد مشابه دو آنزیم در دمای 60 درجه دلالت دارد.

 

 

شکل 1- ساختار الاستاز (pdb code:1EZM) (A) و ترمولیزین (pdb code:1TLX) (B). یون روی به رنگ سفید و یون کلسیم به رنگ خاکستری نشان داده شده است.

جدول1- مقایسه پارامتر­های سنتیکی ترمولیزین و الاستاز در دمای 60 درجه سانتی­گراد.

 

Km (mM)

kcat (s-1×10-3)

kcat/Km

(mM-1s-1×10-3)

TLN

171/0

7/128

6/752

Elastase

228/0

1/176

4/772


مطالعات شبیه­سازی دینامیک مولکولی: شکل 2 نشان­دهنده RMSD کربن آلفای مربوط به ترمولیزین و الاستاز در دمای 60 درجه سانتی­گراد طی زمان 10 نانو­ثانیه است. همان­گونه که در شکل مشاهده می­شود ساختار­ها طی شبیه­سازی به ثبات رسیده و از پایداری قابل قبولی برخوردارند و ساختار­های مورد نظر انحراف قابل ملاحظه­ای را از ساختار اولیه نشان نمی­دهند.

 

 

شکل 2- تغییرات RMSD ترمولیزین (تیره) و الاستاز (روشن) در زمان 10 نانو­ثانیه در دمای 60 درجه سانتی­گراد. با توجه به شکل ساختار­ها پس از گذشت زمان مورد نظر به پایداری رسیده اند.

 

از طرف دیگر، بررسی رفتار دینامیکی اتمهای کربن آلفا در ساختار، حاوی اطلاعات کافی جهت بررسی حرکتهای مهم در پروتئینها بوده و منعکس کننده حرکتهای کلی ساختار می­باشد. بنابراین نوسانات کربنهای آلفا (RMSF) جهت بررسی حرکتها و انعطاف­پذیری ساختاری در نظر گرفته شد (شکل 3).

به­علاوه، جدول 2 تغییر زاویه لولا و RMSD نواحی مختلف دو پروتئین را با هم مقایسه می­کند. طبق داده­های این جدول، زاویه لولا در ترمولیزین 16 درجه بسته­تر از الاستاز می­باشد. همچنین، مقادیر RMSD دمین انتهای آمینی 3/2 آنگستروم، دمین انتهای کربوکسی 1/1 آنگستروم و کل دو پروتئین 8/1 آنگستروم می­باشد.

 

 

شکل 3- نمودار تغییرات RMSF کربن آلفا پروتئینهای ترمولیزین (تیره) و الاستاز (روشن) در زمان 10 نانو­ثانیه در دمای 60 درجه سانتی­گراد.

جدول 2- مقایسه زاویه لولا و RMSD در ترمولیزین و الاستاز.

 

 

RMSD بین اتمهای کربن آلفا در دمین­ها

مقایسه

تغییر زاویه لولا (درجه)

دمین انتهای آمینی (Å)

دمین انتهای کربوکسی (Å)

تغییر کل

TLN vs Elastase

16

3/2

1/1

8/1

           

 

همچنین، انعطاف­پذیری زنجیره جانبی باقی­مانده­های کاتالیتیک دو آنزیم با هم مقایسه گردید. همان­گونه که در شکل 4 مشاهده می­شود در غالب آمینو­اسید­ها انعطاف­پذیری زنجیره جانبی در الاستاز بیشتر از ترمولیزین می‍باشد. هر چند در مواردی مانند آسپاراژین 112 و آلانین 113 انعطاف­پذیری زنجیره­های جانبی یکسان می­باشد.

 

 

شکل 4- مقایسه انعطاف­پذیری زنجیره جانبی آمینو­اسید­های کاتالیتیک در ترمولیزین و الاستاز. نمودار­های قرمز مربوط به الاستاز و نمودار­های آبی مربوط به ترمولیزین می­باشند. شماره آمینو­اسید­ها بر اساس پروتئین ترمولیزین می­باشد.


بحث

در این مطالعه ساختار و فعالیت دو آنزیم ترمولیزین و الاستاز بررسی گردید. بر اساس پارامتر­های سنتیکی به دست آمده Km آنزیم ترمولیزین 171/0 و الاستاز 228/0 بوده است. بر این اساس تمایل ترمولیزین برای اتصال به سوبسترا بالاتر می­باشد. از سوی دیگر، بررسی زاویه لولا که در برگیرنده جایگاه فعال این آنزیمهاست پیشنهاد می­کند که زاویه لولا در آنزیم ترمولیزین به مراتب (به اندازه 16 درجه) بسته­تر از زاویه لولا در آنزیم الاستاز است. مطالعات پیشین نشان می­دهند که کاهش زاویه لولا موجب کاهش نوسانات در جایگاه فعال می­شود (17 و 4) که این مسئله موجب می­گردد تعداد ساختار­های متصل شونده به سوبسترا محدود­تر شده و اتصال به سوبسترا با راندمان بهتری انجام شود. بنابراین آنزیم ترمولیزین به سبب کاهش زاویه لولا نسبت به الاستاز دارای تمایل بیشتری برای اتصال به سوبسترا می­باشد.

همچنین، داده­های سنتیکی نشان­دهنده ثابت سرعت کاتالیتیک (kcat) بالاتر آنزیم الاستاز در مقایسه با ترمولیزین بوده است. ثابت سرعت واکنش کاتالیز ارتباط تنگاتنگی با حرکت باقی­مانده­های کاتالیتیک در جایگاه فعال دارد. بر اساس نتایج حاصل از مقایسه میزان حرکات ستون فقرات پروتئین در محل آمینو­اسید­های کاتالیتیک، تقریباً در تمام موارد الاستاز از حرکات بیشتری برخوردار است. از سوی دیگر، همان­گونه که اشاره شد، دهانه جایگاه فعال آنزیم در آنزیم الاستاز بازتر از ترمولیزین می­باشد. این امر مؤید این است که باقی­مانده­های کاتالیتیک در الاستاز از آزادی حرکت بیشتری نسبت به ترمولیزین برخوردارند. بنابر­این حرکات بیشتر آمینو­اسید­های کاتالیتیک موجب گردیده که الاستاز ثابت سرعت کاتالیتیک بیشتری را نشان دهد. در مجموع، با توجه به این­که کارآیی کاتالیتیک آنزیم متأثر از هر دو پارامتر kcat و Km آنزیم است و با توجه به در نظر گرفتن این یافته که یکی از این دو در الاستاز و دیگری در ترمولیزین مطلوب­تر است، کارآیی کاتالیتیک دو پروتئین در دمای 60 درجه سانتی­گراد تفاوت چندانی را نشان نمی­دهد.

1- اسماعیل نژاد، م.، زین الدینی، م.، مقصودی، ن. 1394. مطالعه اهمیت و نقش اسیدهای آمینه آسپارژین 28 و لیزین 30 فوتوپروتئین اکورین در جذب کلسیم. مجله پژوهش­های سلولی و مولکولی. دوره 28. شماره 4. ص 468-474.

2- صدر ممتاز، ا.، اصغری، س. م. 1394. مطالعات مقایسه‌ای مقاومت پروتئازحاصل ازسودوموناس آئروجینوزا در مقایسه با ترمولیزین حاصل از باسیلوس ترموپروتئولیتیکوس در حلال‌های آلی. مجله پژوهش­های سلولی و مولکولی. دوره 28. شماره 4. ص 560-567.

 

3- Adekoya, O. A., & Sylte, I. 2009. The thermolysin family (M4) of enzymes: therapeutic and biotechnological potential. Chemical biology & drug design, 73(1), 7-16.

4- Asghari, S. M., Pazhang, M., Ehtesham, S., Karbalaei-Heidari, H. R., Taghdir, M., Sadeghizadeh, M., Khajeh, K. 2010. Remarkable improvements of a neutral protease activity and stability share the same structural origins. Protein Engineering Design and Selection, 23(8), 599-606.

5- Case, D., Darden, T., Cheatham III, T., Simmerling, C., Wang, J., Duke, R., Merz, K. 2012. AMBER 12. University of California San Francisco, San Francisco, CA. There is no corresponding record for this reference.

6- Cheatham III, T. E., Cieplak, P., & Kollman, P. A. 1999. A modified version of the Cornell et al. force field with improved sugar pucker phases and helical repeat. Journal of Biomolecular Structure and Dynamics, 16(4), 845-862.

7- Colman, P., Jansonius, J., & Matthews, B. 1972. The structure of thermolysin: an electron density map at 2.3 Å resolution. Journal of molecular biology, 70(3), 701-724.

8- Feder, J., Garrett, L. R., & Wildi, B. S. 1971. Role of calcium in thermolysin. Biochemistry, 10(24), 4552-4556.

9- Holland, D., Tronrud, D., Pley, H., Flaherty, K., Stark, W., Jansonius, J, Matthews, B. 1992. Structural comparison suggests that thermolysin and related neutral proteases undergo hinge-bending motion during catalysis. Biochemistry, 31(46), 11310-11316.

10- Holland, D. R., Hausrath, A. C., Juers, D., & Matthews, B. W. 1995. Structural analysis of zinc substitutions in the active site of thermolysin. Protein Science, 4(10), 1955-1965.

11- Jiang, W., & Bond, J. S. 1992. Families of metalloendopeptidases and their relationships. FEBS letters, 312(2-3), 110-114.

12- Latt, S. A., Holmquist, B., & Vallee, B. L. 1969. Thermolysin: a zinc metalloenzyme. Biochemical and biophysical research communications, 37(2), 333-339.

13- Pazhang, M., Khajeh, K., Ranjbar, B., & Hosseinkhani, S. 2006. Effects of water-miscible solvents and polyhydroxy compounds on the structure and enzymatic activity of thermolysin. Journal of biotechnology, 127(1), 45-53.

14- Rulıšek, L. r., & Vondrášek, J. 1998. Coordination geometries of selected transition metal ions (Co 2+, Ni 2+, Cu 2+, Zn 2+, Cd 2+, and Hg 2+) in metalloproteins. Journal of inorganic biochemistry, 71(3), 115-127.

15- Titani, K., Hermodson, M., Ericsson, L., Walsh, K., & Neurath, H. 1972. Amino-acid sequence of thermolysin. Nature, 238(80), 35-37.

16- Van Aalten, D., Amadei, A., Linssen, A., Eijsink, V., Vriend, G., & Berendsen, H. 1995. The essential dynamics of thermolysin: confirmation of the hinge‐bending motion and comparison of simulations in vacuum and water. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 22(1), 45-54.

17- Veltman, O. R., Eijsink, V. G., Vriend, G., de Kreij, A., Venema, G., & Van den Burg, B. 1998. Probing catalytic hinge bending motions in thermolysin-like proteases by glycine→ alanine mutations. Biochemistry, 37(15), 5305-5311.