نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد گروه به نژادی و بیوتکنولوژی گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه تبریز
2 استادیار گروه به نژادی و بیوتکنولوژی گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه تبریز
چکیده
بدلیل اهمیت و جایگاه گوجه فرنگی در رژیم غذایی انسان، یک سیستم باززایی درون شیشهای تکرار پذیر برای تراریختی ژنتیکی با کاربرد تجاری در آن ضروری است. تقسیم فعال سلولی در زمان تلقیح بافتهای گیاهی با آگروباکتریوم در موفقیت تراریختی نقش بسیار تعیین کنندهای دارد. برای این منظور در این تحقیق اثر پیش تیمار یک اکسین قوی به همراه چند تیمار تنظیم کننده رشد گیاهی دیگر بر اندامزایی دو رقم زراعی گوجه فرنگی شامل گیلاسی و فلات 111 مورد مطالعه قرار گرفت. ریزنمونههای کوتیلدون و هیپوکوتیل هفت روزه در محیط کشت پایه MS تکمیل شده با 3 درصد ساکارز و 6/0 درصد آگار و غلظتهای مختلفی از IAA، NAA و BAP قرار داده شدند. پیش تیمار 2,4-D اثری بر باززایی نداشت و فقط منجر به تشکیل کالوس شد و پس از واکشت این کالوسها در محیط کشتهای حاوی تنظیم کنندههای رشد گیاهی دیگر نیز باززایی مشاهده نشد. بالاترین درصد باززایی در رقم گیلاسی در محیط کشت حاویBAP (3 یا 5/1 میلی گرم بر لیتر) باضافه 1/0 میلی گرم بر لیتر IAA مشاهده شد. بیشترین تعداد شاخساره تشکیل شده از کوتیلدونهای رقم گیلاسی در محیط کشت حاوی BAP (3 یا 5/1 میلی گرم بر لیتر) باضافه 1/0 میلی گرم بر لیتر IAA مشاهده شد. ریشهزایی شاخسارهها در محیط کشت حاوی 2 میلی گرم بر لیتر IBA صورت گرفت.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
The effects of 2,4-D pretreatment and plant growth regulators on tomato (Solanum lycopersicum L.) regeneration
نویسندگان [English]
چکیده [English]
Because of the importance of tomato in the human diet, a reproducible in vitro regeneration system with commercial applications is necessary for its genetic transformation. Active cellular division at the time of inoculation of plant tissues by Agrobacterium, has a crucial role in plant transformation efficiency. To achieving this purpose, the effects of an auxin pretreatment, flowed with other plant growth regulator treatments on tomato organogenesis was investigated. Cotyledon and hypocotyl explants were prepared from seven day seedlings and were placed on MS medium supplemented with 3% sucrose and 0.6% agar and different concentrations of IAA, NAA and BAP. Pretreatment of explants with 2,4-D had no effect on plant regeneration; but lead to callus formation. Calli didn’t produce shoot in other mediums. The highest percentage of regeneration was observed in Cherry cultivar in mediums containing BAP (3 or 1.5 mg/l) + 0.1 mg/l IAA. The highest shoot formation was noted in cotyledon explants of Cherry tomato in MS mediums supplemented with 3 or 1.5 mg/l BAP + 0.1 mg/l IAA. Rooting of shoots was done in medium containing 2 mg/l IBA.
کلیدواژهها [English]
اثر پیش تیمار 2,4-D و تنظیم کنندههای رشد گیاهی بر باززایی گوجه فرنگی
(Solanum lycopersicum L.)
آرزو عزیز خواجه و ابراهیم دورانی*
تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده کشاورزی، گروه به نژادی و بیوتکنولوژی گیاهی
تاریخ دریافت: 18/3/95 تاریخ پذیرش: 16/3/96
چکیده
به دلیل اهمیت و جایگاه گوجه فرنگی در رژیم غذایی انسان، یک سیستم باززایی درون شیشهای تکرار پذیر برای تراریختی ژنتیکی با کاربرد تجاری در آن ضروری است. تقسیم فعال سلولی در زمان تلقیح بافتهای گیاهی با آگروباکتریوم در موفقیت تراریختی نقش بسیار تعیین کنندهای دارد. برای این منظور در این تحقیق اثر پیش تیمار یک اکسین قوی به همراه چند تیمار تنظیم کننده رشد گیاهی دیگر بر اندامزایی دو رقم زراعی گوجه فرنگی شامل گیلاسی و فلات 111 مورد مطالعه قرار گرفت. ریزنمونههای کوتیلدون و هیپوکوتیل هفت روزه در محیط کشت پایه MS تکمیل شده با 3 درصد ساکارز و 6/0 درصد آگار و غلظتهای مختلفی از IAA، NAA و BAP قرار داده شدند. پیش تیمار 2,4-D اثری بر باززایی نداشت و فقط منجر به تشکیل کالوس شد و پس از واکشت این کالوسها در محیط کشتهای حاوی تنظیم کنندههای رشد گیاهی دیگر نیز باززایی مشاهده نشد. بالاترین درصد باززایی در رقم گیلاسی در محیط کشت حاویBAP (3 یا 5/1 میلی گرم بر لیتر) به اضافه 1/0 میلی گرم بر لیتر IAA مشاهده شد. بیشترین تعداد شاخساره تشکیل شده از کوتیلدونهای رقم گیلاسی در محیط کشت حاوی BAP (3 یا 5/1 میلی گرم بر لیتر) به اضافه 1/0 میلی گرم بر لیتر IAA مشاهده شد. ریشهزایی شاخسارهها در محیط کشت حاوی 2 میلی گرم بر لیتر IBA صورت گرفت.
واژههای کلیدی: باززایی، پیش تیمار 2,4-D، کشت بافت، گوجه فرنگی.
* نویسنده مسئول، تلفن: 09143155410، پست الکترونیکی: uliaie@yahoo.com
مقدمه
گوجه فرنگی (Solanum lycopersicum L.) دومین سبزی متداول در دنیا پس از سیب زمینی است؛ که در قرن اخیر محبوبیت استثنایی پیدا کرده و تقریباً در هر کشوری کشت می شود (1). گوجه فرنگی به دلیل تعداد کروموزوم کم (2n=2x=24) و اطلاعات جامعی که در مورد ژنتیک آن وجود دارد، یک گیاه مناسب برای مطالعات آزمایشگاهی است (6). تولید گوجه فرنگی تحت تأثیر تنشهای زیستی و غیر زیستی بسیاری است. از این رو نیاز است تکنیکهای مهندسی ژنتیک این گیاه در جهت تولید ارقام مقاوم به تنشهای زیستی و غیر زیستی توسعه یابند. به عنوان یک بخش اساسی در تولید گیاهان تراریخته، تهیه دستورالعملهای باززایی مؤثر گیاهان ضروری است (27). القای کالوس و باززایی از ریزنمونههای مختلف در گوجه فرنگی گزارش شده و مشخص شده که کالوسزایی و باززایی در این گیاه بستگی به عوامل متعددی از قبیل ژنوتیپ، ریزنمونه، تنظیم کنندههای رشد گیاهی و سن ریز نمونه دارد (10). مطالعات فراوانی برای انتخاب بهترین ریزنمونه در گوجه فرنگی صورت گرفته است ولی نتایج حاصل از آنها بسیار متفاوت بودهاند. به عنوان مثال دوزیامان و همکاران (1994) (8)، و جیانگ و همکاران (2003) (13) برگ را به عنوان بهترین ریزنمونه معرفی کردهاند، در حالی که پلاستیرا و پردیکاریس (1997) (20)، و منگ و همکاران (1998) (17) باززایی خوبی از ریز نمونههای هیپوکوتیل به دست آوردهاند. تنظیم کننده های رشد مختلفی در کشت درون شیشهای گوجه فرنگی به کار گرفته شدهاند، ولی IAA و BAP متداولترین تنظیم کننده ها در کشت بافت گوجه فرنگی بودهاند و ترکیب این دو باززایی از ریزنمونههای گوجه فرنگی را بهبود بخشیده است (21 و 24). از بین سیتوکنینهای Zeatin، BAP و Kin که برای القای جوانههای نا به جا در گوجه فرنگی به کار گرفته شده اند، بالاترین درصد القای جوانههای نا به جا و بیشترین تعداد جوانهها مربوط به محیط کشتهای حاوی Zeatin و کمترین آنها مربوط به محیط کشتهای حاوی Kin بوده؛ در بین اکسینها نیز در محیط کشتهای حاوی IAA نسبت به محیط کشتهای حاوی IBA و NAA درصد القای جوانههای نا به جا و تعداد جوانهها بیشتر بوده است(3 و 27).
باززایی در کشت بافت یا از طریق اندامزایی (القای شاخساره و ریشه) و یا از طریق جنینزایی سوماتیکی صورت میگیرد (14). ترکیبات محیط کشت از قبیل آگار، نیترات نقره، غلظت تنظیم کنندههای رشد و همچنین استفاده از پیش تیمار ریزنمونهها با 2,4-D عوامل تعیین کننده در بازده باززایی گیاه و به تبع آن بازده تولید گیاهان تراریخته است (26). به کارگیری برخی پیش تیمارها میتواند فرآیند باززایی را تسریع یا بهبود بخشد. پیش تیمار ریزنمونههای برگ کدو (Cucurbita pepo L.) با Kin و خربزه (Cucumis melo L.) با 2,4-D موجب بهبود جنینزایی سوماتیکی شده است (15). پیش تیمار 2,4-D در کشت بافتPanax ginseng نیز موجب بهبود جنینزایی سوماتیکی مستقیم از ریزنمونههای TCL(Thin Cell Layer) ، بدون پیمودن مرحله کالوسزایی، شده و در برنج(Oryza sativa L.) موجب اندامزایی مستقیم شده است (18).
هدف از این پژوهش بررسی اثر برخی از تنظیم کنندههای رشد و پیش تیمار 2,4-D بر کالوسزایی و باززایی گوجه فرنگی ارقام گیلاسی و فلات 111 میباشد.
مواد و روشها
این پژوهش در آزمایشگاه کشت بافت گروه بهنژادی و بیوتکنولوژی گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه تبریز انجام شد. بذور گوجه فرنگی ارقام گیلاسی و فلات 111 که از شرکت آذر سبزینه تبریز تهیه شدند، به دلیل عملکرد بالا و بازار پسندی در این آزمایش مورد استفاده قرار گرفتند. بذور در شرایط استریل زیر هود لامینار به مدت 15 دقیقه با هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد ضدعفونی شدند، سپس سه مرتبه و هر بار به مدت سه دقیقه با آب مقطر استریل شستشو داده شدند. بذور استریل برای جوانهزنی در شیشههای استریل حاوی 35 میلی لیتر محیط کشت MS به تعداد 15 بذر در هر شیشه کشت شدند. محیط کشت پایه حاوی نمکهای MS، ویتامینهای B5، 30 گرم بر لیتر ساکارز و 6 گرم بر لیتر آگار بود وpH آن قبل از اتوکلاو روی 7/5 تنظیم شده بود. کشتها در اتاق کشت تحت دمای 2±25 و فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند. پس از هفت روز از آنها برای تهیه ریزنمونههای استریل استفاده شد. ریزنمونههای کوتیلدون (به ابعاد تقریبی 5/0× 7/0 میلی متر) و هیپوکوتیل (به طول تقریبی 1 سانتیمتر) از هر دو رقم تهیه و در تیمارهای یک هفته و دو هفته در محیط کشت MS تکمیل شده با 2 میلی گرم بر لیتر 2,4-Dقرار داده شدند و سپس در محیط کشت MS تکمیل شده با ترکیبی از تنظیم کننده های رشد گیاهی مختلف (جدول 1) واکشت شدند. تیمار شاهد نیز با کشت ریزنمونهها در محیطهای اندام زایی جدول یک فراهم گردید. برای هر تیمار سه تکرار و در هر تکرار شش ریزنمونه در یک پتری دیش در نظر گرفته شد.
کلیه کشتها پس از سه هفته واکشت شدند و بعد از شش هفته درصد باززایی، تعداد شاخساره به ازای هر ریزنمونه و وزن کالوسها یادداشت شد و دادهها پس از بررسی مفروضات، بر اساس آزمایش فاکتوریل با دو فاکتور ریزنمونه و تنظیم کننده رشد گیاهی بر پایه طرح بلوکهای کامل تصادفی با استفاده از نرم افزار SPSS تجزیه و تحلیل گردید و مقایسه میانگین به روش آزمون چند دامنهای دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام شد. به منظور ریشهزایی، شاخسارههای تشکیل شده از ریزنمونه جدا و در محیط کشت MS تکمیل شده با 2 میلی گرم بر لیتر IBA کشت شدند. پس از 10 روز گیاهچههای ریشهدار شده به خاک منتقل شدند و پس از طی مراحل سازگاری به گلخانه انتقال یافتند. بهمنظور سازگار کردن گیاهچهها، آنها در خاک استریل کشت شده و زیر یک پوشش پلاستیکی در اتاق رشد قرار گرفتند. به مرور زمان سوراخهایی در این پوشش پلاستیکی برای جریان یافتن هوا ایجاد شد و پس از 10 روز پوشش پلاستیکی حذف شد. گیاهچهها به مدت یک هفته دیگر در اتاق رشد نگهداری شدند سپس به گلخانه انتقال یافتند.
نتایج و بحث
در پژوهش حاضر، پیش تیمار ریزنمونههای کوتیلدون و هیپوکوتیل هر دو رقم گوجه فرنگی گیلاسی و فلات 111 به مدت یک (شکل 6 الف) و دو هفته (شکل 6 ب) با 2,4-D و سپس واکشت آنها در محیط کشتMS تکمیل شده با تنظیم کنندههای رشد گیاهی (جدول 1)، منجر به کالوسزایی در 100 درصد ریزنمونههای هر دو رقم شد و باززایی مشاهده نشد. نتایج تجزیه و تحلیلهای آماری مشخص کرد که وزن کالوسها در پیش تیمار با 2,4-D به مدت یک هفته متأثر از نوع تنظیم کنندههای رشد گیاهی به کار گرفته شده در محیط کشت بعدی است و بیشترین وزن کالوس مربوط به محیط کشت تکمیل شده با 3 میلی گرم بر لیتر BAP به اضافه1/0 میلی گرم بر لیترNAA با میانگین 8858/1 گرم، و محیط کشت تکمیل شده با 5/1 میلی گرم بر لیتر BAP به اضافه 1/0 میلی گرم بر لیتر NAA با میانگین 0706/2 گرم بود (شکل 1).
شکل 1- میانگین اثر تنظیم کنندههای رشد بر وزن کالوسهای حاصل از ریزنمونههایی که ابتدا به مدت یک هفته با 2 میلی گرم بر لیتر 2,4-D پیش تیمار شده و سپس در محیط کشت حاوی این تنظیم کننده-ها (جدول 1) واکشت شدهاند.
در حالی که در پیش تیمار ریزنمونهها با2,4-D به مدت دو هفته و سپس واکشت آنها در محیط کشت MS تکمیل شده با تنظیم کنندههای رشد گیاهی مختلف، وزن کالوسها تنها از نوع ریزنمونه متأثر شد و بیشترین وزن کالوس مربوط به ریزنمونه کوتیلدون با میانگین 443/0 گرم بود. میانگین وزن کالوسهای مربوط به ریزنمونههای هیپوکوتیل نیز 246/0 گرم بود. پیش تیمار مواد گیاهی با تنظیم کننده های رشد، موجب افزایش میزان باززایی در چندین گونه گیاهی شده است (4 و 28). برای مثال پیش تیمار ریزنمونهها با 2,4-D دربرنج موجب افزایش باززایی شده است (18). طبق نظر چن و همکاران (2001)، اکسین تقسیم و توسعه سلولهای گیاهی را از طریق پروتئین متصل شونده به اکسین ABP1 تنظیم میکند (7). ولی پیش تیمار 2,4-D بر باززایی گوجه فرنگی ارقام گیلاسی و فلات 111 تأثیری نداشت.
نتایج حاصل از تجزیه واریانس داده های مربوط به کشتهای شاهد نشان داد که اثر رقم و اثر متقابل تنظیم کننده رشد گیاهی × ریزنمونه بر درصد باززایی معنیدار است. رقم گیلاسی با میانگین 70 درصد نسبت به رقم فلات 111 با میانگین 444/49 درصد، باززایی بهتری داشت و ریزنمونههای کوتیلدون و هیپوکوتیل کشت شده در محیط کشت MS حاوی 3 میلی گرم بر لیتر BAP به اضافه 1/0 میلی گرم بر لیتر IAA، و ریزنمونه کوتیلدون کشت شده در محیط کشت MS تکمیل شده با 5/1 میلی گرم بر لیتر BAP و 1/0 میلی گرم بر لیتر IAA بیشترین درصد باززایی را داشتند(شکل2).
شکل 2- میانگین اثر متقابل ریزنمونه × تنظیم کننده رشد گیاهی بر درصد باززایی
اثر رقم، ریزنمونه، تنظیم کننده رشد گیاهی و اثرات متقابل آنها بر صفت تعداد شاخساره به ازای هر ریزنمونه معنیدار بود (شکلهای 3، 4 و 5) و مقایسه میانگینها به روش دانکن در سطح احتمال 5 درصد نشان داد که بیشترین تعداد شاخساره باززا شده به ازای هر ریزنمونه مربوط به کوتیلدونهای رقم گیلاسی کشت شده در محیط کشت MS تکمیل شده با 3 یا 5/1 میلی گرم بر لیتر BAP به اضافه 1/0 میلی گرم بر لیتر IAA است. (شکل 6 پ). مطالعات پیشین نشان دادهاند که IAA و BAP تنظیم کنندههای رشد مناسبی در کشت بافت گوجه فرنگی هستند و ترکیب این دو میتواند باززایی از ریزنمونههای گوجه فرنگی را بهبود بخشد (3 و 27) که این مطلب با نتایج پژوهش حاضرمطابقت دارد.
شکل 3- میانگین اثر متقابل رقم × ریزنمونه بر تعداد شاخساره تشکیل شده به ازای هر ریزنمونه
شکل 4- میانگین اثر متقابل رقم × تنظیم کننده رشد گیاهی بر تعداد شاخساره تشکیل شده به ازای هر ریزنمونه
شکل 5- میانگین اثر متقابل ریز نمونه × تنظیم کننده رشد گیاهی بر تعداد شاخساره تشکیل شده به ازای هر ریزنمونه
معمولاً گیاهچهها یا به طور مستقیم (9) و یا پس از تشکیل کالوس اولیه (12) از ریزنمونه، باززا میشوند. در این پژوهش باززایی در هر دو رقم (ارقام گوجه فرنگی گیلاسی و فلات 111) و هر دو ریزنمونه (کوتیلدون و هیپوکوتیل) در محیط کشتهایی که با ترکیبی از یک اکسین (IAA یا NAA) و سیتوکنین (BAP) تکمیل شده بودند پس از طی مرحله کالوسزایی اولیه صورت گرفت. ولی در محیط کشتهایی که فقط دارای 5/0 میلی گرم بر لیتر IAA بودند، باززایی در ریزنمونههای هیپوکوتیل به طور مستقیم (بدون تشکیل کالوس) همراه با تولید ریشه مشاهده شد و ریزنمونههای کوتیلدون فقط تولید ریشه کردند (شکل 6 ج). گزارشات قبلی حاکی از آن است که وجود IAA در محیط کشت گوجه فرنگی باعث ریشهزایی میگردد (11، 16 و 23)، ولی در این پژوهش در حضور IAA علاوه بر ریشههایی که در مراحل اولیه تشکیل شدند، شاخسارههای زیادی پس از چند روز از ریزنمونههای هیپوکوتیل باززا شدند که قبلاً در جایی گزارش نشده بود. شاخسارههای تشکیل شده در نهایت از ریزنمونه اصلی جدا شدند و پس از ریشه دار شدن در محیط ریشهزایی حاوی 2 میلی گرم بر لیتر IBA (شکل 6 د) به خاک منتقل شدند (شکل 6 ه) تا پس از طی مراحل سازگاری در محیط بیرون کشت شوند.
گوجه فرنگی دارای اهمیت غذایی و دارویی بالایی است و تنشهای زیستی و غیرزیستی متعددی تولید آن را تحت تأثیر قرار میدهد، از این رو آزمایشگاههای بسیاری در حال انجام تحقیقاتی برای دستورزی کیفیت مواد مغذی و تولید ارقام مقاوم به انواع تنشها از طریق تراریختی ژنتیکی هستند. همراه بودن یک سیستم باززایی و انتقال ژن موفق، در مطالعات پایه و کاربردی بسیار کمک کننده است. یک سیستم باززایی درون شیشهای مطلوب برای تراریختی ژنتیکی مؤثر با کاربرد تجاری ضروری است (2). گزارشاتی مبنی بر نقش مثبت پیش تیمار 2,4-D در افزایش میزان باززایی وجود دارد (15 و 18). بسیاری از ژنوتیپهای گوجه فرنگی پاسخهای منحصر به فردی نسبت به تنظیم کنندههای رشد گیاهی در طول باززایی میدهند (16). تغییر در مقدار و نوع تنظیم کنندههای رشد گیاهی، درصد باززایی و تعداد شاخسارههای تولید شده به ازای هر ریزنمونه را تحت تأثیر قرار میدهد (20). بعلاوه باززایی در ژنوتیپهای مختلف نیاز به ریزنمونههای خاصی دارد، این تفاوتها قابل توارث هستند و میتوانند به وسیله ژنهای سیتوپلاسمی و هستهای کنترل شوند (19). در این پژوهش اثر پیش تیمار 2,4-D و تنظیم کنندههای رشد گیاهی بر باززایی دو رقم گوجه فرنگی گیلاسی و فلات 111 مورد مطالعه قرار گرفت. پیش تیمار 2,4-D تأثیری بر باززایی نداشت و فقط منجر به کالوسزایی شد. عملکرد رقم گیلاسی نسبت به رقم فلات 111 بهتر بود؛ به طوری که بیشترین درصد باززایی مربوط به کوتیلدونها و هیپوکوتیلهای رقم گیلاسی، و بیشترین تعداد شاخساره تشکیل شده مربوط به ریزنمونههای کوتیلدون رقم گیلاسی بود که در محیط کشتهای حاوی 3 یا 5/1 میلی گرم بر لیتر BAP به اضافه 1/0 میلی گرم برلیتر IAA کشت شده بودند. گزارشهای مختلفی مبنی بر نقش مؤثر IBA در القای ریشه در ژنوتیپهای مختلف گوجه فرنگی وجود دارد (5، 22 و 25) بنابراین برای ریشهدار کردن شاخسارههای تشکیل شده از غلظت 2 میلی گرم بر لیتر IBA استفاده شد.
جدول 1- تنظیم کنندههای رشد گیاهی به کار رفته در محیط کشت اندامزایی
هورمون (mg/l) |
شماره ترکیب |
||
NAA |
IAA |
BAP |
|
0 1/0 0 1/0 0 |
1/0 0 1/0 0 5/0 |
3 3 5/1 5/1 0 |
1 2 3 4 5 |
شکل 6- الف: کالوسهای حاصل از پیش تیمار 2,4-D به مدت یک هفته، ب: کالوسهای حاصل از پیش تیمار 2,4-D به مدت دو هفته، پ: باززایی از کوتیلدون و هیپوکوتیل گوجه فرنگی رقم گیلاسی در محیط کشت حاوی BAP و IAA، ج: باززایی از ریزنمونههای هیپوکوتیل و ریشهزایی ازریزنمونههای کوتیلدون در محیط کشت حاوی 5/0 میلی گرم بر لیتر IAA، د: ریشهزایی در محیط کشت دارای 2 میلی گرم بر لیتر IBA، ه: انتقال گیاهچههای ریشهدار به خاک.