نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد گروه به نژادی و بیوتکنولوژی گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه تبریز

2 استادیار گروه به نژادی و بیوتکنولوژی گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه تبریز

چکیده

بدلیل اهمیت و جایگاه گوجه فرنگی در رژیم غذایی انسان، یک سیستم باززایی درون شیشه‌ای تکرار پذیر برای تراریختی ژنتیکی با کاربرد تجاری در آن ضروری است. تقسیم فعال سلولی در زمان تلقیح بافت‌های گیاهی با آگروباکتریوم در موفقیت تراریختی نقش بسیار تعیین کننده‌ای دارد. برای این منظور در این تحقیق اثر پیش تیمار یک اکسین قوی به همراه چند تیمار تنظیم کننده رشد گیاهی دیگر بر اندام‌زایی دو رقم زراعی گوجه فرنگی شامل گیلاسی و فلات 111 مورد مطالعه قرار گرفت. ریزنمونه‌های کوتیلدون و هیپوکوتیل هفت روزه در محیط کشت پایه MS تکمیل شده با 3 درصد ساکارز و 6/0 درصد آگار و غلظت‌های مختلفی از IAA، NAA و BAP قرار داده شدند. پیش تیمار 2,4-D اثری بر باززایی نداشت و فقط منجر به تشکیل کالوس شد و پس از واکشت این کالوس‌ها در محیط کشت‌های حاوی تنظیم کننده‌های رشد گیاهی دیگر نیز باززایی مشاهده نشد. بالاترین درصد باززایی در رقم گیلاسی در محیط کشت حاویBAP (3 یا 5/1 میلی گرم بر لیتر) باضافه 1/0 میلی گرم بر لیتر IAA مشاهده شد. بیشترین تعداد شاخساره تشکیل شده از کوتیلدون‌های رقم گیلاسی در محیط کشت حاوی BAP (3 یا 5/1 میلی گرم بر لیتر) باضافه 1/0 میلی گرم بر لیتر IAA مشاهده شد. ریشه‌زایی شاخساره‌ها در محیط کشت حاوی 2 میلی گرم بر لیتر IBA صورت گرفت.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The effects of 2,4-D pretreatment and plant growth regulators on tomato (Solanum lycopersicum L.) regeneration

نویسندگان [English]

  • Arezou Aziz Khajeh 1
  • Ebrahim Dorani 2

چکیده [English]

Because of the importance of tomato in the human diet, a reproducible in vitro regeneration system with commercial applications is necessary for its genetic transformation. Active cellular division at the time of inoculation of plant tissues by Agrobacterium, has a crucial role in plant transformation efficiency. To achieving this purpose, the effects of an auxin pretreatment, flowed with other plant growth regulator treatments on tomato organogenesis was investigated. Cotyledon and hypocotyl explants were prepared from seven day seedlings and were placed on MS medium supplemented with 3% sucrose and 0.6% agar and different concentrations of IAA, NAA and BAP. Pretreatment of explants with 2,4-D had no effect on plant regeneration; but lead to callus formation. Calli didn’t produce shoot in other mediums. The highest percentage of regeneration was observed in Cherry cultivar in mediums containing BAP (3 or 1.5 mg/l) + 0.1 mg/l IAA. The highest shoot formation was noted in cotyledon explants of Cherry tomato in MS mediums supplemented with 3 or 1.5 mg/l BAP + 0.1 mg/l IAA. Rooting of shoots was done in medium containing 2 mg/l IBA.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Regeneration
  • tissue culture
  • Tomato
  • 2
  • 4-D pretreatment

اثر پیش تیمار 2,4-D و تنظیم کننده­های رشد گیاهی بر باززایی گوجه فرنگی

(Solanum lycopersicum L.)

آرزو عزیز خواجه و ابراهیم دورانی*

تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده کشاورزی، گروه به نژادی و بیوتکنولوژی گیاهی

تاریخ دریافت: 18/3/95                تاریخ پذیرش: 16/3/96

چکیده

به دلیل اهمیت و جایگاه گوجه فرنگی در رژیم غذایی انسان، یک سیستم باززایی درون شیشه­ای تکرار پذیر برای تراریختی ژنتیکی با کاربرد تجاری در آن ضروری است. تقسیم فعال سلولی در زمان تلقیح بافتهای گیاهی با آگروباکتریوم در موفقیت تراریختی نقش بسیار تعیین کننده­ای دارد. برای این منظور در این تحقیق اثر پیش تیمار یک اکسین قوی به همراه چند تیمار تنظیم کننده رشد گیاهی دیگر بر اندام­زایی دو رقم زراعی گوجه فرنگی شامل گیلاسی و فلات 111 مورد مطالعه قرار گرفت. ریزنمونه­های کوتیلدون و هیپوکوتیل هفت روزه در محیط کشت پایه MS تکمیل شده با 3 درصد ساکارز و 6/0 درصد آگار و غلظتهای مختلفی از IAA، NAA و BAP قرار داده شدند. پیش تیمار 2,4-D اثری بر باززایی نداشت و فقط منجر به تشکیل کالوس شد و پس از واکشت این کالوسها در محیط کشتهای حاوی تنظیم کننده­های رشد گیاهی دیگر نیز باززایی مشاهده نشد. بالاترین درصد باززایی در رقم گیلاسی در محیط کشت حاویBAP  (3 یا 5/1 میلی گرم بر لیتر) به اضافه 1/0 میلی گرم بر لیتر IAA مشاهده شد. بیشترین تعداد شاخساره تشکیل شده از کوتیلدونهای رقم گیلاسی در محیط کشت حاوی BAP (3 یا 5/1 میلی گرم بر لیتر) به اضافه 1/0 میلی گرم بر لیتر IAA مشاهده شد. ریشه­زایی شاخساره­ها در محیط کشت حاوی 2 میلی گرم بر لیتر IBA صورت گرفت.

واژه­های کلیدی: باززایی، پیش تیمار 2,4-D، کشت بافت، گوجه فرنگی.

* نویسنده مسئول، تلفن: 09143155410، پست الکترونیکی: uliaie@yahoo.com

مقدمه

 

گوجه فرنگی (Solanum lycopersicum L.) دومین سبزی متداول در دنیا پس از سیب زمینی است؛ که در قرن اخیر محبوبیت استثنایی پیدا کرده و تقریباً در هر کشوری کشت می شود (1). گوجه فرنگی به دلیل تعداد کروموزوم کم (2n=2x=24) و اطلاعات جامعی که در مورد ژنتیک آن وجود دارد، یک گیاه مناسب برای مطالعات آزمایشگاهی است (6). تولید گوجه فرنگی تحت تأثیر تنشهای زیستی و غیر زیستی بسیاری است. از این رو نیاز است تکنیکهای مهندسی ژنتیک این گیاه در جهت تولید ارقام مقاوم به تنشهای زیستی و غیر زیستی توسعه یابند. به عنوان یک بخش اساسی در تولید گیاهان تراریخته، تهیه دستورالعملهای باززایی مؤثر گیاهان ضروری است (27). القای کالوس و باززایی از ریزنمونه­های مختلف در گوجه فرنگی گزارش شده و مشخص شده که کالوس­زایی و باززایی در این گیاه بستگی به عوامل متعددی از قبیل ژنوتیپ، ریزنمونه، تنظیم کننده­های رشد گیاهی و سن ریز نمونه دارد (10). مطالعات فراوانی برای انتخاب بهترین ریزنمونه در گوجه فرنگی صورت گرفته است ولی نتایج حاصل از آنها بسیار متفاوت بوده­اند. به عنوان مثال دوزیامان و همکاران (1994) (8)، و جیانگ و همکاران (2003) (13) برگ را به عنوان بهترین ریزنمونه معرفی کرده­اند، در حالی که پلاستیرا و پردیکاریس (1997) (20)، و منگ و همکاران (1998) (17) باززایی خوبی از ریز نمونه­های هیپوکوتیل به دست آورده­اند. تنظیم کننده های رشد مختلفی در کشت درون شیشه­ای گوجه فرنگی به کار گرفته شده­اند، ولی IAA و BAP متداول­ترین تنظیم کننده ها در کشت بافت گوجه فرنگی بوده­اند و ترکیب این دو باززایی از ریزنمونه­های گوجه فرنگی را بهبود بخشیده است (21 و 24). از بین سیتوکنینهای Zeatin، BAP و Kin که برای القای جوانه­های نا به جا در گوجه فرنگی به کار گرفته شده اند، بالاترین درصد القای جوانه­های نا به جا و بیشترین تعداد جوانه­ها مربوط به محیط کشتهای حاوی Zeatin و کمترین آنها مربوط به محیط کشتهای حاوی Kin بوده؛ در بین اکسینها نیز در محیط کشتهای حاوی IAA نسبت به محیط کشتهای حاوی IBA و NAA درصد القای جوانه­های نا به جا و تعداد جوانه­ها بیشتر بوده است(3 و 27).

باززایی در کشت بافت یا از طریق اندام­زایی (القای شاخساره و ریشه) و یا از طریق جنین­زایی سوماتیکی صورت می­گیرد (14). ترکیبات محیط کشت از قبیل آگار، نیترات نقره، غلظت تنظیم کننده­های رشد و همچنین استفاده از پیش تیمار ریزنمونه­ها با 2,4-D عوامل تعیین کننده در بازده باززایی گیاه و به تبع آن بازده تولید گیاهان تراریخته است (26). به کارگیری برخی پیش تیمارها می­تواند فرآیند باززایی را تسریع یا بهبود بخشد. پیش تیمار ریزنمونه­های برگ کدو (Cucurbita pepo L.) با Kin و خربزه (Cucumis melo L.) با 2,4-D موجب بهبود جنین­زایی سوماتیکی شده است (15). پیش تیمار 2,4-D در کشت بافتPanax ginseng  نیز موجب بهبود جنین­زایی سوماتیکی مستقیم از ریزنمونه­های TCL(Thin Cell Layer) ، بدون پیمودن مرحله کالوس­زایی، شده و در برنج(Oryza sativa L.)  موجب اندام­زایی مستقیم شده است (18).

هدف از این پژوهش بررسی اثر برخی از تنظیم کننده­های رشد و پیش تیمار 2,4-D بر کالوس­زایی و باززایی گوجه فرنگی ارقام گیلاسی و فلات 111 می­باشد.

مواد و روشها

این پژوهش در آزمایشگاه کشت بافت گروه به­نژادی و بیوتکنولوژی گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه تبریز انجام شد. بذور گوجه فرنگی ارقام گیلاسی و فلات 111 که از شرکت آذر سبزینه تبریز تهیه شدند، به دلیل عملکرد بالا و بازار پسندی در این آزمایش مورد استفاده قرار گرفتند. بذور در شرایط استریل زیر هود لامینار به مدت 15 دقیقه با هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد ضدعفونی شدند، سپس سه مرتبه و هر بار به مدت سه دقیقه با آب مقطر استریل شستشو داده شدند. بذور استریل برای جوانه­زنی در شیشه­های استریل حاوی 35 میلی لیتر محیط کشت MS  به تعداد 15 بذر در هر شیشه کشت شدند. محیط کشت پایه حاوی نمکهای MS، ویتامینهای B5، 30 گرم بر لیتر ساکارز و 6 گرم بر لیتر آگار بود وpH  آن قبل از اتوکلاو روی 7/5 تنظیم شده بود. کشتها در اتاق کشت تحت دمای 2±25 و فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند. پس از هفت روز از آنها برای تهیه ریزنمونه­های استریل استفاده شد. ریزنمونه­های کوتیلدون (به ابعاد تقریبی 5/0× 7/0 میلی متر) و هیپوکوتیل (به طول تقریبی 1 سانتیمتر) از هر دو رقم تهیه و در تیمارهای یک هفته و دو هفته در محیط کشت MS تکمیل شده با 2 میلی گرم بر لیتر  2,4-Dقرار داده شدند و سپس در محیط کشت MS تکمیل شده با ترکیبی از تنظیم کننده های رشد گیاهی مختلف (جدول 1) واکشت شدند. تیمار شاهد نیز با کشت ریزنمونه­ها در محیطهای اندام زایی جدول یک فراهم گردید. برای هر تیمار سه تکرار و در هر تکرار شش ریزنمونه در یک پتری دیش در نظر گرفته شد.

کلیه کشتها پس از سه هفته واکشت شدند و بعد از شش هفته درصد باززایی، تعداد شاخساره به ازای هر ریزنمونه و وزن کالوسها یادداشت شد و داده­ها پس از بررسی مفروضات، بر اساس آزمایش فاکتوریل با دو فاکتور ریزنمونه و تنظیم کننده رشد گیاهی بر پایه طرح بلوکهای کامل تصادفی با استفاده از نرم افزار SPSS تجزیه و تحلیل گردید و مقایسه میانگین به روش آزمون چند دامنه­ای دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام شد. به منظور ریشه­زایی، شاخساره­های تشکیل شده از ریزنمونه جدا و در محیط کشت MS تکمیل شده با 2 میلی گرم بر لیتر IBA کشت شدند. پس از 10 روز گیاهچه­های ریشه­دار شده به خاک منتقل شدند و پس از طی مراحل سازگاری به گلخانه انتقال یافتند. به­منظور سازگار کردن گیاهچه­ها، آنها در خاک استریل کشت شده و زیر یک پوشش پلاستیکی در اتاق رشد قرار گرفتند. به مرور زمان سوراخهایی در این پوشش پلاستیکی برای جریان یافتن هوا ایجاد شد و پس از 10 روز پوشش پلاستیکی حذف شد. گیاهچه­ها به مدت یک هفته دیگر در اتاق رشد نگهداری شدند سپس به گلخانه انتقال یافتند.

نتایج و بحث

در پژوهش حاضر، پیش تیمار ریزنمونه­های کوتیلدون و هیپوکوتیل هر دو رقم گوجه فرنگی گیلاسی و فلات 111 به مدت یک (شکل 6 الف) و دو هفته (شکل 6 ب) با 2,4-D و سپس واکشت آنها در محیط کشتMS  تکمیل شده با تنظیم کننده­های رشد گیاهی (جدول 1)، منجر به کالوس­زایی در 100 درصد ریزنمونه­های هر دو رقم شد و باززایی مشاهده نشد. نتایج تجزیه و تحلیلهای آماری مشخص کرد که وزن کالوسها در پیش تیمار با 2,4-D به مدت یک هفته متأثر از نوع تنظیم کننده­های رشد گیاهی به کار گرفته شده در محیط کشت بعدی است و بیشترین وزن کالوس مربوط به محیط کشت تکمیل شده با 3 میلی گرم بر لیتر BAP به اضافه1/0 میلی گرم بر لیترNAA  با میانگین 8858/1 گرم، و محیط کشت تکمیل شده با 5/1 میلی گرم بر لیتر BAP به اضافه 1/0 میلی گرم بر لیتر NAA با میانگین 0706/2 گرم بود (شکل 1).

 

 

 

شکل 1- میانگین اثر تنظیم کننده­های رشد بر وزن کالوسهای حاصل از ریزنمونه­هایی که ابتدا به مدت یک هفته با 2 میلی گرم بر لیتر 2,4-D پیش تیمار شده و سپس در محیط کشت حاوی این تنظیم کننده-ها (جدول 1) واکشت شده­اند.

 

در حالی که در پیش تیمار ریزنمونه­ها با2,4-D  به مدت دو هفته و سپس واکشت آنها در محیط کشت MS تکمیل شده با تنظیم کننده­های رشد گیاهی مختلف، وزن کالوسها تنها از نوع ریزنمونه متأثر شد و بیشترین وزن کالوس مربوط به ریزنمونه کوتیلدون با میانگین 443/0 گرم بود. میانگین وزن کالوسهای مربوط به ریزنمونه­های هیپوکوتیل نیز 246/0 گرم بود. پیش تیمار مواد گیاهی با تنظیم کننده های رشد، موجب افزایش میزان باززایی در چندین گونه گیاهی شده است (4 و 28). برای مثال پیش تیمار ریزنمونه­ها با 2,4-D دربرنج موجب افزایش باززایی شده است (18). طبق نظر چن و همکاران (2001)، اکسین تقسیم و توسعه سلولهای گیاهی را از طریق پروتئین متصل شونده به اکسین ABP1 تنظیم می­کند (7). ولی پیش تیمار 2,4-D بر باززایی گوجه فرنگی ارقام گیلاسی و فلات 111 تأثیری نداشت.

نتایج حاصل از تجزیه واریانس داده های مربوط به کشتهای شاهد نشان داد که اثر رقم و اثر متقابل تنظیم کننده رشد گیاهی × ریزنمونه بر درصد باززایی معنی­دار است. رقم گیلاسی با میانگین 70 درصد نسبت به رقم فلات 111 با میانگین 444/49 درصد، باززایی بهتری داشت و ریزنمونه­های کوتیلدون و هیپوکوتیل کشت شده در محیط کشت MS حاوی 3 میلی گرم بر لیتر BAP به اضافه 1/0 میلی گرم بر لیتر IAA، و ریزنمونه کوتیلدون کشت شده در محیط کشت MS تکمیل شده با 5/1 میلی گرم بر لیتر BAP و 1/0 میلی گرم بر لیتر IAA بیشترین درصد باززایی را داشتند(شکل2).

 

 

شکل 2- میانگین اثر متقابل ریزنمونه × تنظیم  کننده رشد گیاهی بر درصد باززایی

 

اثر رقم، ریزنمونه، تنظیم کننده رشد گیاهی و اثرات متقابل آنها بر صفت تعداد شاخساره به ازای هر ریزنمونه معنی­دار بود (شکلهای 3، 4 و 5) و مقایسه میانگینها به روش دانکن در سطح احتمال 5 درصد نشان داد که بیشترین تعداد شاخساره باززا شده به ازای هر ریزنمونه مربوط به کوتیلدونهای رقم گیلاسی کشت شده در محیط کشت MS تکمیل شده با 3 یا 5/1 میلی گرم بر لیتر BAP به اضافه 1/0 میلی گرم بر لیتر IAA است. (شکل 6 پ). مطالعات پیشین نشان داده­اند که IAA و BAP تنظیم کننده­های رشد مناسبی در کشت بافت گوجه فرنگی هستند و ترکیب این دو می­تواند باززایی از ریزنمونه­های گوجه فرنگی را بهبود بخشد (3 و 27) که این مطلب با نتایج پژوهش حاضرمطابقت دارد.

 

 

شکل 3- میانگین اثر متقابل رقم × ریزنمونه بر تعداد شاخساره تشکیل شده به ازای هر ریزنمونه

 

شکل 4- میانگین اثر متقابل رقم × تنظیم کننده رشد گیاهی بر تعداد شاخساره تشکیل شده به ازای هر ریزنمونه

 

شکل 5- میانگین اثر متقابل ریز نمونه × تنظیم کننده رشد گیاهی بر تعداد شاخساره تشکیل شده به ازای هر ریزنمونه

 

معمولاً گیاهچه­ها یا به طور مستقیم (9) و یا پس از تشکیل کالوس اولیه (12) از ریزنمونه، باززا می­شوند. در این پژوهش باززایی در هر دو رقم (ارقام گوجه فرنگی گیلاسی و فلات 111) و هر دو ریزنمونه (کوتیلدون و هیپوکوتیل) در محیط کشتهایی که با ترکیبی از یک اکسین (IAA یا NAA) و سیتوکنین (BAP) تکمیل شده بودند پس از طی مرحله کالوس­زایی اولیه صورت گرفت. ولی در محیط کشتهایی که فقط دارای 5/0 میلی گرم بر لیتر IAA بودند، باززایی در ریزنمونه­های هیپوکوتیل به طور مستقیم (بدون تشکیل کالوس) همراه با تولید ریشه مشاهده شد و ریزنمونه­های کوتیلدون فقط تولید ریشه کردند (شکل 6 ج). گزارشات قبلی حاکی از آن است که وجود IAA در محیط کشت گوجه فرنگی باعث ریشه­زایی می­گردد (11، 16 و 23)، ولی در این پژوهش در حضور IAA علاوه بر ریشه­هایی که در مراحل اولیه تشکیل شدند، شاخساره­های زیادی پس از چند روز از ریزنمونه­های هیپوکوتیل باززا شدند که قبلاً در جایی گزارش نشده بود. شاخساره­های تشکیل شده در نهایت از ریزنمونه اصلی جدا شدند و پس از ریشه دار شدن در محیط ریشه­زایی حاوی 2 میلی گرم بر لیتر IBA (شکل 6 د) به خاک منتقل شدند (شکل 6 ه) تا پس از طی مراحل سازگاری در محیط بیرون کشت شوند.

گوجه فرنگی دارای اهمیت غذایی و دارویی بالایی است و تنشهای زیستی و غیرزیستی متعددی تولید آن را تحت تأثیر قرار می­دهد، از این رو آزمایشگاههای بسیاری در حال انجام تحقیقاتی برای دستورزی کیفیت مواد مغذی و تولید ارقام مقاوم به انواع تنشها از طریق تراریختی ژنتیکی هستند. همراه بودن یک سیستم باززایی و انتقال ژن موفق، در مطالعات پایه و کاربردی بسیار کمک کننده است. یک سیستم باززایی درون شیشه­ای مطلوب برای تراریختی ژنتیکی مؤثر با کاربرد تجاری ضروری است (2). گزارشاتی مبنی بر نقش مثبت پیش تیمار 2,4-D در افزایش میزان باززایی وجود دارد (15 و 18). بسیاری از ژنوتیپهای گوجه فرنگی پاسخهای منحصر به فردی نسبت به تنظیم کننده­های رشد گیاهی در طول باززایی می­دهند (16). تغییر در مقدار و نوع تنظیم کننده­های رشد گیاهی، درصد باززایی و تعداد شاخساره­های تولید شده به ازای هر ریزنمونه را تحت تأثیر قرار می­دهد (20). بعلاوه باززایی در ژنوتیپهای مختلف نیاز به ریزنمونه­های خاصی دارد، این تفاوت­ها قابل توارث هستند و می­توانند به وسیله ژنهای سیتوپلاسمی و هسته­ای کنترل شوند (19). در این پژوهش اثر پیش تیمار 2,4-D و تنظیم کننده­های رشد گیاهی بر باززایی دو رقم گوجه فرنگی گیلاسی و فلات 111 مورد مطالعه قرار گرفت. پیش تیمار 2,4-D تأثیری بر باززایی نداشت و فقط منجر به کالوس­زایی شد. عملکرد رقم گیلاسی نسبت به رقم فلات 111 بهتر بود؛ به طوری که بیشترین درصد باززایی مربوط به کوتیلدونها و هیپوکوتیلهای رقم گیلاسی، و بیشترین تعداد شاخساره تشکیل شده مربوط به ریزنمونه­های کوتیلدون رقم گیلاسی بود که در محیط کشتهای حاوی 3 یا 5/1 میلی گرم بر لیتر BAP به اضافه 1/0 میلی گرم برلیتر IAA کشت شده بودند. گزارشهای مختلفی مبنی بر نقش مؤثر IBA در القای ریشه در ژنوتیپهای مختلف گوجه فرنگی وجود دارد (5، 22 و 25) بنابراین برای ریشه­دار کردن شاخساره­های تشکیل شده از غلظت 2 میلی گرم بر لیتر IBA استفاده شد.

 

جدول 1- تنظیم کننده­های رشد گیاهی به کار رفته در محیط کشت اندام­زایی

هورمون (mg/l)

شماره ترکیب

NAA

IAA

BAP

0

1/0

0

1/0

0

1/0

0

1/0

0

5/0

3

3

5/1

5/1

0

1

2

3

4

5

 

 

 

شکل 6- الف: کالوسهای حاصل از پیش تیمار 2,4-D به مدت یک هفته، ب: کالوسهای حاصل از پیش تیمار 2,4-D به مدت دو هفته، پ: باززایی از کوتیلدون و هیپوکوتیل گوجه فرنگی رقم گیلاسی در محیط کشت حاوی BAP و IAA، ج: باززایی از ریزنمونه­های هیپوکوتیل و ریشه­زایی ازریزنمونه­های کوتیلدون در محیط کشت حاوی 5/0 میلی گرم بر لیتر IAA، د: ریشه­زایی در محیط کشت دارای 2 میلی گرم بر لیتر IBA، ه: انتقال گیاهچه­های ریشه­دار به خاک.

1- Abu-El-Heba, G.A., Hussein, G.M. and Abdalla, N.A. 2008. A rapid and efficient tomato regeneration and transformation system. Agric. For Res. 58: 103-110.

2- Bhatia, P., Ashwath, N. and Midmoe, D.J. 2005. Effects of genotype. Explant orientation, and wounding on shoot regeneration in tomato. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 41: 457-464.

3- Bhatia, P., Nanjappa, A., Tissa, S. and David, M. 2004. Tissue Culture studies in tomato (Lycoperiscon esculentum). Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 78: 1-21.

4- Burnett, L., Arnoldo, M., Yarrow, S. and Huang, B. 1994. Enhancement of shoot regeneration from cotyledon explants of Brassica napus ssp. oleifera through pretreatment with auxin and cytokinin and use of ethylene inhibitors. Plant Cell, Tiss.Org. Cult. 37: 253–256.

5- Chaudhry, S., Abbas, A., Ahmed, Y.H. and Anjum, M.A. 2010. Tissue culture studies in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) var. Moneymaker. Pakistan J. Bot. 42: 155-163.

6- Chaudhry, Z., Feroz, I., Ahmed, W., Rashid, H., Mizra, B. and Qureshi, A. 2001. Varietal response of Lycopersicon esculentum to callogenesis and regeneration. Online: J. Boil. Sci. 1: 1138-1140.

7- Chen, J.G., Shimomura, S., Sitbon, F., Sandberg, G. and Jones, A.M. 2001. The role of auxin binding protein 1 in the expansion of tobacco leaf cells. Plant J. 28: 607–617.

8- Düzyaman, E., Tanrisever, A. and Günver, G. 1994. Comparative studies on regeneration of different tissues of tomato in vitro. Acta Horti. 366: 235-242.

9- Dwivedi; K., Srivastava, P., Verma, H.N. and Chaturvedi, H.C. 1990. Direct regeneration of shoots from leaf segments of tomato (Lycopersicon esculentum) cultured in vitro and production of plants. Indian J. Exp. Biol. 28: 32–35.

10- Guillermo, P., Canepa, L.N., Zorzoli, R. and Picardi, L.A. 2003. Diallel analysis of in vitro culture traits in the genus Lycopersicon. Horti. Sci. 38: 110-112.

11- Gunay, A.L. and Rao, P.S. 1980. In vitro propagation of hybrid tomato plants (Lycopersicon esculentum L.) using hypocotyl and cotyledon explants. Ann. Bot. 45: 205–207.

12- Jawahar, M., Mohamed, S.V. and Jayabalan, N. 1997. In vitro callus culture and plant regeneration from different explants of Lycopersicon esculentum Mill. J. Phytol. Res. 10: 75–78.

13- Jiang, Y.P. 2003. Studies on the establishment of tomato transgene system in vitro culture. Master thesis. Guangxi University. China.

14- Jimenez, V.M. 2001. Regulation of in vitro somatic embryogenesis with emphasis on the role of endogenous hormones. Rev. Bras. Fisiol. Veg. 13: 197-223.

15- Kintzios, S., Sereti, E.,·Bluchos, P., Drossopoulos, J.B., Kitsaki, C.K. and Liopa-Tsakalidis, A. 2002. Growth regulator pretreatment improves somatic embryogenesis from leaves of squash (Cucurbita pepo L.) and melon (Cucumis melo L.). Plant Cell Rep. 21: 1-8.

16- Kurtz, S.M. and Lineberger, R.D. 1983. Genotypic differences in morphogenic capacity of cultured leaf explants of tomato. J. Am. Soc. Hort. Sci. 108: 710–714.

17- Meng, X.D., Zhang, W.H., Ma, H. and Liu, W.B. 1998. Study on technique of plant regeneration from tomato cotyledon and hypocotyl. Journal of Shandong Agric. Uni. 29:101-104.

18- Nhut, D.T., Van, K.T.T., VanLe, B. and Thrope, T.A. 2003. Thin cell layer culture system: regeneration and transformation applications. Springer Science and Business Media. pp. 517.

19- Ohki, S., Bigot, C. and Mousseau, J. 1978. Analysis of shoot forming capacity in vitro in two lines of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) and their hybrids. Plant Cell Physiol. 19: 27–42.

20- Plastira, V.A. and Perdikaris, A.K. 1997. Effect of genotype and explant type in regeneration frequency of tomato in vitro. Acta Horti.447: 231–234..

21- Rashid, R., Bhat, J.A., Bhat, Z.A., Dar, W.A. and Shafi, W. 2012. Calluse formation and organogenesis of tomato (Solanum lycopersicum L.). Vegetos. 25: 243-248.

22- Sakthivel, S. and Manigandan, V. 2011. Tissue culture studies in tomato (Lycopersicon esculentum PKM-1) from cotyledonary leaf explants. Int. J. Chem. Pharm. Sci. 2: 22-25.

23- Selvi, D.T. and Khader, M.A. 1993. In vitro morphogenetic capacity of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) var. PKM1. South Indian Hort. 41: 251–258.

24- Sherkar, H.D. and Chavan, A.M. 2014. Studies on calluse induction and shoot regeneration in tomato. Sci. Res. Rep. 4: 89-93.

25- Vikram, G., Kairamkonda, M., Kagithoju, S., Mangamoori, L. and Swamy, N.R. 2011. Effect of plant growth regulators on in vitro organogenesis in cultivated tomato (Solanum lycopersicum L.). J. Res. Bio. 1: 263-268.

26- Wang, H., Tsang, E., MeNeil, J., Hannam, C., Brown, D. and Miki, B. 2003. Expression of cry1Ac and GUS in cabbage and cauliflower. Acta Horti. 625: 464-475.

27- Wang, L., Tang, Y., Li, X.M., Li, J., Ma, C. and Li, H.X. 2011. A review on tomato regeneration. J Agric. Sci. Tech. B1: 163-167.

28- Yancheva, S.D., Golubowicz, S., Fisher. E., Lev-Yadun, S. and Flaishman, M.A. 2003. Auxin type and timing of application determine the activation of the developmental program during in vitro organogenesis in apple. Plant Sci. 165: 299–309.