نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران

2 دانشگاه شهید باهنر کرمان

3 استادیار بیوفیزیک، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران

4 دانشیار ژنتیک، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران

چکیده

مالونونیتریل CH2(CN)2، یک ترکیب دی‌نیتریلی با ساختار خطی است که در تولید علف‌کش‌ها، داروهای ضد سرطان و رنگ‌ها، مورد استفاده قرار می‌گیرد. در مطالعه حاضر، باکتری‌های هیدرولیز کننده مالونونیتریل با استفاده از محیط کشت MM1 (mineral salts medium) حاوی 1 درصد مالونونیتریل از نمونه فاضلاب جمع آوری شده و به دو روش بیوشیمیایی و مولکولی شناسایی شدند. برای این منظور ابتدا میزان هیدرولیز مالونونیتریل توسط سویه‌های جدا شده با روش رنگ سنجی تعیین شد. سویه‌ای که دارای بیشترین قدرت هیدرولیز کنندگی بود، انتخاب گردید و با استفاده از روشPCR و پرایمرهای طراحی شده، ژن 16S rRNA آن تکثیر و تعیین توالی گردید. مقایسه توالی‌ به دست آمده KM229757)) با سایر توالی‌های ثبت شده در بانک ژنی نشان داد سویه جداسازی شده (AKH25)مربوط به پانتوآ آگلومرانس از خانواده انتروباکتریاسه است. در مطالعه دیگر، منحنی رشد و میزان آمونیاک آزاد شده در حضور غلظت‌های مختلف مالونونیتریل رسم گردید. نتایج نشان داد این سویه، دارای بالاترین فعالیت تجزیه مالونونیتریل به میزان 48/1 و 33/3 میلی‌مولار آمونیاک تولیدی در حضور غلظت‌های 2 و 5 میلی‌مولار مالونونیتریل در 21 ساعت پس از انکوباسیون در فاز سکون منحنی رشد بود. بر اساس این تحقیق، سویه ایرانی پانتوآ آگلومرانسAKH25 می-تواند کاندید مناسبی برای حذف مالونونیتریل از محیط‌های آلوده مورد استفاده قرار گیرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Identification and introducing of an Iranian Pantoea agglomerans strain AKH25 by 16S rRNA sequence and investigation of it,s capacity to malononitrile degradation

نویسنده [English]

  • Arastoo Badoei-Dalfard 2

چکیده [English]

Malononitrile, CH2(CN)2 is an aliphatic dinitrile, which uses in the production of herbicides, anti-cancer drugs and dyes. In the present study, malononitrile hydrolyzing bacteria screened from sewage with using MM1 media containing 1 % malononitrile. This strain was identified with biochemical and molecular methods. At first, malononitrile hydrolyzing activity of this strain determined with colorimetric method. The isolate AKH25, with high enzyme activity was selected and 16S rRNA gene was amplified and sequenced by PCR method and designed primers. Comparison of 16S rRNA gene of AKH25 (KM229757) with the other deposited 16S rRNA genes in NCBI showed that this strain is Pantoea agglomerans from Enterobacteriaceae family. In another study, the bacterial growth curve and ammonia liberated in the presence of different malononitrile concentration was considered. Results showed that, the highest malononitrile decomposition value was detected as releasing of 1.48 and 3.33 mM ammonia from 2.0 and 5.0 mM malononitrile, after 21 h of incubation during the stationary phase, respectively. According to this research, the Iranian Pantoea agglomerans strain AKH25 can be used as a suitable candidate for removing malononitrile from contaminated environments.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Isolation
  • Malononitrile
  • pantoea agglomerans

شناسایی و معرفی سویه ایرانی پانتوآ آگلومرانس AKH25 با استفاده از توالی16S rRNA  و بررسی قدرت تجزیه کنندگی مالونونیتریل آن 

نرجس رمضانی­پور، ارسطو بدویی دلفارد*، زهرا کرمی، عبدالحمید نمکی شوشتری

کرمان، دانشگاه شهید باهنر کرمان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 18/12/93              تاریخ پذیرش: 11/3/94

چکیده  

مالونونیتریل CH2(CN)2، یک ترکیب دی­نیتریلی با ساختار خطی است که در تولید علف­کشها، داروهای ضد سرطان و رنگها، مورد استفاده قرار می­گیرد. در مطالعه حاضر، باکتریهای هیدرولیز کننده مالونونیتریل با استفاده از محیط کشت MM1 (mineral salts medium) حاوی 1 درصد مالونونیتریل از نمونه فاضلاب جمع آوری شده و به دو روش بیوشیمیایی و مولکولی شناسایی شدند. برای این منظور ابتدا میزان هیدرولیز مالونونیتریل توسط سویه­های جدا شده با روش رنگ سنجی تعیین شد. سویه­ای که دارای بیشترین قدرت هیدرولیز کنندگی بود، انتخاب گردید و با استفاده از روشPCR  و پرایمرهای طراحی شده، ژن 16S rRNA آن تکثیر و تعیین توالی گردید. مقایسه توالی به دست آمده KM229757)) با سایر توالیهای ثبت شده در بانک ژنی  نشان داد سویه جداسازی شده  (AKH25)مربوط به پانتوآ آگلومرانس از خانواده انتروباکتریاسه است. در مطالعه دیگر، منحنی رشد و میزان آمونیاک آزاد شده در حضور غلظتهای مختلف مالونونیتریل رسم گردید. نتایج نشان داد این سویه، دارای بالاترین فعالیت تجزیه مالونونیتریل به میزان 48/1 و 33/3 میلی­مولار آمونیاک تولیدی در حضور غلظتهای 2 و 5 میلی­مولار مالونونیتریل در 21 ساعت پس از انکوباسیون در فاز سکون منحنی رشد بود. بر اساس این تحقیق، سویه ایرانی پانتوآ آگلومرانسAKH25  می­تواند کاندید مناسبی برای حذف مالونونیتریل از محیطهای آلوده مورد استفاده قرار گیرد.

واژه های کلیدی: جداسازی، مالونونیتریل، پانتوآ آگلومرانس، دی نیتریل

* نویسنده مسئول، تلفن: 03433222032، پست الکترونیکی:  badoei@uk.ac.ir 

مقدمه


توسعه روز افزون کارخانه­ها و صنایع شیمیایی متعدد، باعث تولید و مصرف ترکیبات شیمیایی مختلف شده است که پیامد آن تهدید جهانی برای محیط زیست می­باشد(4). نیتریلها و مشتقات آنها با ساختار کلی R-C≡N به طور وسیعی در تولید انواع حلالها، پلاستیکها، حشره کشها، علف­کشها، رنگها، مواد دارویی، پلیمرها و ... استفاده می شوند (8 و 26). علاوه بر فاضلاب خانگی، شهری و پساب کشاوزی از جمله صنایعی که خروجی فاضلاب آنها محتوی ترکیبات نیتریل است می­توان به صنایع دست­کاری فلزات، استخراج معادن و ... اشاره کرد(6). مالونونیتریل CH2(CN)2، یک ترکیب دی­نیتریلی با ساختار خطی است که علاوه بر استفاده گسترده در تولید علف­کشها، داروهای ضد­سرطان و رنگها، به صورت ویژه و انبوه در تولید گاز اشک­آور 2-کلرو بنزیلیدین مالونونیتریل (2-Chlorobenzylidene Malononitrile) مورد استفاده قرار می­گیرد(12). برخی از عوارض این گاز اشک­آور شامل سرگیجه، درد قفسه سینه، سردرد شدید، دو بینی و تاری دید، خستگی، تهوع، استفراغ، استفراغ خونی، دردهای شکمی و افزایش ترشحات دهان، بینی، چشم و سیستم تنفسی و دردهای شدید عضلانی ذکر شده ‌است(5،10). این گاز در زمان 8 سال دفاع مقدس کشور ایران، از جمله سلاحهای شیمیایی-جنگی کشور عراق بود که برای اولین بار در عملیات رمضان نقش بازدارندگی به خود گرفت و نیروهای ایران را از دستیابی به اهداف عملیاتی بازداشت(15). در پی این واقعه، روزنامه لس آنجلس تایمز چاپ امریکا نوشت: در تابستان سال 1982 میلادی (1361 ه. ش.)، هنگامی که نیروهای ایرانی به نزدیکی سربازان عراقی رسیدند، دشمن از عامل سی اس که به عنوان گاز اشک آور شناخته می­شود، استفاده کرد (15). این ماده با تأثیر بر DNA سلول می‌تواند سبب عوارض دیررس و تغییرات کارسینوژنیک و سرطان­زایی در انسان شده و همچنین به دلیل نیمه­عمر طولانی با شسته شدن توسط آب باران و سرازیر شدن به مزارع که از آبهای سطحی استفاده می‌کنند، سبب بروز عوارض زیست محیطی ‌گردد(15). به طوری که، مالونونیتریل و مشتقات آن پس از رهاسازی در محیط زیست اثرات مضری مانند کاهش رشد موجودات زنده، کاهش مقاومت در برابر بیماریها، مرگ و میر موجودات، افزایش جهشهای ژنتیکی و سرطان را ایجاد می­کنند(14). این ترکیبات در بدن انسان بلافاصله در اثر متابولسم کبدی به ماده سمی سیانید تبدیل شده و منجر به ایجاد مسائل جدی در بحث سلامت فردی می­شوند(27). از جمله راهکارها برای حذف یا تبدیل ترکیبات نیتریل به ترکیبات اسیدی یا آمیدی بی­خطر می­توان به هیدرولیز شیمیایی و آنزیمی اشاره نمود. پیوند نیتریل در ترکیبات نیتریل­دار بسیار پایدار می­باشد، این امر سبب می­شود تا هیدرولیز شیمیایی آنها نیازمند شرایط سخت اسیدی (6 مولار اسید­کلردریک) یا بازی (2 مولار سدیم هیدروکسید) و دمای واکنشی بالا باشد(23). علاوه بر آن تولید محصولات جانبی مانند اسید سیانیدریک سمی و مقادیر بالای نمک و ... می­تواند مشکلات فراوانی به وجود آورد(23). با توجه به این معایب، تجزیه به روش میکروبی-آنزیمی با داشتن مزایایی مانند امکان کنترل فیزیولوژیکی و فیزیکوشیمیایی، تنوع آنزیمی و مقادیر بالای تولید آنزیم­ می­تواند راهی مؤثر و کارآ برای حذف یا تبدیل نیتریلهایی با سمیت بالا از محیط­زیست می­باشد(1). در این راستا، جداسازی و غربالگری آنزیمهای جدید با خصوصیات مؤثر و بهینه از میکروارگانیسم­ها به عنوان اولین مرحله در مسیر تحقیق و توسعه محصولات آنزیمی بررسی شده و باکتریهای متنوعی جداسازی و بررسی شدند(2). تاکنون گزارشات محدودی از جداسازی و فعالیت باکتریهای هیدرولیز کننده دی­نیتریل­های آلیفاتیک به ویژه مالونونیتریل منتشر شده است که می­توان به جداسازی Pyrococcus abyssi (25) و Bacillus RAPc8 (27) با سوبسترای مالونونیتریل، فعالیت 17 درصدی هیدرولیز مالونونیتریل سویه Burkholderia cenocepacia J231 (19) و فعالیت آنزیمی باکتری Bacillus Pallidus Dac521 روی دو سوبسترای گلوتارونیتریل و آدیپونیتریل در مقایسه با سوبسترای کنترل بنزونیتریل با مقادیر 10 و 14 درصد اشاره نمود(3). ترکیب نیتریل به عنوان یک منبع کربن و یا انرژی در این باکتریها مورد استفاده قرار می­گیرد و در نهایت به کربوکسیلیک اسید و آمونیاک تبدیل می­شود(8). از آنجایی که بهترین روش برای حذف مالونونیتریل از محیط زیست، استفاده از باکتریهای تجزیه­کننده این ترکیب است. در این تحقیق یک باکتری ایرانی با توانایی حذف مالونونیتریل از فاضلاب شهری کرمان جداسازی گردید. سپس این سویه (AKH25) با استفاده از ژن 16S rRNA شناسایی و پتانسیل حذف مالونونیتریل آن مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

تهیه نمونه، جداسازی و شناسایی باکتریهای هیدرولیز کننده مالونونیتریل: نمونه­های حاوی باکتری از محل فاضلاب شهر کرمان تهیه گردید. جداسازی باکتریهای هیدرولیز کننده مالونونیتریل به روش غنی­سازی در محیط حاوی سوبسترای اختصاصی صورت گرفت. برای این منظور از محیط حداقل نمکهای معدنی (MM1) به همراه یک درصد مالونونیتریل به عنوان منبع کربن و انرژی استفاده شد(22). محیط حداقل نمکهای معدنی (7 pH) حاوی ترکیبات: 8/6 گرم دی پتاسیم هیدروژن فسفات، 2/1 گرم پتاسیم دی هیدروژن فسفات، 1/0 گرم سولفات منیزیم، 1/0 گرم سولفات منگنز، 1/0 گرم کلسیم دی­کلرید، 1 /0 گرم سولفات آهن و 006/0 گرم سدیم مولیبدات در یک لیتر آب مقطر بود. میزان 5 میلی­لیتر از نمونه­های آب درون این محیط جهت غنی­سازی اولیه تلقیح شد و روی شیکر-انکوباتور با rpm160 و دمای 30 درجه سانتی­گراد قرار گرفت. پس از گذشت یک هفته، 5 میلی­لیتر از محیط برداشته شد و به محیط حداقل نمکهای معدنی جدید انتقال یافت. این عمل تا 3 پاساژ ادامه یافت تا اینکه کدورت به دست آمده ناشی از رشد باکتریها باشد و آلودگی ترکیبات دیگر در نمونه کاهش یابد. از پاساژ نهایی میزان 100 میکرولیتر بر روی محیط کشت جامد نمکهای معدنی منتقل گردید. پس از رشد، باکتریها به صورت تک کلنی جداسازی و به محیط حداقل نمکهای معدنی جدید انتقال یافتند. باکتریهایی که در مراحل قبلی جداسازی شده بودند، در پلیتهای حاوی محیط حداقل نمکهای معدنی، 100 میکرولیتر مالونونیتریل و 02/0 درصد فنل­رد به عنوان شناساگر کشت داده شده و سپس در دمای 30 درجه سانتی­گراد به مدت 48-24 ساعت گرماگذاری شدند. پس از سه دوره کشت از میان سویه­های با فعالیت هیدرولیز مالونونیتریل، سویه­ای که بیشترین هاله و میزان شدت رنگ در محیط جامد و مایع حاوی سوبسترا و فنل­رد، بود به عنوان سویه برتر مولد آنزیم تجزیه کننده مالونونیتریل جهت مطالعات بعدی انتخاب شد. با استفاده از برخی آزمونهای میکروبی و بیوشیمیایی مانند رنگ­آمیزی گرم، شکل میکروسکوپی، آزمون حرکت، تولید اندول، تولید سولفید هیدروژن، احیای نیترات، آزمایش وژز-پروسکوئر، هیدرولیز ژلاتین، شناسایی اولیه باکتری برتر هیدرولیز کننده مالونونیتریل انجام گرفت(17).

شناسایی مولکولی باکتری با تکثیر قسمتی از ژن 16S rRNA توسط پرایمر­های Forward: 5'-AGTTTGATCCTGGCTCCAG-3' باTm=53.7ºC  و پرایمر :Reverse -'GGCTACCTTGTTACGACTT- 3ʹ  5با Tm = 53.4 ºC انجام شد. واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR)، در حجم نهایی 25 میکرولیتر شامل 2 میکرولیتر DNA الگو (10 mM)، 5/0 میکرولیتر از هر پرایمر (50 پیکومول)، 2 میکرولیتر(10 mM) dNTP ، 1 میکرولیتر (50 mM) MgCl2، 5/2 میکرولیتر بافر PCR (10X)، 2/0 میکرولیتر آنزیم (5u/ml) Taq DNA Polymerase خریداری شده از شرکت سینا­ژن و 3/16 میکرولیتر آب مقطر دیونیزه با برنامه ذیل انجام شد. 1) دمای اولیه 94 درجه سانتی­گراد، 45 ثانیه، 2) 52 درجه سانتی­گراد، 45 ثانیه، 3) 72 درجه سانتی­گراد، 90 ثانیه، 4) برای تکثیر نهایی 72 درجه سانتی­گراد، برای مدت 8 دقیقه. محصولPCR  پس از الکتروفورز ژل آگارز 1 درصد با استفاده از کیت استخراج DNA خالص­سازی شد. سپس توالی DNA با استفاده از توالی­یاب DNA توسط شرکت بیونیر (کره) تعیین شد. شباهت توالی نوکلئوتید­های ژن16S rRNA  سویه هیدرولیز کننده به کمک نرم­افزار BLAST با توالیهای ثبت شده در پایگاه اطلاعاتی ژنوم Gene Bank مقایسه شد(16). به این ترتیب نزدیک­ترین سویه­ها با ترادف 16S rRNA با سویه تعیین شد. همچنین، توالی به دست آمده در این پژوهش در بانک ژنی NCBI ثبت و شماره دستیابی ژنی مربوطه دریافت شد. درخت فیلوژنی توالی سویه با توالی حاصل از جستجو در پایگاه اطلاعاتی Gene Bank به کمک نرم­افزار MEGA4 با روش neighbour joining رسم شد(24).

سنجش فعالیت آنزیمی: فعالیت آنزیم بر اساس مقدار آمونیاک تولیدی با استفاده از روش فنل-هیپوکلریت ارائه شده توسط فاست و اسکات سنجیده شد(9). بر اساس این روش به مقدار 100 میکرولیتر محلول حاوی آنزیم، 100 میکرولیتر مالونونیتریل 25 میلی­مولار و 200 میکرولیتر بافر فسفات 50 میلی­مولار با 7pH  اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت 30 دقیقه در دمای 30 درجه سانتی­گراد گرماگذاری شد. پس از آن مقادیر 400 میکرولیتر محلولA  (فنل 59/0 مولار و سدیم نیتروپروساید 1 میلی­مولار) و 400 میکرولیتر محلولB  (سدیم هیپوکلریت 11/0 مولار و سدیم هیدروکسید 2 مولار) به آن اضافه شد. پس از پدیدار­شدن رنگ آبی مقدار جذب نمونه­ها در طول­موج 600 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (مرئی-فرابنفش) خوانده شد. در تمامی واکنشها از محلول شاهدی که در آن آنزیم پس از انکوباسیون مخلوط واکنش به آن اضافه شده بود استفاده گردید. بر این اساس، یک واحد فعالیت آنزیم عبارت است از مقدار آنزیمی که قادر است 1 میکرو­مول آمونیاک به ازای 1 دقیقه تحت شرایط استاندارد واکنش آزاد نماید. آزمایشات 3 بار تکرار و منحنی استاندارد توسط آمونیوم کلراید رسم شد (21).

بررسی میزان هیدرولیز مالونونیتریل وتغییرات pH در طی زمان: سویه باکتریایی مورد نظر در حضور غلظت یک درصد مالونونیتریل در دمای 30 درجه سانتی گراد و دور 160 کشت داده شد. میزان تغییرات  pHو تولید آمونیاک ناشی از فعالیت آنزیم در مدت زمان 0، 24، 48، 72 ساعت انکوباسیون و همچنین تجزیه مالونونیتریل در حضور و عدم حضور سوبسترا در مدت زمان 0 و 72 ساعت، با روش گفته شده مورد بررسی قرار گرفت(22).

منحنی رشد و هیدرولیز مالونونیتریل توسط سویه مورد نظر: سویه باکتریایی مورد نظر در حضور غلظتهای 2 و 5 میلی­مولار مالونونیتریل در دمای 30 درجه سانتی گراد و دور 160 کشت داده شد. میزان آمونیاک آزاد شده حاصل از تجزیه مالونونیتریل طبق روش ذکر شده اندازه گیری شد. علاوه بر این، منحنی رشد سویه مورد نظر در غلظتهای 2 و 5 میلی­مولار مالونونیتریل نیز به روش کدورت سنجی به وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر در طول­موج 600 نانومتر در فاصله­های زمانی مشخص 0 تا 36 ساعت پس از انکوباسیون رسم شد.

نتایج

جداسازی باکتریهای هیدرولیز کننده مالونونیتریل: جداسازی باکتریهای هیدرولیز کننده مالونونیتریل با غنی­سازی نمونه­های فاضلاب در محیط کشت حداقل نمکهای معدنی (MM1) حاوی یک درصد مالونونیتریل انجام شد. پس از رشد، تعداد 4 سویه با توانایی استفاده از مالونونیتریل به عنوان تنها منبع کربن و نیتروژن روی محیط کشت حاوی مالونونیتریل و فنل­رد، جداسازی و خالص­سازی شد. از میان 4 سویه جدا شده، سویه AKH25 با ایجاد بیشترین هاله و شدت رنگ صورتی در محیط جامد و مایع حاوی فنل­رد برای ادامه مطالعات انتخاب گردید. نتایج حاصل از تجزیه مالونونیتریل و تغییر رنگ فنل رد در شکل 1 نشان داده شد. این نتایج نشان داد که تجزیه مالونونیتریل از 3 ساعت پس از انکوباسیون شروع و به تدریج افزایش یافته است به طوری که در 15 ساعت پس از انکوباسیون بیشترین فعالیت تجزیه کنندگی مشاهده گردید.


 

شکل1- روند تغییر رنگ محیط مایع حاوی فنل­رد و مالونونیتریل از زرد به صورتی توسط باکتری پانتوآ آگلومرانس AKH25 درون میکروپلیت در بازه زمانی 0 تا 15 ساعت پس از رشد


بررسی میزان هیدرولیز مالونونیتریل وتغییرات pH در طی زمان: نتایج تغییرات pH و آمونیاک تولید شده حاصل از فعالیت آنزیمی سویه پانتوآ آگلومرانس AKH25 در زمانهای مختلف انکوباسیون در شکل 2 نشان داده شد. نتایج نشان داد زمان بهینه فعالیت هیدرولازی، 24 ساعت پس از انکوباسیون بود (شکل 2-الف). علاوه براین، نتایج خاطر نشان می­سازد که میزان تغییرات pH محیط با میزان فعالیت آنزیم و تجزیه مالونونیتریل نیز رابطه مستقیم دارد به طوری که بیشترین میزان تغییر pH ناشی از آزادسازی آمونیاک پس از 24 ساعت انکوباسیون مشاهده گردید. به این ترتیب در اثر تجمع آمونیاک در محیط، pH خنثی اولیه به سمت قلیایی­شدن پیش رفته و در زمان 24 ساعت پس از انکوباسیون به بالاترین حد خود رسید و پس از آن به تدریج کاهش یافت (شکل 2-ب).

نتایج حاصل از منحنی رشد و تجزیه مالونونیتریل (غلظتهای 2 و 5 میلی­مولار) توسط سویه AKH25 در بازه زمانی 36 ساعت در شکل 2 نشان داده شد. در این آزمایش سویه AKH25 در محیط اختصاصی MM1 حاوی مالونونیتریل در دمای 30 درجه سانتی­گراد و دور rpm 160 کشت داده شد. سپس هر 3 ساعت یکبار میزان جذب در طول­موج 600 نانومتر اندازه گیری گردید که معیاری از رشد باکتری بود. نتایج نشان داد که باکتری دارای فاز تأخیر تقریبی حدود 2 ساعت بوده و پس از آن در بازه زمانی حدود 3-12 ساعت، در فاز لگاریتمی قرار داشت. بعد از 12 ساعت انکوباسیون فاز سکون شروع شده و باکتری در حدود 27 ساعت بعد از کشت وارد فاز مرگ شد. مقایسه نمودارهای حاصل از فعالیت آنزیمی تجزیه غلظتهای 2 و 5 میلی­مولار مالونونیتریل نشان داد که این باکتری در زمان تقریبی 21 ساعت رشد دارای بیشترین میزان فعالیت آنزیمی بود. از این رو، میزان آمونیاک آزاد شده ناشی از تجزیه مالونونیتریل در این زمان بیشترین مقدار بود.

 

 

شکل2- بررسی میزان تجزیه مالونونیتریل در طی زمان 72 ساعت. الف) تغییرات pH، ب) میزان آمونیاک تولیدی.

 

نتایج نشان داد که این سویه باکتریایی در این مدت، 48/1 میلی مولار آمونیاک را از تجزیه 2 میلی مولار مالونونیتریل تولید کرد (شکل 3-الف). علاوه بر این میزان تولید آمونیاک از تجزیه 5 میلی مولار مالونونیتریل در همین زمان حدود 33/3 میلی مولار بود (شکل 3-ب). پس از این مدت با کاهش یافتن میزان رشد باکتری، میزان تجزیه و تولید آمونیاک نیز کاهش یافت.

شناسایی بیوشیمیایی: برای شناسایی سویه مورد­نظر، خصوصیات فنوتیپیکی و برخی آزمونهای بیوشیمیایی-میکروبی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که این سویه از جمله باکتریهای گرم منفی، دارای پیگمان و از جنس پانتوآ بود (جدول 1).


جدول1- نتایج آزمونهای بیوشیمیایی- میکروبی باکتری پانتوآ آگلومرانس AKH25

خصوصیات سویه

نتیجه

واکنش گرم

منفی

شکل باکتری

باسیلوس

پیگمان

زرد رنگ

تولید اندول

­-

اوره­آز

-

حرکت

+

احیا نیترات

+

واکنش VP

+

هیدرولیز ژلاتین

+

رشد در 4 درجه سانتی­گراد

+

 

 

شکل3- منحنی رشد و فعالیت هیدرولیز مالونونیتریل در بازه زمانی 36 ساعت در دو غلظت مختلف آمونیاک. الف) غلظت 2 میلی­مولار، ب) غلظت 5 میلی­مولار.


شناسایی با استفاده 16S rRNA: تعیین گونه باکتریایی با استفاده از اطلاعات حاصل از توالی ژن 16S rRNA انجام شد. توالی ژن 16S rRNA دارای بخشهای حفاظت شده و غیر حفاظت شده می­باشد که از اطلاعات مربوط به این بخشها برای شناسایی گونه­های باکتریایی استفاده می­شود. برای تهیه DNA ژنومی باکتری، از کیت استخراج DNA سیناژن استفاده شد و DNA تکثیر یافته با استفاده از PCR پس از مشاهده روی ژل آگارز 1 درصد (شکل4) توسط کیت تخلیص DNA از شرکت سیناژن تخلیص و برای تعیین توالی به شرکت بیونیر (کره) ارسال شد. درخت فیلوژنتیک با استفاده از نرم­افزار MEGA4 رسم گردید (شکل 5). مقایسه توالی  ژن 16S rRNA این سویه باکتریایی با 13 گونه نزدیک از نظر توالی ژن مورد نظر موجود در  NCBIنیز در جدول 2 آورده  شد. نتایج حاصل از تطبیق توالی و درخت فیلوژنتیکی نشان دادند که گونه فوق به Pantoea agglomerans نزدیک و میزان شباهت نوکلئوتیدی آن 99درصد بود. توالی نوکلئوتیدی ارائه شده در بانک ژنی NCBI با شماره دسترسی KM229757 ثبت و در دسترس است.

 

شکل4. محصول PCR ژن 16S rRNA سویه پانتوآ آگلومرانس  AKH25(چاهک شماره1) و DNA مارکر (چاهک شماره2).

 


 

جدول 2- مقایسه توالی نوکلئوتیدی ژن 16S rRNA جدایه AKH25 با سایر گونه­های موجود در NCBI

Identify (%)

Reference

AC. Number 

Strain 

No. 

 

This study

KM229757

Pantoea agglomerans AKH25 

1

99

You, C, and et al. 2013.

KC764985.1

Pantoea agglomerans T224

2

99

Abraham, WR, and et al. 2006.

AM184263.1

Pantoea agglomerans WAB1924

3

99

Abraham, WR, and et al. 2006.

AM184264.1

Pantoea agglomerans WAB1925

4

99

Young, CC, and et al. 2003.

AY315450.1

Pantoea agglomerans CC-88166
5

99

Avila-Quezada, GD, and et al. 2012.

JX827461.1

Enterobacter cloacae GAQ7

6

99

Tripathy, S, and et al. 2013.

KC895920.1

Enterobacter cancerogenus cifa chp29

7

99

Nataprawira, S, and et al. 2014.

KJ574404.1

Enterobacter cloacae BB08-2
8

99

Hao, Y, and et al. 2014.

KJ541760.1

Enterobacter cloacae ZL1103

9

99

Okubo, T, and et al. 2009(17).

AB461749.1

Enterobacteriaceae bacterium M406

10

99

Nakagawa, Y, and et al. 2011.

AB680427.1

Enterobacter cloacae NBRC13536
11

97

Putra, AE, and et al. 2014.

KJ616368.1

Enterobacter cloacae BC11-4

12

99

Song, L, and et al. 2008.

EU884395.1

Enterobacter cloacae XA-2

13

99

Liang, J, and et al. 2014.

KJ806343.1

Leclercia adecarboxylata A-X9A

14

 


بحث

در مطالعه حاضر، سویه باکتریایی پانتوآ آگلومرانس  AKH25با فعالیت قابل­توجه تجزیه مالونونیتریل جداسازی و شناسایی گردید. فنل رد در pH اسیدی زرد رنگ و در pH قلیایی صورتی رنگ می­شود. آمونیاک، محصول اصلی هیدرولیز ترکیبات نیتریلی است. اگر باکتری قادر به هیدرولیز مالونونیتریل باشد با انجام این فرآیند، آمونیاک در محیط تجمع یافته که منجر به قلیایی­شدن و تغییر رنگ معرف فنل رد از زرد به صورتی می­شود(25).


 

 

شکل5- درخت فیلوژنی سویه پانتوآ آگلومرانس  AKH25رسم شده به روش neighbour joining و با استفاده از  معیار Boot strap.

 


نتایج خاطرنشان می­سازد که بیشترین میزان قلیایی­شدن pH محیط ناشی از آزادسازی آمونیاک، پس از 24 ساعت انکوباسیون مشاهده می­شود. علاوه بر این، میزان تغییرات pH محیط با میزان تجزیه مالونونیتریل نیز رابطه مستقیم دارد. سانتاشکومار و همکاران در 2010 گزارش کردند که هیدرولیز استونیتریل موجود در محیط به وسیله باکتری Paracoccus sp. SKG موجب تولید آمونیاک و افزایش pH محیط از 7 به 2/9 می­شود و پس از آن به تدریج کاهش ویا ثابت می­ماند (22). آنها بر، اثرگذار بودن رشد باکتری و ایجاد این تغییرات اشاره کرده و نشان دادند که در فاز نمایی رشد، باکتری با مصرف سوبسترای نیتریلی به تدریج غلظت آن را در محیط کاهش داده و از طرفی میزان آمونیاک و محصول را افزایش می­دهد. علاوه بر آن، در این مرحله، باکتری از محصول تولیدی حاصل از هیدرولیز و آمونیاک نیز به عنوان منبع کربن و انرژی استفاده کرده و به رشد خود ادامه می­دهد. پس از گذشت زمان و تجمع آمونیاک اضافی در محیط، به دلیل اثر مهاری بر رشد باکتری، فاز سکون منحنی رشد آغاز و pH محیط با عدم تولید آمونیاک افزایش نیافته و ثابت می­ماند(25).

بررسی فعالیت آنزیمی باکتری جداسازی شده نیز نشان داد که تجزیه مالونونیتریل از 3 ساعت پس از انکوباسیون شروع شده و به تدریج افزایش می­یابد و تا 15 ساعت پس از انکوباسیون به بیشترین میزان تجزیه می­رسد. در پژوهشی که در سال 2005 روی نیتریلاز Pyrococcus abyssi انجام گردید، مشخص شد که این آنزیم تمایل به هیدرولیز سوبسترا­های دی­نیتریل آلیفاتیک داشته و در میان آنها، مالونونیتریل با مقدار  Km 48/3 میلی­مولار، بهترین سوبسترای هیدرولیزی است. همچنین اثر مهاری این سوبسترا در غلظتهای بالاتر از 12 میلی­مولار نیز مشاهده گردید(18). علی­رغم پژوهشهای گسترده­ای که در مورد هیدرولیز ترکیبات مختلف نیتریلی صورت گرفته است، گزارشات معدودی به بررسی هیدرولیز ترکیبات دی­نیتریلی مانند مالونونیتریل، سوکسینونیتریل، گلوتارونیتریل، آدیپونیتریل و ... به وسیله سویه­های مختلف باکتریایی منتشر شده است(20). از جمله باکتری های تجزیه­کننده مالونونیتریل می­توان به  Burkholderia cenocepacia J2315 و Rhodococcus rhodochrous 21197 اشاره نمود(7).

سویه پانتوآ آگلومرانس  AKH25قادر است پس از 21 ساعت انکوباسون میزان 74 درصد از مالونونیتریل اولیه (2 میلی­مولار) را تجزیه کرده و آمونیاک تولید کند. علاوه بر این، در صورتی­که میزان مالونونیتریل اولیه 5 میلی­مولار باشد این سویه قادر است در همین شرایط میزان 67 درصد آن را تجزیه کند. کمتر شدن درصد تجزیه احتمالاً به خاطر سمی بودن ترکیب و ممانعت از رشد بیشتر باکتری می­باشد (25). گاواگان و همکاران در 1999، جداسازی باکتری گرم منفی Acidovorax facilis 72W با توانایی طیف گسترده هیدرولیز دی­نیتریلها از جمله مالونونیتریل را گزارش دادند(11). در این پژوهش، میزان تبدیل سوبسترا­ی مالونونیتریل، گلوتارونیتریل و سوکسینونیتریل به ازای میلی­گرم وزن تر بر حسب میکرومول بر دقیقه بترتیب 144/0، 09/0 و 08/0 گزارش شد(11). در میان باکتریهای گرم مثبت، فعالیت هیدرولیزی مالونونیتریل توسط Bacillus RAPc8 به میزان 7 درصد در مقایسه با سوبسترای استونیتریل گزارش شد (27).

وانگ و همکاران در 2013 در طی بررسی اختصاصیت سوبسترایی آنزیم نیتریلاز سویه Burkholderia cenocepacia J231 در مقایسه با سوبسترای کنترل فنیل­استونیتریل، فعالیت 17 درصدی هیدرولیز مالونونیتریل در کنار هیدرولیز 78 درصدی و 5 درصدی دی­نیتریلهای فومارونیتریل و سوکسینونیتریل گزارش دادند(25). در پژوهشی که در سال 2003 روی فعالیت آنزیمی سویه سیانوباکتریایی PCC6803 انجام شد، فعالیت 5 درصدی نیتریلاز در حضور سوبسترا­های دی­نیتریل به خصوص مالونونیتریل در مقایسه با کنترل بنزونیتریل مشاهده گردید(13).  در پایان خاطر نشان می­سازد، تاکنون از جنس پانتوآ به عنوان باکتری هیدرولیز کننده ترکیبات دی­نیتریل به ویژه مالونونیتریل گزارشی منتشر نشده است.

نتیجه­گیری

با توجه به مصرف روزافزون محصولات مالونونیتریل و مشتقات آن، رهاسازی این ترکیبات در محیط زیست تأثیر منفی بر سلامت انسان و موجودات زنده دارد. تجزیه زیستی توسط میکروارگانیسم ها به عنوان یک راهکار مؤثر در حذف این آلاینده­ها مطرح می­باشد. بنابراین پانتوآ آگلومرانس سویه  AKH25می­تواند برای هیدرولیز مالونونیتریل در مراحل تصفیه فاضلاب شهری و پاکسازی محیط زیست مورد استفاده قرار گیرد.

تشکر و قدردانی

نویسندگان این مقاله از معاونت پژوهشی دانشگاه شهید باهنر کرمان کمال تشکر و قدردانی را دارند.

 

1- شهباز محمدی، ح. و امیدی نیا، ا. 1387. جداسازی، غربالگری و تعیین خصوصیات آنزیمی میکروارگانیسم­های تولید کننده آمینواسید دهیدروژنازها از نمونه­های خاک ایران. مجله زیست شناسی ایران. جلد 21 ، شماره 1، ص 104-94.  

2- مشایخی، ف.، امیدی نیا، ا.، شهباز محمدی، ح.، ابراهیمی راد، م.، حسین خانی، س. و گره گوریان، آ. 1389. تخلیص و بازیافت آلکالین پروتئاز مقاوم به حرارت در سامانه­های دوفازی آبی. مجله زیست شناسی ایران. جلد23، شماره 3، ص 376.

 

3- Almatawah, Q.A., Cramp, R. and Cowan, D.A. 1999. Characterization of an inducible nitrilase from a thermophilic bacillus. Extremophiles. 3(4): 283-2891.

4- Annadoria, G., Juang, R. and Lee, D. 2002. Microbiological degradation of phenol using mixed liquors of Pseudomonas Putida and actived sludge. Waste. Management. 22 (7): 703-710.

5- Ballantyne, B. 2006. Medical Management of the Traumatic Consequences of Civil Unrest Incidents. Toxicol. Rev. 25(3): 155-197.

6- Banerjee, A., Sharma, R. and Banerjee, U.C. 2002. The nitrile degrading enzymes: current status and future prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60 (1): 33-44.

7- Chen, J., Zheng, R.C., Zheng, Y.G. and Shen, Y.C. 2009. Microbial transformation of nitriles to high-value acids or amides. Biotechnol. In. China. 133(1): 33-77.

8- Fang, S., An, X., Liu, H., Cheng, Y., Hou, N., Feng, L. and Li, C. 2015. Enzymatic degradation of aliphatic nitriles by Rhodococcus rhodochrous BX2, a versatile nitrile-degrading bacterium. Bioresour. Technol. 185(1): 28-34.

9- Fawcett, J.K. and Scott, J.E. 1960. A rapid and precise method for the determination of urea. J. Clin. Pathol. 13 (2): 156-159.

10- Fraunfelde, F. T. 2000. Is CS gas dangerous? B. M. J. 320 (7233): 458-459.

11- Gavagan, J.E., DiCosimo, R,. Eisenberg, A,. Fager, S.K,. Folsom, P.W. and Hann, E.C. 1999. A Gram-negative bacterium producing a heat-stable nitrilase highly active on aliphatic nitriles. Appl. Microbiol. Biotechnol. 52 (5): 654-659.

12- Hart, J. 2009. Background to selected environmental and human health effects of chemical warfare agents. In Environmental Consequences of War and Aftermath. Springer Berlin Heidelberg.1-19.

13- Heinemann, U., Engels, D., Bürger, S., Kiziak, C., Mattes, R. and Stolz, A. 2003. Cloning of a nitrilase gene from the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803 and heterologous expression and characterization of the encoded protein. Appl. Environ. Microbiol. 69(8): 4359-4366.

14- Horton, D.K., Burgess, P., Rossiter, S. and Kaye, W.E. 2005. Secondary contamination of emergency department personnel from o-chlorobenzylidene malononitrile exposure, 2002. Ann. Emerg. Med. 45(6): 655-658.

15- Javed, A. 2001. Chemical weapons and the Iran‐Iraq war: A case study in noncompliance. N. P. R. 8 (1): 43-58.

16- Kim, O.S., Cho, Y.J., Lee, K., Yoon, S.H., Kim, M. and Na, H. 2012. Introducing EzTaxon-e: a prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 62 (3): 716- 721.

17- Leavesley, H.B., Li, L., Prabhakaran, K., Borowitz, J.L. and Isom, G.E. 2008. Interaction of cyanide and nitric oxide with cytochrome oxidase: implications for acute cyanide toxicity. Toxicol. Sci. 101 (1): 101-111.

18- Mueller , P., Egorova, K., Vorgias ,C.E., Boutou, E., Trauthwein, H. and Verseck, S. 2006. Cloning, overexpression, and characterization of a thermoactive nitrilase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus abyssi.  Protein. Express. Purif. 47 (2): 672–681.

19- Okubo, T., Ikeda, S., Kaneko, T., Eda, S., Mitsui, H., Sato, S., and et al. 2009. Nodulation-dependent communities of culturable bacterial endophytes from stems of field-grown soybeans. Microbes. Environ, 24 (3): 253-258.

20- O'Reilly, C. and Turner, P.D. 2003. The nitrilase family of CN hydrolysing enzymes–a comparative study. J .Appl. Microbiol. 95 (6): 1161-1174.

21- Pereira, R.A., Graham, D., Rainey, F.A. and Cowan, D.A. 1998. A novel thermostable nitrile hydratase. Extremophiles. 2 (3): 347-357.

22- Santoshkumar, M., Anand, S., Nayak, O., Timmanagouda, A. and Karegoudar, B. 2010. A plate method for screening of bacteria capable of degrading aliphatic nitriles. J. Ind. Microbiol. Biot. 3(7): 111–115.

23- Schmid, A., Dordick, J.S., Hauer, B., Kiener, A., Wubbolts, M. and Withholt, B. 2001. Industrial biocatalysis today and tomorrow. Nature 409 (6817): 258-268.

24- Tamura, K., Dudley, J., Nei, M. and Kumar, S. 2007. MEGA4: Molecular   Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Bio. Evol. 24(8): 1596–99.

25- Wang, H., Sun, H. and Wei, D. 2013. Discovery and characterization of a highly efficient enantioselective mandelonitrile hydrolase from Burkholderia cenocepacia J2315 by phylogeny-based enzymatic substrate specificity prediction. BMC. biotechnol. 13(1): 14-25.

26- Zhou, Z., Hashimoto, Y. and Kobayashi, M. 2005. Nitrile degradation by Rhodococcus: useful microbial metabolism for industrial production. Actinomycetologica. 19 (1): 18-26.

27- Zhu, D., Mukherjee, C., Yang, Y., Rios, B.E., Gallagher, D.T., Smith, N.N. and Hua, L. 2008. A new nitrilase from Bradyrhizobium japonicum USDA 110: Gene cloning, biochemical characterization and substrate specificity. J. biotechnol. 133(3): 327-333.