نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه لرستان

چکیده

مرکز انتقال نفت شهدای تنگ فنی شهرستان پلدختر یکی از مراکز مهم انتقال نفت است که فرسودگی خطوط انتقالی سبب آلودگی خاک و آب این منطقه شده است. با توجه به ضرورت تحقیقات جهت زیست پالایی در این منطقه، گونههای باکتریایی از نواحی آلوده جداسازی و شناسایی شدند. هدف از این پژوهش بررسی فاکتورهای موثر بر بقا و برازش باکتری های تجزیه کننده نفت است.در این پژوهش از باکتری‌های Pseudomonas aeruginosa، Acinetobacter junii، Acinetobacter baumannii، Delftia tsuruhatensis، Sphingobacterium multivorum،Stenotrophomonas acidaminiphila و Comamonas koreensis جداسازی شده از خاک و آب آلوده به نفت منطقه پلدختر استفاده گردید. ابتدا حداقل غلظت بازدارندگی و کشندگی نفت بر این باکتری‌ها به روش ماکرودیلوشن بر حسب میکرولیتر بر میلی لیتر نفت سفید تعیین گردید. سپس گونههای باکتری از نظر فاکتورهای توانایی تشکیل ساختارهای بیوفیلم، تولید سیدروفور، توانایی انحلال فسفات و تولید ایندول استیک اسید مورد مقایسه و بررسی قرار گرفتند. گونههای Pseudomonas aeruginosa و Comamonas koreensis به ترتیب بیشترین و کمترین میزان تحمل به نفت را نشان دادند. همچنین گونه Pseudomonas aeruginosa بیشترین توانایی را در تولید سیدروفور و تشکیل ساختار بیوفیلم باکتریایی را نشان داد. در آزمون انحلال فسفات گونه های Acinetobacter junii و Acinetobacter baumannii بیشترین توانایی در انحلال فسفات را دارا بودند. همچنین گونه Sphingobacterium multivorum بیشترین میزان ایندول استیک اسید را تولید نمود. با توجه به توانایی این گونههای باکتریایی در تحمل آلودگیهای نفتی و دارا بودن فاکتورهای تقویت کننده گی رشد گیاه میتوان آنها را به عنوان گزینه ای مناسب برای استفاده در پدیده زیست پالایی خاکهای آلوده پیشنهاد کرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Evaluation of Effective Factors on Survival and Activity of Petroleum Degradation Bacteria in Bioremediation Process

نویسندگان [English]

  • soma narimani
  • eydi bazgir
  • hossein mirzaei najafgholi

lorestan university

چکیده [English]

Tang Fany petroleum Pumping Station (TFOPS) of Poldokhtar is an important and the old point of oil transition. The soil and water around this site is petroleum polluted due leakage of petroleum. The purpose of this study was to evaluate effective factors for survival and fitness of the petroleum degrading bacteria. The following bacterial species were isolated and identified from petroleum polluted soil and water in TFOPS region: Pseudomoas aeruginosa, Acinetobacter junii, Acinetobacter buumanii, Delftia tsuruhatensis, Comamonas Koreensis, Sphinobacterium multivorum and Stenotrophomonas acidaminiphila. The MIC and MBC were determined relative to oil whit the macrodilution method. The bacterial species Compared and evaluated on the factors ability to form a bacterial biofilm, siderophore production, indole acetic acid and dissolve phosphate. Two species namely P. aeruginosa and C. koreensis showed the highest and the least petroleum concentration tolerance, respectively. The two species also have the highest and the least biofilm production ability, respectively. Acinetobacter junii and A. baumannii in the test of dissolution of phosphate, most were able to dissolve phosphate. Sphingobacterium multivorum highest produced indole acetic acid. Due to the ability of the bacterial species to tolerate oil pollution and factors to promote plant growth, it can be suggested as alternative for application in the Bioremediation of contaminated soil events.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Pollution Petroleum
  • Bacteria
  • Bioremediation
  • Biofilm
  • Indole Acetic Acid

بررسی فاکتورهای مؤثر بر بقاء و فعالیت باکتریهای تجزیه کننده نفت در فرآیند زیست‌پالایی 

سوما نریمانی، عیدی بازگیر* و حسین میرزایی نجفقلی

لرستان، دانشگاه لرستان، دانشکده کشاورزی، گروه گیاهپزشکی

تاریخ دریافت: 18/4/94                تاریخ پذیرش: 25/11/94

چکیده

مرکز انتقال نفت شهدای تنگ فنی شهرستان پلدختر یکی از مراکز مهم انتقال نفت است که فرسودگی خطوط انتقالی سبب آلودگی خاک و آب این منطقه شده است. با توجه به ضرورت تحقیقات جهت زیست­پالایی در این منطقه، گونه­های باکتریایی از نواحی آلوده جداسازی و شناسایی شدند. هدف از این پژوهش بررسی فاکتورهای مؤثر بر بقاء و برازش باکتریهای تجزیه کننده نفت است. در این پژوهش از باکتریهای Pseudomonas aeruginosa، Acinetobacter junii، Acinetobacter baumannii،Delftia tsuruhatensis،Sphingobacterium multivorum،Stenotrophomonas acidaminiphila  وComamonas koreensisجداسازی شده از خاک و آب آلوده به نفت منطقه پلدختر استفاده گردید. ابتدا حداقل غلظت بازدارندگی و کشندگی نفت بر این باکتریها به روش ماکرودیلوشن بر حسب میکرولیتر بر میلی لیتر نفت سفید تعیین گردید. سپس گونه­های باکتری از نظر فاکتورهای توانایی تشکیل ساختارهای بیوفیلم، تولید سیدروفور، توانایی انحلال فسفات و تولید ایندول استیک اسید مورد مقایسه و بررسی قرار گرفتند. گونه­هایPseudomonas aeruginosa و Comamonas koreensis به ترتیب بیشترین و کمترین میزان تحمل به نفت را نشان دادند. همچنین گونه Pseudomonas aeruginosa بیشترین توانایی را در تولید سیدروفور و تشکیل ساختار بیوفیلم باکتریایی را نشان داد. در آزمون انحلال فسفات گونه­های Acinetobacter junii و Acinetobacter baumannii بیشترین توانایی در انحلال فسفات را دارا بودند. همچنین گونه Sphingobacterium multivorum بیشترین میزان ایندول استیک اسید را تولید نمود.با توجه به توانایی این گونه­های باکتریایی در تحمل آلودگیهای نفتی و دارا بودن فاکتورهای تقویت­کنندگی رشد گیاه می­توان آنها را به عنوان گزینه­ای مناسب برای استفاده در پدیده زیست­پالایی خاکهای آلوده پیشنهاد کرد. 

واژه های کلیدی: آلودگی نفتی، باکتری، زیست پالایی، بیوفیلم ، ایندول استیک اسید.

* نویسنده مسئول، تلفن: 09167425869، پست الکترونیکی: Mirzaeih89@gmail.com

مقدمه

 

فرآورده‌های نفتی یکی از پرمصرف‌ترین مواد شیمیایی در دنیای امروز هستند و به عنوان تهدیدی جدی برای محیط زیست محسوب می­گردند. این مواد در حین تولید، انتقال، استفاده نامناسب و نشت، سبب آلودگی خاک می‌شوند (37). از بین ترکیبات نفتی، هیدروکربنهای آروماتیک چند حلقه­ای (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons) به علت پایداری بالا در محیط و اثرات مضری که بر سلامت انسان دارند، مورد توجه می‌باشند. هیدروکرینهای آروماتیک چند حلقه‌ای گروه بزرگی از ترکیبات آلی با دو یا چند حلقه آروماتیک هستند. این ترکیبات نسبتاً خنثی با حلالیت کم در آب، چربی دوست و بسیاری از آنها در فشار کم بخار می‌شوند (23). این ترکیبات حاصلخیزی، نفوذپذیری، ظرفیت نگهداری آب و ظرفیت اتصال خاک را کاهش می‌دهند، به طوری که امکان دارد خاک غیرقابل استفاده شود (6 و 19).

روشهای متعدد فیزیکی، شیمیایی، زیستی و گیاه پالایی(Phytoremediation) برای اصلاح خاکهای آلوده وجود دارد، اما با توجه به هزینه بالا و عوارض جانبی روشهای فیزیکی- شیمیایی، استفاده از روشهای زیستی در اولویت قرار گرفته است (31). در طول چند دهه گذشته، تجزیه ‌زیستی آلاینده­های (Bioremediation) خاکهای آلوده به عنوان یک موضوع مهم در پژوهشهای زیست محیطی مطرح بوده و بسیاری از راهکارهای تجزیه ‌زیستی، برای کاهش آلودگی این خاکها بهبود یافته اند (37). فناوری‌ زیست‌ پالایی بر پایه استفاده از ریزجانداران طبیعی موجود و یا ریزجانداران ایجاد شده به‌ وسیله مهندسی ژنتیک به ‌منظور احیای مجدد مکانهای آلوده و حفاظت از محیط ‌زیست استوار است. کاربرد موفق تجزیه زیستی، وابسته به شناسایی و جداسازی سویه‌های میکروبی مناسب است که توانایی تجزیه آلاینده‌ها را دارند (24).

ناحیه ریزوسفر، زیستگاه بسیار کوچک و پویایی را برای ریزجانداران خاک فراهم می‌آورد که در آن، ریزجانداران مرتبط با ریشه گیاه، اجتماعی منحصر به فرد با پتانسیل قابل ملاحظه برای سم‌زدایی از ترکیبات زائد سمی را تشکیل می‌دهند. برخی از باکتریهای افزایش دهنده رشد گیاه، دارای توانایی فوق‌العاده‌ای جهت بهبود رشد گیاه میزبان از طریق مکانیسمهای مختلف مانند تولید سیدروفور، ایندول استیک اسید و انحلال فسفات می‌باشند. همچنین این باکتریها برای کاهش آلاینده‌های خاک و معدنی کردن ترکیبات آلی مورد استفاده قرار می­گیرند (20 و 22). اسیتکن (Esitken) و همکاران (15) در سال 2009 نقش هورمونهای گیاهی را در واکنش گیاهان نسبت به تنشهای زیستی و غیرزیستی نشان داده­اند.

با توجه به پژوهشهای انجام شده سویه‌های باکتریایی متعلق به جنسهای Pseudomonas، Bacillus، Rhizobium، Agrobacterium، Microccocus، Flavobacterium، Erwinia، Burkholderia، Achromobacter، Erobacterو  Delftiaتوانایی انحلال فسفات را دارند (22).

در این پژوهش از باکتریهای Pseudomonas aeruginosa، Acinetobacter junii، Acinetobacter baumannii، Delftia tsuruhatensis، Sphingobacterium multivorum، Stenotrophomonas acidaminiphila  وComamonas koreensis جداسازی شده از خاک و آب آلوده به نفت منطقه تنگ فنی پلدختر استفاده گردید (5). هدف از این مطالعه تعیین حداقل غلظت بازدارنده و کشنده نفت از رشد گونه­های باکتریایی و بررسی فاکتورهای مؤثر بر بقاء و فعالیت این باکتریها مانند تشکیل بیوفیلم، انحلال فسفات، سیدروفور و تولید ایندول استیک اسید به عنوان تجزیه­کنندگان نفت و افزایش دهنده رشد گیاه می­باشد.

مواد و روشها

تعیین حداقل غلظت بازدارنده و کشنده نفت بر رشد گونه­های باکتریایی: به منظور تعیین حداقل غلظت بازدارنده و کشنده نفت (Minimum Inhibitory Concentration) از رشد گونه­های باکتریایی از محیط­کشت NB (Nutrient Broth) حاوی رقتهای 200، 300، 400، 425، 450، 475، 500، 525، 550، 575 و 600 میکرولیتر بر میلی­لیتر نفت سفید استفاده شد. ابتدا جمعیت CFU/ml 108 گونه­های باکتریایی تهیه و مقدار 25 میکرولیتر به درون میکروتیوبهای 2 میلی­لیتری حاوی 975 میکرولیتر از رقتهای ذکر شده، اضافه گردید. میکروتیوبها به مدت 48 ساعت بر روی شیکر انکوباتور با سرعت 170 دور بر دقیقه در دمای 28 درجه سانتی گراد نگهداری شدند. سپس با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر جذب نوری نمونه­ها در طول موج 600 نانومتر اندازه­گیری شد. همچنین میزان 50 میکرولیتر از هر نمونه درون  پتری NA کشت و به مدت 24 ساعت در دمای 28 درجه درون انکوباتور نگهداری شدند. حداقل غلظت کشنده (minimum bactericidal concentration) براساس عدم رشد بر روی محیط­کشت NA تعیین گردید (14و 25).

بررسی توانایی گونه­های باکتریایی در تشکیل بیوفیلم: جهت بررسی کمی و کیفی تشکیل بیوفیلم از روش میکروپلیت الیزا استفاده گردید. ابتدا از کشت 24 ساعته گونه­های باکتریایی، جمعیت CFU/ml 1010 تهیه گردید. میزان 100 میکرولیتر از محیط­کشت Luria Bertani broth (merck) درون چاهکهای پلیت الیزا ریخته شد، سپس میزان 10 میکرولیتر از سوسپانسیون گونه­های باکتریایی به درون هر چاهک حاوی محیط کشت اضافه و به مدت 24 ساعت و 50 دور در دقیقه روی شیکر قرار داده شد. بعد از 24 ساعت، پلیت با آب مقطر سترون شست و شو داده شد. بعد از خشک شدن چاهکهای پلیت، میزان 125 میکرولیتر محلول کریستال ویوله 1 درصد به هر کدام از چاهکها اضافه و به مدت 15-10 دقیقه انکوبه شد. بعد از انکوباسیون، مجدداً پلیت با آب مقطر سترون شست و شو داده شد. سپس توسط میکروسکوپ نوری تشکیل ساختارهای بیوفیلم از لحاظ کیفی بررسی شد. همچنین برای سنجش نیمه کمی بیوفیلم 125 میکرولیتر از محلول اسید استیک 30 درصد به هر کدام از چاهکها اضافه و به مدت 15-10 دقیقه انکوبه شد. در نهایت جذب نوری هر چاهک با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 550 نانومتر اندازه‌گیری شد. نتایج سنجش نیمه کمی توسط نرم افزار ver.9.2 SAS مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت (16).

بررسی میزان انحلال فسفات توسط جدایه‌های باکتریایی: به منظور بررسی کیفی انحلال فسفات توسط گونه­‌های باکتریایی از محیط­کشت اسپربر_آگار (Sperber Agar merck) استفاده گردید. ابتدا گونه‌های باکتریایی به صورت نقطه­ای در مرکز تشتکهای پتری حاوی محیط­کشت اسپربر_آگار کشت گردید و به مدت هفت روز در دمای 28 درجه سانتی گراد درون انکوباتور نگهداری شد. ایجاد هاله شفاف اطراف پرگنه باکتری نمایانگر فعالیت حل کنندگی فسفات معدنی می­باشد. همچنین به منظور تخمین کمی توانایی انحلال فسفات توسط جدایه­ها، از محیط­کشت اسپربر مایع استفاده شد. ابتدا سوسپانسیون CFU/ml 109 از گونه­های دارای توانایی انحلال فسفات تهیه شد و میزان 50 میکرولیتر سوسپانسیون از هر جدایه باکتری به 25 میلی­لیتر محیط­کشت اسپربر مایع اضافه و به مدت 5 روز روی شیکر با سرعت 170 دور در دقیقه و دمای 28 درجه­سانتی گراد نگهداری شد. سپس با استفاده از سانتریفیوژ به مدت 10 دقیقه با سرعت 10000 دور در دقیقه سلولهای باکتری رسوب داده شد و یک میلی­لیتر از محلول رویی با سه میلی­لیتر آب مقطر و یک میلی­لیتر معرف آمونیوم مولیبدات- وانادات مخلوط گردید. پس از 20 دقیقه، شدت جذب نوری هر نمونه با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر در طول موج 430 نانومتر قرائت شد و مقدار فسفر محلول در محیط کشت در مقایسه با منحنی استاندارد محاسبه شد (34). محلولهای استاندارد فسفر در غلظتهای 05/0، 1/0، 15/0، 2/0، 25/0، 3/0، 35/0 و 4/0 میلی گرم بر لیتر تهیه شده و با استفاده از معادله
(y= 52.955x + 0.0181) غلظت فسفر مشخص گردید.

بررسی تولید سیدروفور توسط باکتریها: به منظور ارزیابی کیفی تولید سیدروفور توسط گونه‌های باکتریایی از آزمون کروم آزورول- سولفونات (CAS) آگار استفاده شد (33). پس از تهیه محیط کشت، 20 میکرو‌لیتر از سوسپانسیون CFU /ml 108 هر باکتری به روش قطره‌گذاری در مرکز تشتک پتری قرار داده شد و سپس تشتکهای پتری به‌ مدت 5 روز و دمای 28 درجه سانتی گراد انکوبه شدند. تغییر رنگ محیط کشت از آبی ‌تیره به نارنجی روشن (زرد)، نشان‌دهنده تولید سیدروفور توسط گونه‌های باکتریایی بود. همچنین به منظور مقایسه میزان تولید سیدروفور توسط گونه­های باکتریایی از آزمون CAS شاتل (CAS-Shuttle) استفاده شد. سپس مقدار ضریب جذب هر گونه باکتریایی در طول موج 630 نانومتر تعیین گردید (9).

بررسی تولید ایندول استیک اسید (IAA) توسط باکتریها: بررسی تولید ایندول استیک اسید توسط گونه‌های باکتریایی‌، بر اساس روش گلیک‌من و دساکس (1995) تعیین گردید. 5 میلی‌لیتر از سوسپانسیون CFU/ml 108 از گونه‌های باکتری به محیط کشت دورکین و فاستر (DF) حاوی 200 میلی‌گرم بر ‌لیتر ال-تریپتوفان (L-Tryptophan) تلقیح گردید. بعد از رسوب سلولهای باکتریایی توسط دستگاه سانتریفیوژ به مدت 15 دقیقه و با سرعت 11000 دور بر دقیقه، مقدار یک میلی لیتر از مایع رویی به دو میلی‌لیتر از معرف سالکووسکی اضافه و ورتکس گردید (12). گسترش رنگ صورتی بعد از 25 دقیقه نشان‌دهنده تولید IAA توسط گونه‌های باکتریایی بود (32). میزان تولید IAA توسط هر جدایه باکتری از طریق اندازه‌گیری میزان جذب محلول در طول موج 535 نانومتر و مقایسه با منحنی استاندارد محاسبه شد (12). محلولهای استاندارد IAA در غلظتهایppm  5، 10، 15، 20 و 30 تهیه شده و با استفاده از معادله این منحنی (y = 34.18x + 0.53) غلظت IAA در نمونه‌های مجهول محاسبه شد. قابل ذکر است که برای تهیه محلولهای استاندارد IAA به‌ جای آب مقطر از محیط کشت دورکین و فاستر (DF) و 200 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر ال-تریپتوفان استفاده گردید تا ماده زمینه‌ای‌ در نمونه‌های استاندارد و نمونه‌های باکتریایی یکسان باشد (35).

طرح آزمایشی و تحلیل نتایج: تمامی آزمایشها در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار در هر تیمار انجام گرفت. تجزیه و تحلیل داده­ها با استفاده از نرم­افزار SAS صورت پذیرفت. میانگینها بر پایه آزمون LSD در سطح احتمال یک درصد مورد مقایسه قرار گرفت.

نتایج

در این پژوهش از باکتریهای جدا شده از منطقه آلوده به نفت پلدختر استفاده شد و جدایه­های باکتریایی از نظر تشکیل ساختارهای بیوفیلم، میزان تولید سیدرفور، ایندول استیک اسید و انحلال فسفات مورد بررسی قرار گرفتند. بافت خاک منطقه از نوع لومی­شنی و میزان ماده آلی آن 1.443 درصد محاسبه گردید.

حداقل غلظت بازدارنده و کشنده نفت بر گونه­های باکتری: با مقایسه میانگینها در بین گونه­های مورد استفاده، گونه Pseudomonas aeruginosa بیشترین میزان تحمل به ترکیبات نفتی را را دارا بود و گونه Comamonas koreensis کمترین میزان تحمل به ترکیبات نفتی را نشان داد. سایر نتایج حداقل غلظت بازدارنده و کشنده نفت در جدول 1 نشان داده شده است.

 

جدول 1- نتایج حداقل غلظت بازدارندگی و کشندگی نفت از رشد گونه­های باکتری

گونه­های باکتریایی

حداقل غلظت بازدارندگی (میکرولیتر بر میلی لیتر)

حداقل غلظت کشندگی (میکرولیتر بر میلی لیتر)

Pseudomonas aeruginosa

575

600

Sphingobacterium multivorum

400

425

Stenotrophomonas acidaminiphila

400

450

Comamonas koreensis

400

475

Delftia tsuruhatensis

550

575

Acinetobacter baumannii

500

525

Acinetobacter junii

550

575


بررسی توانایی جدایه­های باکتریایی در تشکیل بیوفیلم: با مقایسه میانگینها در بین گونه­های مورد استفاده، گونه Pseudomonas aeruginosa بیشترین میزان توانایی تشکیل بیوفیلم را دارا بود و گونه Comamonas koreensis کمترین میزان تشکیل بیوفیلم را نشان داد. سایر نتایج توانایی تشکیل بیوفیلم توسط گونه­های باکتریایی در نمودار 1 نشان داده شده است.

 

نمودار 1- مقایسه توانایی گونه­های باکتریایی در تشکیل ساختارهای بیوفیلم باکتریایی ( طول موج 550 نانومتر)

بررسی میزان انحلال فسفات توسط جدایه‌های باکتریایی: ظهور هاله شفاف اطراف کلنی باکتری در محیط­کشت حاوی فسفات معدنی نمایانگر توانایی انحلال فسفات است. باکتریهای Pseudomonas aeruginosa، Acinetobacter junii، Acinetobacter baumannii،Delftia tsuruhatensis، ،Stenotrophomonas acidaminiphila  توانایی انحلال فسفات را دارا بودند (نمودار 2). همچنین گونه­های Acinetobacter junii، Acinetobacter baumannii به ترتیب با تولید 3/374 و 8/369 میکرو­گرم بر میلی­لیتر فسفات توانایی بیشتری در انحلال فسفات داشتند.

بررسی میزان تولید سیدروفور توسط جدایه­های باکتریایی: گونه­های Pseudomonas aeruginosa، Acinetobacter junii  و  Delftia tsuruhatensis   توانایی

تولید سیدروفور را دارا بودند. 

 

نمودار 2- مقایسه توانایی گونه­های باکتریایی در انحلال فسفات (میکرو‌گرم بر میلی­لیتر)

گونه­های Pseudomonas aeruginosa و Delftia tsuruhatensis به ترتیب بیشترین و کمترین میزان تولید سیدروفور را از خود نشان دادند (نمودار 3). 

 

نمودار 3- مقایسه تولید سیدروفور توسط گونه­های باکتریایی در طول موج 630 نانومتر

بررسی میزان تولید ایندول استیک اسید: تمامی گونه­های باکتریایی توانایی تولید میزان ایندول استیک اسید را داشتند (نمودار 4). گونه­های باکتری Sphingobacterium multivorum و Comamonas koreensis به ترتیب با مقدار میانگین 09/3 و 74/0 میلی­گرم بر لیتر بیشترین و کمترین میزان ایندول استیک اسید را تولید کردند.

بحث

در این پژوهش از باکتریهای جداسازی شده از مناطق نفتی

پلدختر استفاده گردید (5).

 

نمودار 4- مقایسه توانایی گونه­های باکتریایی در تولید ایندول استیک اسید (میلی‌گرم بر ­لیتر)

فاکتورهای حداقل غلظت بازدارنده و کشنده، میزان توانایی گونه ها در تشکیل بیوفیلم، تولید ایندول استیک اسید، انحلال فسفات و تولید سیدرفور مورد بررسی قرار گرفت. که گونه Pseudomonas aeruginosa بیشترین توانایی در تشکیل بیوفیلم و تولید سیدروفور را دارا بود. همچنین تمامی گونه ها توانایی تولید ایندول استیک اسید را دار بودند.

پیشرفت سریع تکنولوژی در مواردی سبب آلودگی منابع طبیعی و محیط زیست گردیده است. خاک به عنوان یکی از اجزای مهم محیط زیست، دریافت کننده آلاینده‌های مختلف مانند هیدروکربنهای نفتی، پسماند‌های صنعتی و کشاورزی است. با وجود انعطاف پذیری ذاتی، به علت استفاده و مدیریت نادرست، خاک مستعد تخریب و کاهش کیفیت است. در نتیجه آلودگیهای خاک به عنوان یک مانع عمده در توسعه پایدار مطرح است (30). از مهم‌ترین اثرات مضر این ترکیبات در خاک می‌توان به کاهش حاصلخیزی خاک، ظرفیت نگهداری آب، نفوذپذیری و ظرفیت اتصال خاک اشاره کرد (6). در طول چند دهه گذشته، زیست پالایی خاکهای آلوده یک موضوع مهم در پژوهشهای زیست­محیطی می‌باشد (37). برای تاثیر این فرآیند، میکروارگانیسم‌ها از جمله باکتریها از طریق سیستم آنزیمی آلاینده‌ها را به محصولات بی ضرر تبدیل می‌کنند (26 و 30).

در بررسی حداقل غلظت بازدارنده و کشنده نفت بر علیه باکتریهای، گونه Pseudomonas aeruginosa بیشترین میزان تحمل به ترکیبات نفتی را دارا بود. در این پژوهش گونه Pseudomonas aeruginosa بیشترین تحمل و راندمان حذف نفت را از خود نشان داد، که با پژوهش محسن زاده و همکاران (1391) مطابقت داشت (4).  با مقایسه میانگینها در بین گونه­های مورد استفاده، گونه  Pseudomonas aeruginosaبیشترین میزان توانایی تشکیل بیوفیلم را دارا بود. بیوفیلم در باکتریهای تجزیه­کننده نفت به عنوان یک سد فیزیکی برای جلوگیری از ورود هیدروکربنهای آروماتیک چند حلقه‏ای به درون غشاء عمل می­کند (36). همچنین ساختارهای بیوفیلم باکتریایی سبب مقاومت در برابر مواد مضر مانند ترکیبات فنولی می­شود و پس از گذشت مدت زمانی باکتری توانایی مصرف و تجزیه آنها را پیدا ‌می­کند(3). بنابراین بالا بودن قابلیت تشکیل بیوفیلم توسط گونه­های Delftia tsuruhatensis و Pseudomonas aeruginosa می­تواند سبب سهولت استقرار این گونه­ها در محیطهای تحت تنش شود. 

از دیگر فاکتورهایی که سبب بهبود رشد و استقرار بهتر گیاهان در محیطهای آلوده به تنش می­شود، قابلیت تولید سیدروفور توسط گونه­های باکتریایی کلونیزه کننده ریشه می­باشد. تولید سیدروفور توسط گونه­های باکتریایی Pseudomonas aeruginosa، Acinetobacter junii و Delftia tsuruhatensis توسط محقیقن مختلف مانند بوپاتی (Boopathi)و راوو، بویسن (Buysens) و همکاران، دوغاری (Doughari) و همکاران، هان (Han) و همکاران، طهماسبی و همکاران و صغیرخان  (Saghir Khan) و همکاران گزارش شده است (1، 8، 10، 13 و 21).  باکتریها به منظور تأمین آهن مورد نیاز خود، در شرایط کمبود آهن سیدروفور تولید می­کنند (2). همچنین باکتریها محرک رشد گیاه برای کاهش سمیت آلاینده­ها در گیاهان، با تولید سیدروفور آهن را در اختیار گیاه قرار می­دهند (11 و 18).

همه باکتریها قابلیت تولید ایندول استیک اسید را دارا بودند. در پژوهش حاضر نیز تمامی گونه های باکتریایی مورد استفاده توانایی تولید ایندول استیک اسید را دارا بودند. ایندول استیک اسید، وظایف متنوعی را در رشد و نمو گیاهان بر عهده دارد و در شکل‌دهی به ساختمان ریشه گیاه، تمایز بافتهای آوندی، تنظیم نمو ریشه‌های جانبی، قرارگیری قطبی تارهای کشنده و جاذبه‌گرایی ریشه نقش دارد (7). همچنین IAA به عنوان یک مولکول سیگنال در باکتریها عمل می‌کند و به طور مستقیم بر فیزیولوژی باکتریها تأثیرگذار است (29). بر اساس برآوردهای صورت گرفته حدود 80 درصد از باکتریهای خاک از توانایی ترشح هورمون گیاهی ایندول-3-استیک اسید برخوردار هستند (27 و 28). برخی از ریزوباکتریهای محرک رشد گیاه به واسطه سنتز هورمون گیاهی ایندول استیک اسید قادرند از طریق تحریک تقسیم سلولی و طویل شدن سلولها، سبب ارتقای رشد ریشه گیاه تحت شرایط تنش‌زا گردند (17).

نتیجه­گیری

باکتریهای مورد استفاده در این پژوهش تواناییهای مختلفی مانند توانایی ایجاد ساختارهای بیوفیلم باکتریایی و تولید سیدروفور برای افزایش بقاء و فعالیت در شرایط تنش را از خود نشان دادند. در بین گونه­های باکتریایی، گونه Pseudomonas aeruginosa بیشترین توانایی در تولید سیدروفور و تشکیل بیوفیلم از خود نشان داد. همچنین با توجه به توانایی بالای گونه­های مورد استفاده در انحلال فسفات و تولید ایندول استیک اسید می­توان این گونه­ها را به عنوان ارتقاء دهندگان رشد و سازگاری گیاهان در شرایط تنش معرفی نمود.

تشکر و قدردانی

نویسندگان مقاله از دانشگاه لرستان به دلیل فراهم نمودن امکانات و تجهیزات کمال تشکر و قدردانی را دارند.

1- طهماسبی، ف. لکزیان، ا. خاوازی، ک و پاکدین پاریزی، ع. 1393. جداسازی، شناسایی و ارزیابی تولید سیدروفور در باکتریهای سودوموناس و تأثیر آن بر رشد ذرت در محیط آبکشت. مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی، جلد 27 (1) : 87-75.

2- رسولی صدقیانی، م. خاوازی، ک. رحیمیان، ح. ملکوتی م. ج و اسدی رحمانی، هادی. 1385. ارزیابی توان سویه های بومی سودوموناس های فلورسنت ریز و سفر گندم برای تولید سیدروفور. مجله علوم خاک و آب، جلد 20 (1) : 133 -143

3- فرزاد کیا، م. رضایی کلانتری، ر. موسوی، س. غ. جرفی، س و غلامی، م. 1388. تصفیه فاضلاب مصنوعی حاوی پروپیلن گلیکول در راکتور لجن فعال با بستر ثابت در مقیاس آزمایشگاهی. مجله آب و فاضلاب. جلد 1: 56-49.

4- محسن زاده، ف. 1391. بررسی راندمان زیست پالایی آلودگیهای نفتی توسط سویه های باکتریایی بومی جدا شده از خاکهای آلوده مناطق سردسیری (مطالعه موردی: پالایشگاه تبریز). مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی. جلد 27 (3): 417-406.

5- نریمانی، س. بازگیر، ع و میرزایی نجفقلی، ح. 1393. شناسایی باکتریهای تجزیه کننده نفت از مناطق آلوده پلدختر و بررسی فاکتورهای مؤثر بر کارآیی تجزیه در آنها. مجله فناوری زیستی در کشاورزی. جلد 13 (2): 19-11.

 

6- Alam khan j, Rizvi SHA. 2011. Isolation and characterization of microorganism from oil contaminated sites. Adv Appl Sci Res. 2(3): 455-460.

7- Aloni R, Aloni E, Langhans M, Ullrich CI. 2006. Role of cytokinin and auxin in shaping root architecture: regulating vascular differentiation, lateral root initiation, root apical dominance and root gravitropism. Ann. Bot. 97: 883–893.

8- Boopathi E, Rao KS. 1999. A siderophore from Pseudomonas putida type A1: structural and biological characterization. Biochim. Biophys. Acta. 1435(1): 30-40.

9- Burd GI, Dixon DG, Glick BR. 1998. A plant growth-promoting bacterium that decreases nickel toxicity in seedlings. Appl. Environ. Microbiol. 64: 3663–3668.

10- Buysens S, Heungens K, Poppe J, Hofte M. 1996. Involvement of pyochelin and pyoverdin in suppression of Pythium-induced damping-off of tomato by Pseudomonas aeruginosa 7NSK2. Appl. Environ. Microbiol. 62 (3): 865-871.

11- Crowley D, Wang Y, Reid C, Szaniszlo PJ. 1991. Mechanisms of iron acquisition from siderophores by microorganisms and plants. Plant Soil. 130 (1-2): 179-198.

12- Dell’Amico E, Cavalca L, Andreoni V. 2008. Improvement of Brassica napus growth under cadmium stress by cadmium-resistant rhizobacteriaSoil Biol. Biochem. 40: 74–84.

13- Doughari H J, Ndakidemi P A, Human I S, Benade S. 2011. The ecology, biology and pathogenesis of Acinetobacter spp.: an overview. Microbes Environ. 26 (2): 101-112.

14- Erriu M, Pili FMG, Tuveri E, Pigliacampo D, Scano A, Montaldo C, Piras V, Denotti G, Pilloni A, Garau V. 2013. Oil essential mouthwashes antibacterial activity against Aggregatibacter actinomycetemcomitans: a comparison between antibiofilm and antiplanktonic effects. Int. J. Paediatr. Dent. 1-5.

15- Esitken A, Pirlak L, Ipek M, Donmez MF, Cakmakci R, Sahin F. 2009. Fruit bio-thinning by plant growth promoting bacteria (PGPB) in apple cvs. Golden Delicious Braeburn. Biol Agric Hortic. 26: 379–390.

16- George A. 2011. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis Exp. (47).

17- Glick BR, Penrose DM, Li J. 1998. A model for the lowering of plant ethylene concentrations by plant growth promoting bacteria. J Theor Biol Biol. 190: 63–68.

18- Glick BR. 2003. Phytoremediation: synergistic use of plants and bacteria to clean up the environment. Biotechnol Adv. 21: 383–393.

19- Gojgic-Cvijovic GD, Milic JS, Solevic TM, Beskoski VP, Ilic MV, Djokic LS, narancic TM, Vrvic MM. 2012. Biodegradation of petroleum sludge and petroleum polluted soil by a bacterial consortium: a laboratory study. Biodegradation. 23: 1-14.

20- Gray EJ, Smith DL. 2005. Intracellular and extracellular PGPR: commonalities and distinctions in the plant-bacterium signaling processes. Soil Biol Biochem. 37: 395-412.

21- Han J, Sun L, Dong X, Cai Z, Sun X, Yang H, Wang Y, Song W. 2005. Characterization of a novel plant growth-promoting bacteria strain Delftia tsuruhatensis HR4 both as a diazotroph and a potential biocontrol agent against various plant pathogens. Syst Appl Microbiol. 28 (1): 66-76.

22- Hayat R, Ali S, Amara U, Khalid R, Ahmed I. 2010. Soil beneficial bacteria and their role in plant growth promotion: a review. Ann Microbiol. 60(4): 579-598.

23- Kanaly R A, Harayama S. 2000. Biodegradation of high-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by bacteria. J. Bacteriol. 182 (8): 2059-2067.

24- Leoni L, Ambrosi C, Petrucca A, Visca P. 2002. Transcriptional regulation of pseudobactin synthesis in the plant growth promoting Pseudomonas B10. Fems Microbiol Lett. 208 (2): 219-225.

25- Moghaddam M, Alymanesh MR, Mehdizadeh L, Mirzaei H, Pirbalouti AG. 2014. Chemical composition and antibacterial activity of essential oil of Ocimum ciliatum, as a new source of methyl chavicol, against ten phytopathogens. IND CROP PROD. 59: 144-148.

26- Mohite BV, Jalgaonwala RE, Pawar S Morankar A. 2010. Isolation and characterization of phenol degrading bacteria from oil contaminated soil. Innovat Rom Food Biotechnol. 7: 61-65.

27- Normanly J, Slovin JP, Cohen JD. 2004. Auxin biosynthesis and methabolism. In: Davies P.J. (ed) Plant hormones. Biosynthesis, signal transduction, action. Kluwer, Dordrecht. 36–62.

28- Saghir Khan M, Zaidi A, Ahmad Wani P, Oves A. 2009. Role of plant growth promoting rhizobacteria in the remediation of metal contaminated soils. Environ Chem Lett. 7:1–19.

29- Saharan BS, Nehra V. 2011. Plant Growth Promoting Rhizobacteria: A Critical Review. LSMR. 21: 1-30.

30- Sayara T, Pognani M, Sarrà M, Sánchez A. 2010.Anaerobic degradation of PAHs in soil: Impacts of concentration and amendment stability on the PAHs degradation and biogas production. Int Biodeterior Biodegradation. 64 (4): 286-292.

31- Shabir G, Afzal M, Anwar F, Tahseen R, Khalid ZM. 2008. Biodegradation of kerosene in soil by a mixed bacterial culture under different nutrient conditions. Int Biodeter Biodegr. 61(2), 161-166.

32- Sheng XF, Xia JJ. 2006. Improvement of rape (Brassica napus) plant growth and cadmium uptake by cadmium-resistant bacteria. Chemosphere. 64: 1036–1042.

33- Silva-Stenico ME, Pacheco FTH, Rodrigues JLM, Carrilho E, Tsai SM. 2005. Growth and siderophore production of Xylella fastidiosa under iron-limited conditions. Microbiol Res. 160: 429-436.

34- Sperber JI. 1958. The incidence of apatite-solubilizing organisms in the rhizosphere and soil. Aust. J. Agric. Res. 9: 778-781.

35- Torres-Rubio MG, Valencia-Plata SA, Bernal-Castillo J, Martinez-Nieto P. 2000. Isolation of Enterobacteria, Azotobacter sp. and Pseudomonas sp. producers of Indole-3-Acetic Acid and Siderphores from Colombian rice rhizospher. Rev Latinoam Microbiol. 5: 171-176.

36- Van Hammet J D, Singh A, Ward OP. 2003. Recent advances in petroleum microbiology. Microbiol Mol Biol R. 67 (4):503-549.

37- Xu Y, Lu M. 2010. Bioremediation of crude oil-contaminated soil: comparison of different biostimulation and bioaugmentation treatments.  J Hazard Mater. 183: 395-401.