نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد دانشگاه آزاداسلامی واحد ارومیه، گروه زیست شناسی

2 عضو هیئت علمی- دانشگاه آزاد ارومیه

3 استادیار دانشگاه دولتی مراغه

چکیده

با توجه به مقاومت باکتری ها نسبت به آنتی بیوتیک ها و عوامل ضد میکروبی مرسوم، تحقیقات بسیاری برای یافتن انواع جدید عوامل ضد میکروبی موثر انجام شد. با توسعه فناوری نانو، مس به طور فزاینده ای به شکل نانوذرات با فعالیتهای ضد میکروبی بالا و قیمت ارزان علیه همه باکتری های گرم منفی و گرم مثبت مورد استفاده قرار گرفته است.
در این تحقیق از نانو ذرات اکسیدمس با اندازه (کمتر از 20 نانومتر) برای بررسی اثر آن روی ژنوم باکتری استافیلوکوکس اورئوس به عنوان مدل برای باکتریهای گرم مثبت استفاده شد. بدین منظور ابتدا باکتریها را با غلظتهای 30 و 60 میکروگرم بر میلی لیتر با این نانوذرات تیمار کرده و در فاصله های زمانی 2، 4 و 24 ساعت خاصیت ضد میکروبی نانوذرات بررسی گردیده و استخراج DNA صورت گرفت. تکنیک واکنش زنجیره ای پلیمراز رپید ( RAPD-PCR) جهت بررسی تغییرات DNA ژنومی باکتری های تیمار شده به کار گرفته شد. با استفاده از نرم افزار NTSYS-PC، نتایج حاصل ازالکتروفورزیس محصولات PCR روی ژل آگارز مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
در این تحقیق مشاهده گردید نانو ذرات اکسیدمس علاوه بر اثر مهار کنندگی روی رشد باکتری های استافیلوکوکوس اورئوس روی توالی DNA ژنومی آن ها اثر گذاشته و باعث تغییرآن در نقاط مختلف گردیده است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

An investigation of the effect of copper nanoparticles on Staphylococcus aureus genome by RAPD molecular markers

نویسندگان [English]

  • nasrin zare 1
  • bahram golestani imani 2
  • farokh karimi 3

1 Islamic Azad University, Urmia Branch

3 Biotechnology Dept., University of Maragheh, Maragheh, I.R. of Iran

چکیده [English]

Regarding the bacterial resistence of common antibiotecs and anti-microbial agents , a great number of studies have been conducted to discover the recent types of anti-microbial agents. With the recent developments in nanotechnology, copper has been extensively used as nanoparticles against all positive-gram and to negative-gram particles due to its low price and high anti-microbial activity. In the present study, copper oxide nano particles of (

کلیدواژه‌ها [English]

  • "Copper oxide nanoparticles"
  • "Staphylococcus aureus"
  • "Rapid polymerase chain reaction"(RAPD-PCR)

بررسی اثر نانوذرات اکسید مس روی ژنوم باکتری استافیلوکوکوس اورئوس با استفاده از نشانگرهای مولکولی RAPD 

نسرین زارع1، بهرام گلستانی ایمانی1* و فرخ کریمی2

1 ارومیه، دانشگاه آزاداسلامی واحد ارومیه، گروه زیست شناسی

2 مراغه، دانشگاه مراغه، گروه بیوتکنولوژی

تاریخ دریافت: 14/6/94                تاریخ پذیرش: 12/12/94

چکیده

با توجه به مقاومت باکتریها نسبت به آنتی­بیوتیکها و عوامل ضد میکروبی مرسوم، تحقیقات بسیاری برای یافتن انواع جدید عوامل ضد میکروبی مؤثر انجام شده است. با توسعه فناوری نانو، مس به طور فزآینده­ای به شکل نانوذرات با فعالیتهای ضد میکروبی بالا و قیمت ارزان علیه همه باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت مورد استفاده قرار گرفته است. در این تحقیق از نانو ذرات اکسید مس با اندازه (کمتر از 20 نانومتر) برای بررسی اثر آن روی ژنوم باکتری استافیلوکوکس اورئوس به عنوان مدل برای باکتریهای گرم مثبت استفاده شد. بدین منظور ابتدا باکتریها را با غلظتهای 30 و 60 میکروگرم بر میلی­لیتر با این نانو ذرات تیمار کرده و در فاصله­های زمانی 2، 4 و 24 ساعت خاصیت ضد میکروبی نانوذرات بررسی گردیده و استخراج DNA صورت گرفت. تکنیک واکنش زنجیره ای پلیمراز رپید (RAPD-PCR) جهت بررسی تغییرات DNA ژنومی باکتری­های تیمار شده به کار گرفته شد. با استفاده از نرم افزار NTSYS-PC، نتایج حاصل ازالکتروفورزیس محصولات PCR روی ژل آگارز مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. در این تحقیق مشاهده گردید نانو ذرات اکسیدمس علاوه بر اثر مهار کنندگی روی رشد باکتریهای استافیلوکوک اورئوس روی توالی DNA ژنومی آنها اثر گذاشته و باعث تغییرآن در نقاط مختلف گردیده است.

واژه های کلیدی: نانوذرات اکسیدمس، باکتری استافیلوکوکوس اورئوس، واکنش زنجیره­ای پلیمراز رپید ( RAPD-PCR)

* نویسنده مسئول، تلفن: 32719900، پست الکترونیکی: golestani_bahram@yahoo.com

مقدمه

 

باکتریها در برابر آنتی بیوتیکها و بسیاری از عوامل ضد باکتریایی مقاومت پیدا کرده­اند که این مقاومت قابل توارث بوده و باعث ادامه بیماریهای عفونی می­شود که یکی از بزرگترین چالشهای سلامتی سراسر جهان است. این پیشرفت متناوب استراتژیهای درمانی باکتریها را بر می‍انگیزد (3 و 28). در چند دهه اخیر نانو مواد به دلیل ویژگیهای جدید شامل بزرگ بودن نسبت سطح به حجم و فعالیت مهاری بالا علیه باکتریها توجه زیادی پیدا کرده است (2 و 29). علاوه بر این، گزارش شده که نانوذرات با اندازه کوچک فعالیت ضد میکروبی خوبی از خود نشان داده­اند (5). در میان نانوذرات دیگر، اخیراً به نانو ذرات اکسید مس توجهات بیشتری شده است. نانوذرات ارزان به جای نانوذرات فلزی گران قیمت در سطح کاربردهای میکروالکتریکی پیشنهاد می­شوند و احتمالاً آنها آخرین مواد ضد میکروبی کشف شده­اند (11 و 27). بنا به گفته محققان نانو ذرات اکسید مس می توانند با DNA سیتوپلاسمیک باکتری و پروتئینهای باکتریایی به خصوص آنزیمهایی که در مراحل حیاتی  سلول همانند زنجیره انتقال الکترون شرکت دارند وهمچنین باپپتید وگلیکانهای دیواره سلولی و غشای پلاسمایی واکنش داده و باعث تخریب کامل غشای باکتری شوند(8). علاوه براین نانوذرات اکسید مس مستقیماً با ارگانهای اکسیداتیو مانند میتوکندری و پروتئینهای فعال واکنش می­دهند و تولید ROS را در سلولها تحریک می­کنند. یونهای مس که به وسیله نانوذرات تولید می­شوند می­توانند به وسیله واکنش­های شیمیایی مختلف، تولید ROS را در سلولها القاء کنند. ROS نیز به نوبه خود می­تواند شکستن DNA تک رشته­ای را القاء کرده و در بیان ژن اثر بگذارد(4 و 12). همچنین بنابه گفته محققان نانوذرات اکسید مس ممکن است کاتیونهای مس آزاد کند که باعث افزایش غلظت یونهای فلزی در آن محل شود و کاتیونهای فلزی هموستازیس سلول باکتری را مختل کند(7). نانوذرات اکسید مس ممکن است باعث ایجاد جهش در باکتری گردیده و با تغییر در خاصیت جفت شدن بازی، بازها در  فعالیت ضد باکتریایی شرکت کند(10).  به دلیل اثرات ضد میکروبی نانوذرات مس، این  مواد در بسیاری از محصولات تجاری، بهداشتی، پزشکی و همچنین در صنایع  مهندسی مانند کاتالیزگرها، وسایل نوری و کاربرد‌های الکترونیک به کار می‌روند. علاوه بر فعالیت ضد میکروبی این نانوذرات، اثر ضدویروس و ضد قارچ این نانوذرات  نیز گزارش  شده است(19). نانوذرات می تواند در شرایط نامساعد مانند دمای بالای استریلیزاسیون، که تحت آن آنتی بیوتیکهای مرسوم غیرفعال می­شوند مقاومت کنند. نانوموادی که در تحویل آنتی بیوتیکها استفاده می­شود دارای مزیت چندگانه 1- توزیع شکل یکنواخت در بافت هدف 2- بهبود قابلیت حل شدن 3- رهاسازی کنترل شده و تحمیل شده هستند(17). بر روی فعالیت ضد میکروبی نانوذرات روی باکتریهای بیماریزای انسان مانند اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس مطالعه زیادی شده است (24).

یک مطالعه اثبات مفهوم اثر ضد عفونی کنندگی از اکسید مس در سه سطح انجام شده است. سطوح توسط رسوب اکسید مس با استفاده از سه روش اسپری حرارتی، پلاسما اسپری واسپری سرد تولید شد. سپس سطوح با باکتری استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به methicillin(MRSA) آلوده شدند و بعد از دو ساعت قرارگرفتن این سطوح در برابر MRSA ، بازده کشندگی MRSA در روش رسوب گذاری با اسپری سرد به صورت مؤثری کاهش یافت که ناشی از سرعت بالای ذرات اسپری شده است. اثر سرعت بالاروی ذرات به روش اسپری سرد باعث افزایش ساختار ریز اکسید مس و انتشار یونی می شود و این یونهای اکسید مس مسئول فعالیت آنتی میکروبی هستند(26). نانو ذرات به هنگام استفاده به عنوان ماده ضد باکتریایی بر روی سلولهای یوکاریوتی و سایر ارگانیسمها نیز اثر گذارند. لذا باید برای به دست آوردن غلظتهای مؤثر ضد باکتریایی و تاثیر ژنوتوکسیکی آن به عنوان جایگزینی مناسب برای آنتی بیوتیکها و مواد ضد عفونی کننده  بدون ضرر، بیشتر بررسی گردد (20). از آنجایی که تاکنون اثر ضد باکتریایی از طریق اثر نانوذرات مس روی ژنوم بررسی نشده است. این تحقیق به منظور بررسی اثر دزهای مختلف در زمانهای متفاوت تیماری نانو ذرات اکسیدمس روی ژنوم استافیلوکوک اورئوس به عنوان باکتری مدل صورت گرفت که بدین منظور از تکنیک (RAPD-PCR)  در این مطالعه استفاده شده است.

مواد و روشها

کشت باکتری و شرایط کشت، پس از انجام کشت افتراقی روی محیط ائوزین متیلن بلو و انجام تست کاتالاز برای اطمینان از نوع باکتری، باکتری در 5 میلی لیترمحیط BHBbroth  به مدت یک شبانه روز در انکوباتور شیکردار در دمای 37 درجه سانتی گراد با دور rpm 200 کشت داده شد و میزان رشد باکتریها از طریق اندازه گیری چگالی نوری (OD) محیط کشت در طول موج 600 نانومتر کنترل گردید.(1)

تهیه نانو ذرات اکسید مس: نانوذرات اکسید مس با قطر کمتر از 20 نانومتر که توسط گروه بیوتکنولوژی دانشگاه دولتی مراغه سنتز و در اختیار این تحقیق قرار گرفت. مشخصات آن توسط میکروسکوپ الکترونی آنالیز گردید. برای تهیه محلول استوک از بافر فسفات سالین با PH: 7.4 به عنوان حلال نانوذرات اکسید مس استفاده شد.  

بررسی خاصیت ضد میکروبی نانوذرات اکسید مس: جهت بررسی اثر نانوذرات، باکتریها با غلظتهای 30 و 60 میکروگرم بر میلی لیتر نانوذره اکسید مس در انکوباتورشیکر دار در دمای 37 درجه سانتی گراد با دور rpm200  تیمار شدند. چگالی نوری هر کدام از لوله­های آزمایش در طول موج 600 نانومتر و در فاصله های زمانی 4،2 و 24 ساعت جهت سنجش رشد جمعیت باکتریها اندازه گیری شد.

استخراج DNA:  DNAی ژنومی باکتری شاهد و تیمار شده با استفاده از کیت استخراج دی ان آ (شرکت ژن مارک) مطابق با دستورالعمل کیت مذکور استخراج گردیده و کمیت و کیفیت آن با استفاده از روش اسپکتروفتومتری و الکتروفورزیس روی ژل آگاروز 1 درصد آنالیز گردید.

انجام واکنش زنجیره پلیمراز RAPD-PCR: DNA ژنومی، با استفاده از 15 پرایمر 10 جفت بازی RAPD- PCR که به طور تصادفی انتخاب شده و از دانشگاه  دولتی مراغه تهیه شده بودند، تکثیر شد. توالی پرایمر های مورد استفاده در جدول (1 )، ذکر شده است. بدین ترتیب که مقدار1 میکرولیتر پرایمر، 5/2 میکرولیتر (x10) PCRbuffer، 3 میکرولیتر  MgCl2 ، 1 میکرولیتر dNTP ، 1 میکرولیتر از  نمونه  DNA  استخراج  شده و 3/0 میکرولیتر polymerase TaqDNA که با 2/16 میکرولیتر آب مقطر دیونیزه به حجم 25 میکرو   لیتر رسانده  شد. واکنش PCR دردستگاه ترموسایکلر (Corbettresearch, Australia) با  برنامه زیر انجام گرفت: واسرشت شدن اولیه DNA الگودر دمای  95 درجه سانتی گراد به مدت  5 دقیقه و 40  سیکل به ترتیب، دمای 95 درجه سانتی گراد  به مدت 35  ثانیه جهت واسرشت شدن رشته‌های DNA  الگو، دمای 30 درجه سانتی گراد  به  مدت 45 ثانیه  جهت  اتصال پرایمرها به رشته‌های  الگو، دمای 72  درجه  سانتی گراد  به مدت  45  ثانیه  جهت سنتز رشته  جدید از روی رشته الگو و7  دقیقه جهت تکمیل  سنتز رشته‌های  ناقص  به  کار گرفته  شد.

جدول1- توالی نوکلئوتیدی پرایمرهای مورداستفاده

توالی نوکلئوتیدی پرایمر 

نام پرایمر 

GTCGTTCCTG

OPS13

ACAGGTGCGT

OPR12

GGGTAACGCC

OPA09

TCTGGTGAGG

OPT17

TCCTGGTCCC

OPS09

GTGATCGCAG

OPB08

CAATCGCCGT

OPA11

GGTGACGCAG

OPB07

CTCACCGTCC

OPC09

AATGCCGCAG

OPT14

AGTCGGGTGG

OPS11

GTGATCGCAG

OPA10

GGACGCTTCA

OPQ14

GTAGCCGTCT

OPR11

TCTGGTGAGG

OPS03

بررسی نتایج RAPD – PCR: بعد از اتمام واکنش PCR، جهت آشکارسازی باندها، 10 میکرولیتراز محصول PCR روی ژل آگارز 2 درصد  با ولتاژ 120 ولت الکتروفورزیس گردید.

آنالیز داده های حاصل از الکتروفورزیس محصولات PCR: باند های مشاهده شده روی ژل آگارز براساس وجود یا عدم وجود آنها برای هر پرایمر، به ترتیب به صورت یک و صفر امتیازدهی گردید که نتایج در جداول 3 تا 5 آمده است. سپس داده ها در نرم افزار  NTSYS-PCبرای مقایسه از رسم ماتریکس تشابه به روش Dic و دندروگرام با روش  UPGMA مورد استفاده قرار گرفت.

نتایج

به منظور تأیید صحت نانوذرات اکسید مس، میکروسکوپ الکترونی TEM و SEMاستفاده گردید که دراین عکسها نانو ذرات اکسید مس در نقاط سیاه دیده می شود و در منافذ سیلیکا ثبت شده اند. ذرات سیلیکا سبب پایداری نانو ذرات اکسید مس می شود. نانو ذرات اکسید مس در حالب آزاد ناپایدار هستند و بعد از مدتی قرار گرفتن در محیط خاصیت خود را از دست می دهند. نتایج در شکل های 1، 2 و 3 آمده است.

 

شکل1- عکس میکروسکوپی (TEM)Transmission electron microscopy از نانو ذراتcuo .

نقاط سیاه نشان دهنده نانو ذرات  Cuoمی باشد. که در مناقد سیلیکا تثبت شده اند. اندازه نانوذرات اکسید مس کمتر از 20 نانومتر می باشد.

 

شکل2-عکس میکروسکوپی(Scanning electron microscopy (SEMکه وجود منافذ در نانوذرات سیلیکا را نشان می دهد.

ارزیابی خاصیت ضد میکروبی نانوذرات اکسید مس: نتایج آزمایش فعالیت ضد میکروبی نانوذرات اکسید مس بر علیه باکتری استافیلوکوکوس اورئوس این را ثابت کرد که رشد باکتری بعد از تیمار با نانوذرات با غلظتهای متفاوت 30 و 60 میکروگرم بر میلی لیتر، در فاصله های زمانی 2 و 4 ساعت متوقف شد و پس از 24 ساعت رشد جزیی در آنها دیده شد. جدول شماره 2 گویای این واقعیت می­باشد.

 

 

 

 

شکل3- آنالیز XRD که تأیید کننده حضور نانو ذرات Cuo می باشد.2- Theta های 36، 39 مربوط به ذرات Cuo می باشد که در کریستالو گرافی کاملا" مشخص است.

 

 

جدول 2- میزان تغییرات جذب نوری(OD) نمونه ها در طول موج (600 nm)

غلظت

شماره لوله

 قبل از تیمار

بعد از 2ساعت

بعد از  4 ساعت

بعد از 24 ساعت

 
 

شاهد

1

0/86

0/86

0/88

1/39

 

30µg/ml

2

0/86

0/86

0/86

1/0

 

3

0/86

0/86

0/86

½

 

60µg/ml

4

0/86

0/86

0/86

½

 

5

0/82

0/82

0/82

1/0

 

 


آنالیز محصولات RAPD- PCR: باندهای مربوط به قطعات  تکثیر یافته توسط 15 پرایمر به وسیلهRAPD- PCR   براساس وجود یا عدم وجود آنها در نمونه­ها، به ترتیب به صورت یک و صفر امتیازدهی گردید که نتایج در شکلهای 4 ،5 و6 و جداول 3 تا 6 آمده است. اساس نتیجه گیری تفاوت در باندهایی است که هر پرایمر برای نمونه­های کنترل و تیمار شده تشکیل می­دهد. هر ستون به ترتیب از سمت چپ، ردیف اول محصول PCR حاصل از ژنوم نمونه شاهد، ردیف دوم محصول PCR حاصل از ژنوم تیمار 1 و ردیف سوم محصول PCR حاصل از ژنوم تیمار 2 می­باشد. تفسیر شکل به شرح ذیل می­باشد: برای پرایمر OPS-13، 3 باند روی ژل تشکیل گردید که 3 باند بین گروه شاهد و تیمارشده­ها متفاوت بود. از   5 قطعه تکثیر شده برای پرایمر OPA-11،  OPS-11 و OPR-12، 4 قطعه بین گروههای شاهد و تیمار شده متفاوت بودند. در پرایمر OPA-09 ، 8 باند تشکیل شد که تمامی باندها بین گروه شاهد و تیمار شده ها متفاوت بودند. همچنین در پرایمر OPT-17، هر4 قطعه تکثیر شده بین گروههای شاهد و تیمار شده­ها  متفاوت بودند. در پرایمر OPB-07 وOPS-09، یک قطعه تکثیر شد که هیچ گونه تفاوتی بین گروه شاهد و تیمارشده­ها مشاهده نگردید. برای پرایمر OPB-08، 5 باند روی ژل تشکیل شد که تمامی باندها بین گروه شاهد و تیمارشده­ها متفاوت بودند. برای پرایمر OPB-07، فقط یک باند روی ژل تشکیل گردید که هیچ گونه تفاوتی بین گروه شاهد و تیمارشده­ها مشاهده نگردید. از بین 4 قطعه تکثیر شده توسط پرایمر OPC-09،2 قطعه بین گروههای شاهد و تیمار شده متفاوت بودند. در پرایمر OPT-14 ، 6 باند تشکیل شد که 5 باند بین گروه شاهد و تیمار شده­ها متفاوت بودند. از بین 8 قطعه تکثیر شده توسط پرایمر OPA-10،7 قطعه بین گروه شاهد و تیمار شده­ها متفاوت بودند. برای پرایمر OPQ-17، 3 قطعه تکثیر شد که یک قطعه بین گروه شاهد و تیمار شده­ها متفاوت بود. در پرایمر OPS-03، از 5 قطعه تکثیر شده، 3 قطعه آنها بین گروه شاهد و تیمارشده­ها تفاوت داشتند. برای پرایمر OPR-11 فقط یک باند روی ژل تشکیل گردید که این باند بین گروه شاهد و تیمارشده­ها متفاوت بود.

ماتریکس تشابه: براساس وجود یا عدم وجود باند، ماتریکس تشابه برای نمونه های کنترل و تیمار شده  با روش Dic محاسبه شده که در جدول7  بدست آمده است. فاصله ژنتیکی بین نمونه ها از 0000000/1 تا 4800000/0 متغیر بوده که هر چه اعداد به 1 نزدیک تر، شباهت ژنتیکی بین نمونه­ها بیشتر شده است.

 

 

 

 

17     16      15      14      13      12      11      10       9       8       7        6       5       4       3        2       1

 

تصویر4- باندهای مربوط به تکثیر محصول PCRروی ژل آگارز. هر ستون برای یک پرایمر به ترتیب از سمت چپ، ردیف اول محصول PCR حاصل از ژنوم نمونه شاهد، ردیف دوم محصول PCR حاصل از ژنوم تیمار اول و ردیف سوم محصول PCR حاصل از ژنوم تیمار دوم می باشد. ستونهای شماره1-3:پرایمرOPS-13، ستونهای4-6:پرایمرOPR-12، ستون 7: مارکر، ستونهای شماره8-10:پرایمر OPA-09، ستون 11: مارکر، ستونهای شماره12-14:پرایمرOPT-17، ستونهای شماره15-17:پرایمرOPS-09

 

 

 

         20     19     18     17     16     15     14     13    12    11    10       9      8      7       6       5       4      3       2       1 

 

تصویر5- باندهای مربوط به تکثیر محصول PCR روی ژل آگارز. هر ستون برای یک پرایمر به ترتیب از سمت چپ، ردیف اول محصول PCR حاصل از ژنوم نمونه شاهد، ردیف دوم محصول PCR حاصل از ژنوم تیمار اول و ردیف سوم محصول PCR حاصل از ژنوم تیمار دوم می باشد.  ستونهای شماره1-3:پرایمرOPB-08، ستونهای4-6:پرایمرOPA-11، ستون7:مارکر،ستونهای شماره 8-10:پرایمرOPB-07، ستونهای شماره11-13: پرایمرOPC-09، ستون14:مارکر، ستونهای شماره15-17:پرایمرOPT-14، ستونهای شماره 18-20پرایمرOPS-11

 

 

         14     13     12    11     10      9      8      7       6      5      4     3       2      1

 

تصویر6- باندهای مربوط به تکثیر محصول PCRروی ژل آگارز. هر ستون برای یک پرایمر به ترتیب از سمت چپ، ردیف اول محصول PCR حاصل  از ژنومنمونه شاهد، ردیف دوم محصول PCR حاصل از ژنوم تیمار اول و ردیف سوم محصول PCR حاصل از ژنوم تیمار دوم می باشد.ستونهای شماره1-3:پرایمرOPA-10، ستونهای4-6:پرایمرOPQ-17، ستون7:مارکر،ستونهای شماره8-10:پرایمرOPS-03، ستونهای شماره11-13: پرایمرOPR-11، ستون14:مارکر

 

جدول 3– نتایج باندهی مربوط به پرایمرها

پرایمر

OPS- 11

OPR- 12

OPA- 09

اندازه قطعه (bp)

3000

2000

1500

3000

1600

700

600

300

3000

1700

1500

1400

950

850

700

250

شاهد

1

1

1

1

1

1

0

0

1

1

1

1

1

1

1

1

تیمار 1

1

0

0

0

1

0

1

0

1

0

1

0

0

0

0

0

تیمار 2

0

0

0

0

1

0

1

1

0

0

0

0

0

0

1

1

 

جدول 4– نتایج باندهی مربوط به پرایمرها

پرایمر

OPT- 17

OPS- 09

OPB- 08

OPA- 11

OPS- 07

اندازه قطعه (bp)

3000

2800

1700

600

1700

2500

1800

1400

1000

350

2000

1500

1000

800

450

1800

شاهد

0

1

1

1

1

1

1

1

1

1

0

1

1

1

1

1

تیمار 1

0

1

0

0

1

1

1

0

1

1

1

1

1

1

0

1

تیمار 2

1

0

0

0

1

0

0

0

0

0

0

0

1

0

1

1

 

جدول 5– نتایج باندهی مربوط به پرایمرها

پرایمر

OPC- 09

OPT-14

OPS -11

OPR- 11

اندازه قطعه (bp)

3000

1300

900

700

1900

1800

1400

900

800

700

1700

1400

1300

600

400

1400

شاهد

1

1

1

1

0

1

0

0

1

0

0

1

0

1

1

0

تیمار 1

1

1

1

0

1

1

1

1

1

0

1

1

1

0

0

0

تیمار 2

1

1

0

0

0

1

0

0

0

1

1

1

1

0

0

1

 

جدول 6– نتایج باندهی مربوط به پرایمرها

پرایمر

OPA- 10

OPQ-17

OPS- 03

اندازه قطعه (bp)

3000

2800

1400

1000

900

800

700

500

1800

1000

700

2800

1800

500

400

250

شاهد

30

0

0

1

0

1

1

1

1

1

1

1

1

0

0

0

تیمار 1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

0

0

تیمار 2

1

1

0

1

0

0

0

0

1

0

1

1

1

1

1

1


 

 

 

جدول 7- ماتریکس تشابه

Dice (Czekanowski or Sorenson) Measure

Case

تیمار2 

تیمار1

کنترل 

 

 

0000000/1

کنترل

 

0000000/1

6590909/0

تیمار1

0000000/1

56833803/0

4800000/0

تیمار2

 

 

در شکل شماره 7، دندروگرام که با روش UPGMA  در نرم افزار NTSYS-PC  به منظور مقایسه تنوع ژنتیکی ایجاد شده بین نمونه کنترل و تیمار شده با نانوذرات اکسید مس رسم گردید. مشاهده شد که نمونه کنترل و نمونه تیمار1 در یک شاخه و تیمار 2 در شاخه جداگانه قرار گرفته اند که این بیانگر ایجاد تفاوت ژنتیکی بین آنها می‍باشد.

بحث

در این تحقیق مشاهده شد که رشد باکتری بعد از 2 و4 ساعت تیمار با غلظت 30 و60 میکروگرم بر میلی لیتر نانوذرات اکسید مس به طور کامل متوقف گردید پس با توجه به این تحقیقات می توان نتیجه گرفت که نانوذرات مس با این غلظت بیشترین فعالیت ضدمیکروبی را در کمترین زمان از خود نشان می­دهند. همچنین در مقاله تحقیقی دکترنایاک و همکاران در سال (2013) میلادی نیز از غلظتهای 25 و45 میکروگرم بر میلی لیتر نانوذرات اکسید مس استفاده شده است(16).


 

شکل7- دندروگرام حاصل از تجزیه بر اساس آزمون رپید  با روش  UPGMAتوسط نرم افزار NTSYS –PC


سلوارانی وهمکارانش در سال (2013) میلادی از نانو ذرات اکسید مس با اندازه های 17.85 و44 استفاده نمودند و در این بررسی بیشترین اثر مهار کنندگی برای باکتری پسودوموناس آئروژینوزا نشان داده شد(15). در این مطالعه غلظت مشخصی از نانوذرات اکسید مس جهت تیمار باکتریها و بررسی خاصیت ضد میکروبی به کار برده شد و با توجه به اینکه براساس مطالعات زیادی اثر نانوذرات اکسید مس به عنوان ماده ضد میکروبی به اثبات رسیده است (18و23). بنابراین هدف اصلی این تحقیق بررسی اثر نانوذرات اکسید مس روی ژنوم باکتری می باشد که تفاوت ژنتیکی بین تیمار 1 با نمونه کنترل در یک شاخه و نمونه تیمار 2 در شاخه جداگانه در دندروگرام حاصل از تجزیه بر اساس آزمون RAPD-PCR مشاهده می گردد، به عبارتی یعنی غلظت 60 میکرو گرم بر میلی لیتربیشترین اثر مهار کنندگی را از طریق تاثیر روی ژنوم دارا می باشد. همان طور که در جدول 6 دیده شد فاصله ژنتیکی بین نمونه ها از 0000000/1 تا 4800000/0 متغییر بوده که هر چه اعداد به 1 نزدیک تر، شباهت ژنتیکی بین نمونه­ها بیشتر شده است. همچنین این بررسی به منظورتعیین اثرژنوتوکسیک نانوذرات اکسید مس برروی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس به عنوان مدل برای باکتریهای گرم مثبت صورت گرفت. در این راستا از مجموع 15 پرایمر به کار رفته در واکنش RAPD-PCR  وجود یا فقدان باند در تصویر ژل حاکی از ایجاد تغییر توالی DNAتوسط نانوذرات اکسید مس می­باشد.  به طوری که تعداد زیادی ازپرایمرها توالیهای هدف را شناسایی نکرده و لذا قطعه مربوطه تکثیر پیدا نکرده و فقدان باند روی ژل آگاررز گردید. تفاوت بین باندهای مشاهده شده در گروههای تیمار شده و کنترل باکتریها حاکی از آن است که توالیهای هدف پرایمرها دستخوش تغییراتی در باکتریهای تیمار شده، گردیده­اند که باعث تفاوت در اتصال پرایمرها و تکثیر قطعات در PCR به واسطه آنها شده است. دلیل این موضوع می­تواند احتمالاً ناشی از ایجاد جهش مستقیم یا غیرمستقیم رویDNA، توسط نانوذرات اکسید مس بوده و یا همان­طوری که پال و همکارانش در سال (2007) گزارش کرده­اند به خاطر ایجاد اختلال در مکانیسم همانندسازی توسط DNA polymerase  می­شود. به طوری که احتمالاً صحت همانند سازی را مختل می­نماید تا بدین گونه در خلال همانندسازی تغییراتی در توالیهای DNA ایجاد شود که منجر به بروز تفاوت در توالیهای هدف مورد اتصال پرایمرهای RAPD شود(19). بوندارنکوو همکارانش در سال (2012) میلادی، در تحقیق خود بیان نمودند نانوذرات اکسید مس، با آمین و گروههای کربوکسیل روی سطح سلولهای میکروبی  واکنش داده و همچنین در طی واکنش اکسیداسیون مس (I)Cu به (II)Cu،Ros تولید می کنند که باعث آزاد شدن رادیکالهای هیدروکسیل می­شود که به پروتئینهای ضروری و DNA آسیب رسانده و باعث فعالیت ضد باکتریایی می­شود(6 و21). دکتر جوانگ نینگ و همکارانش در سال (2011) میلادی، اثر نانو ذرات اکسید مس در غلظتهای بین 10 و 100 میکروگرم بر میلی لیتر نسبت به طیف گسترده ای از باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی از جمله باسیلوس سوبتیلیس، پسودوموناس آئروژینوزا، اشریشیا کلی و استافیلوکوک اورئوس گزارش کردند(9). تغییرات مشاهده شده در توالی  DNA دراین تحقیق همچنین می­توانند عاملی برای بازدارندگی رشد و چرخه سلولی ازطریق بروز جهشها و به دنبال آن تغییر بیان ژنهای مرتبط با رشد و کنترل چرخه سلولی باشند (25). در سال 2004، سوندی و همکارانش نشان داده­اند که نانوذرات در روی آنزیمهای دخیل در همانند سازی اثر می­گذارند(22).در تحقیقات صورت گرفته توسط دکتر کینگ درسال 2006 میلادی، مشخص شده است که اتصال قوی نانوذرات به غشای  بیرون  باکتریها،  می‌تواند مانع از عملکرد آنزیم دهیدروژناز گردد. جلوگیری از فعالیت آنزیمهای پری پلاسمیک  باکتری و در نتیجه جلوگیری از  فعالیت و عملکرد DNA ، RNA  و سنتز پروتئین نیز دیده شده است. در مجموع این مهار فعالیتها منجر به  لیز سلولی خواهد شد (13). در بررسیهای صورت گرفته توسط آقای مارتل که مصادف با 2005 میلادی بود، نشان داده شد که نانو مواد، چسبیدن سلولهای باکتری و تشکیل  بیوفیلم را به تأخیر می‌اندازد که این عمل باعث می‌شود گروهی از باکتریها نتوانند تثبیت شوند و تکثیر یابند (14). بر همین اساس و باتوجه به اینکه در این تحقیق باکتریهای در حال رشد و همانندسازی با نانوذرات اکسید مس تیمار داده شد، می توان چنین استدلال کرد که احتمالاً در حین همانندسازی و همچنین در مکانیسمهای ترمیمی که توسط آنزیمهای مرتبط انجام می­گیرد اختلال ایجاد می­کند تا موجب جهشهای متعدد در توالی بازی   DNA شود. لذا می­توان نتیجه گرفت که با ایجاد جهش در ژنهای درگیر در کنترل چرخه سلولی موجب توقف چرخه سلولی می گردد که نتیجه مشاهده شده در این تحقیق نیز کاهش رشد باکتریها را نشان داده و مطلب فوق را تأیید می نماید.

تقدیر و تشکر

بدین­وسیله از گروه بیوتکنولوژی دانشگاه دولتی مراغه به دلیل همکاری صمیمانه در تأمین نانوذرات و پرایمرهای مورد استفاده سپاسگذاری می­گردد.

1-براون، ت،(1390)،  مراد پور، ز ، قاسمیان، ع، مقدمه­ای بر کلون سازی ژن و بررسی DNA، انتشارات خسروی با همکاری نشر دیباج.

 

2- Amelia, M., Lincheneau, C., Silvi, S.,Credi, A. (2012), Electrochemical properties of  CdSe and CdTe quantum dots. Chem. Soc. Rev. 2012; 41: 5728–5743Witte, W. (2004), International dissemination of antibiotic resistant strains of bacterial pathogens. Infect. Genet. Evol. 4, 187–191

3- Baker-Austin, C., Wright, MS., Stepanauskas, R., McArthur, JV. (2006) , Co-selection of antibiotic and metalResistance. Trends Microbiol.  ;14:176–18

4- Beranva , J.,Seydlova, G. , Kozak, H., Benada, O., Fiser,  R., Artemenko, A., Konopasek, I., Kromka, A. (2014), Sensitivity of  bacteria  to diamond   nanoparticles of  various  size  differs   in gram-positive  and  gram- negative  cells, FEMS Microbiol. Lett. dio:http://dx.doi. org /10.1111/1574-1111/ 6968.

5- Bogdanovića, U., Lazić ,b V., Vodnik,V. (2014), Copper nanoparticles with high antimicrobial activity .Materials Letter

6- Bondarenko, O., Ivask, A., Käkinen, A., Kahru, A. (2012), Sub-toxic effects of CuO nanoparticles on bacteria: Kinetics, role of Cu ions and possible mechanisms of action. Environ. Pollut., 169, 81–89.

7- Brunner, T.J., Wick, P., Manser, P., Spohn, P., Grass, R. N., Limbach, L. K.,                 Bruinink, A.,Stark, W.J. (2006), In vitro cytotoxicity of oxide nanoparticles: Comparison to asbestos, silica, and the effect of particle solubility. Environ. Sci. Technol. 40, 4374–4381Huh, A.J. and Kwon, Y.J. (2011), Nanoantibiotics: a new paradigm for treating infectious diseases using nanomaterials in the antibiotics resistant era. J. Control. Release 156, 128–145

8- Fahmy, B., Cormier,  S.A. (2009), Copper oxide   nanoparticle  induce  oxidative stress  andcytotoxiy  in  airway  epithelial  cells, Toxicol. In Vitro 7 1365-1371

9- Guang-Ning Ye, MinouHemmat, Muhammad A. Lodhi, Norman F. Weeden  and  Bruce I. Reisch (1996) .Department of Horticultural Sciences, New York  State;  Agricultural Experiment Station, Cornell University, Geneva, New York 14456, USA.

10- Heinlaan, H., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H.C., Kahru, A. (2008), Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephaluspaltyurus. Chemosphere 71, 1308e1316.

11- Jones, N., Ray, B., Ranjit , KT., Manna, AC . (2008), Antibacteril activity of  ZnO.FEMS MicrobiolLett. 297:71-76.

12- Huh, A.J. and Kwon, Y.J. (2011), Nanoantibiotics: a new paradigm for treating infectious diseases using nanomaterials in the antibiotics resistant era. J. Control. Release 156, 128–145.

13- King M D, Humphrey B J, Wang Y F, Kourbatova E V, Blumberg H M.Emergence of community-acquired methi-cillin-resistant staphylococcus aurous USA 300 clone as The predominant cause of skin and soft-tissue infections. Ann In-tern Med. 2006;144:309-317.

14- Martel S. Method and system for controlling micro-objects or micro-particles. United  States  patent US  20100215785. 2005; Appl. 11/145,007.

15- M. SELVARANI, P. PREMA (2013). EVALUATION OF ANTIBACTERIAL EFFICACY OF CHEMICALLY SYNTHESIZED COPPER AND ZEROVALENT IRON NANOPARTICLES. ASIAN TOURNAL OF PHARMACEUTICAL AND CLINICAL RESERCH.

16- P.L.Nayak, 2013. Antimicrobial Activity of Copper Nanoparticles Synthesised by Ginger (Zingiberofficinale) Extract. World Journal of Nano Science & Technology 2(1): 10-13, 2013.

17- Mansour, H.M. , Rhee, Y.S., Wu, X .  (2009), Nanomedicine in  pulmonary  delivery. Int. J. Nanomedicine   ; 4 :299–319.

18- Murugan ,V. , Sadhasivam,  S. (2012), Glucosamine functionalized copper nanoparticles: preparation, characterization and enhancement of anti-bacterial activity by  ltraviolet irradiation. chemical engineering.

19- Pal, S., Tak, Y.K. , Song, J.M.  (2007), Does the antibacterial activity of nanoparticles depend on the shape of the nanoparticles A study of the gramnegative bacterium Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 73: 1712-1720.

20- Rispoli, F.,  Angelov, A.,  Badia, D., Kumar , A., Seal, S., Shahb, V. J. (2010),  Hazard Mater.180:212–6.

21- Robert ,Y., Pelgrift Adam, J., Friedman,M  . (2013)," Nanotechnology as a therapeutic tool to combat microbial resistance". Advanced Drug Delivery  Reviews.

22- Ruparelia , JP., Chatterjee,  AK., Duttagupta, SP. (2008), Mukherji  S.Strain specificity in antimicrobial  activity of silver and copper nanoparticles. Acta Biomater. 2008;4:707-716.

23- Shankar, Sh., Jong-Whan, R. (2014), Effect of copper salts and reducing agents on characteristics and antimicrobial activity of copper nanoparticles. Materials Letters.

24- Sondi .I and Sondi. SB, (2004), Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E. coli as a model for gram-negative bacteria. Colloid Interf. Sci. 275: 77-182.

25- Turner, Philips, Molecular biology, 2nd, 2000. ISBN: 8397-36-8

26- Turner, Philips, Molecular biology, 2nd, 2000. ISBN: 8397-36

27- Victor K Champagne1 and Dennis J Helfritch2*.  A demonstration of the antimicrobial effectiveness of various copper surfaces. Champagne and Helfritch Journal of Biological Engineering 2013, 7:8

28- Whitesides, G.M. (2005), Nanoscience, nanotechnology, and chemistry  Small. 1, 172–179

29- Witte, W. (2004), International dissemination of antibiotic resistant strains of bacterial pathogens. Infect. Genet. Evol. 4, 187–191