نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد دانشگاه آزاداسلامی واحد ارومیه، گروه زیست شناسی
2 عضو هیئت علمی- دانشگاه آزاد ارومیه
3 استادیار دانشگاه دولتی مراغه
چکیده
با توجه به مقاومت باکتری ها نسبت به آنتی بیوتیک ها و عوامل ضد میکروبی مرسوم، تحقیقات بسیاری برای یافتن انواع جدید عوامل ضد میکروبی موثر انجام شد. با توسعه فناوری نانو، مس به طور فزاینده ای به شکل نانوذرات با فعالیتهای ضد میکروبی بالا و قیمت ارزان علیه همه باکتری های گرم منفی و گرم مثبت مورد استفاده قرار گرفته است.
در این تحقیق از نانو ذرات اکسیدمس با اندازه (کمتر از 20 نانومتر) برای بررسی اثر آن روی ژنوم باکتری استافیلوکوکس اورئوس به عنوان مدل برای باکتریهای گرم مثبت استفاده شد. بدین منظور ابتدا باکتریها را با غلظتهای 30 و 60 میکروگرم بر میلی لیتر با این نانوذرات تیمار کرده و در فاصله های زمانی 2، 4 و 24 ساعت خاصیت ضد میکروبی نانوذرات بررسی گردیده و استخراج DNA صورت گرفت. تکنیک واکنش زنجیره ای پلیمراز رپید ( RAPD-PCR) جهت بررسی تغییرات DNA ژنومی باکتری های تیمار شده به کار گرفته شد. با استفاده از نرم افزار NTSYS-PC، نتایج حاصل ازالکتروفورزیس محصولات PCR روی ژل آگارز مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
در این تحقیق مشاهده گردید نانو ذرات اکسیدمس علاوه بر اثر مهار کنندگی روی رشد باکتری های استافیلوکوکوس اورئوس روی توالی DNA ژنومی آن ها اثر گذاشته و باعث تغییرآن در نقاط مختلف گردیده است.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
An investigation of the effect of copper nanoparticles on Staphylococcus aureus genome by RAPD molecular markers
نویسندگان [English]
1 Islamic Azad University, Urmia Branch
3 Biotechnology Dept., University of Maragheh, Maragheh, I.R. of Iran
چکیده [English]
Regarding the bacterial resistence of common antibiotecs and anti-microbial agents , a great number of studies have been conducted to discover the recent types of anti-microbial agents. With the recent developments in nanotechnology, copper has been extensively used as nanoparticles against all positive-gram and to negative-gram particles due to its low price and high anti-microbial activity. In the present study, copper oxide nano particles of (
کلیدواژهها [English]
بررسی اثر نانوذرات اکسید مس روی ژنوم باکتری استافیلوکوکوس اورئوس با استفاده از نشانگرهای مولکولی RAPD
نسرین زارع1، بهرام گلستانی ایمانی1* و فرخ کریمی2
1 ارومیه، دانشگاه آزاداسلامی واحد ارومیه، گروه زیست شناسی
2 مراغه، دانشگاه مراغه، گروه بیوتکنولوژی
تاریخ دریافت: 14/6/94 تاریخ پذیرش: 12/12/94
چکیده
با توجه به مقاومت باکتریها نسبت به آنتیبیوتیکها و عوامل ضد میکروبی مرسوم، تحقیقات بسیاری برای یافتن انواع جدید عوامل ضد میکروبی مؤثر انجام شده است. با توسعه فناوری نانو، مس به طور فزآیندهای به شکل نانوذرات با فعالیتهای ضد میکروبی بالا و قیمت ارزان علیه همه باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت مورد استفاده قرار گرفته است. در این تحقیق از نانو ذرات اکسید مس با اندازه (کمتر از 20 نانومتر) برای بررسی اثر آن روی ژنوم باکتری استافیلوکوکس اورئوس به عنوان مدل برای باکتریهای گرم مثبت استفاده شد. بدین منظور ابتدا باکتریها را با غلظتهای 30 و 60 میکروگرم بر میلیلیتر با این نانو ذرات تیمار کرده و در فاصلههای زمانی 2، 4 و 24 ساعت خاصیت ضد میکروبی نانوذرات بررسی گردیده و استخراج DNA صورت گرفت. تکنیک واکنش زنجیره ای پلیمراز رپید (RAPD-PCR) جهت بررسی تغییرات DNA ژنومی باکتریهای تیمار شده به کار گرفته شد. با استفاده از نرم افزار NTSYS-PC، نتایج حاصل ازالکتروفورزیس محصولات PCR روی ژل آگارز مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. در این تحقیق مشاهده گردید نانو ذرات اکسیدمس علاوه بر اثر مهار کنندگی روی رشد باکتریهای استافیلوکوک اورئوس روی توالی DNA ژنومی آنها اثر گذاشته و باعث تغییرآن در نقاط مختلف گردیده است.
واژه های کلیدی: نانوذرات اکسیدمس، باکتری استافیلوکوکوس اورئوس، واکنش زنجیرهای پلیمراز رپید ( RAPD-PCR)
* نویسنده مسئول، تلفن: 32719900، پست الکترونیکی: golestani_bahram@yahoo.com
مقدمه
باکتریها در برابر آنتی بیوتیکها و بسیاری از عوامل ضد باکتریایی مقاومت پیدا کردهاند که این مقاومت قابل توارث بوده و باعث ادامه بیماریهای عفونی میشود که یکی از بزرگترین چالشهای سلامتی سراسر جهان است. این پیشرفت متناوب استراتژیهای درمانی باکتریها را بر میانگیزد (3 و 28). در چند دهه اخیر نانو مواد به دلیل ویژگیهای جدید شامل بزرگ بودن نسبت سطح به حجم و فعالیت مهاری بالا علیه باکتریها توجه زیادی پیدا کرده است (2 و 29). علاوه بر این، گزارش شده که نانوذرات با اندازه کوچک فعالیت ضد میکروبی خوبی از خود نشان دادهاند (5). در میان نانوذرات دیگر، اخیراً به نانو ذرات اکسید مس توجهات بیشتری شده است. نانوذرات ارزان به جای نانوذرات فلزی گران قیمت در سطح کاربردهای میکروالکتریکی پیشنهاد میشوند و احتمالاً آنها آخرین مواد ضد میکروبی کشف شدهاند (11 و 27). بنا به گفته محققان نانو ذرات اکسید مس می توانند با DNA سیتوپلاسمیک باکتری و پروتئینهای باکتریایی به خصوص آنزیمهایی که در مراحل حیاتی سلول همانند زنجیره انتقال الکترون شرکت دارند وهمچنین باپپتید وگلیکانهای دیواره سلولی و غشای پلاسمایی واکنش داده و باعث تخریب کامل غشای باکتری شوند(8). علاوه براین نانوذرات اکسید مس مستقیماً با ارگانهای اکسیداتیو مانند میتوکندری و پروتئینهای فعال واکنش میدهند و تولید ROS را در سلولها تحریک میکنند. یونهای مس که به وسیله نانوذرات تولید میشوند میتوانند به وسیله واکنشهای شیمیایی مختلف، تولید ROS را در سلولها القاء کنند. ROS نیز به نوبه خود میتواند شکستن DNA تک رشتهای را القاء کرده و در بیان ژن اثر بگذارد(4 و 12). همچنین بنابه گفته محققان نانوذرات اکسید مس ممکن است کاتیونهای مس آزاد کند که باعث افزایش غلظت یونهای فلزی در آن محل شود و کاتیونهای فلزی هموستازیس سلول باکتری را مختل کند(7). نانوذرات اکسید مس ممکن است باعث ایجاد جهش در باکتری گردیده و با تغییر در خاصیت جفت شدن بازی، بازها در فعالیت ضد باکتریایی شرکت کند(10). به دلیل اثرات ضد میکروبی نانوذرات مس، این مواد در بسیاری از محصولات تجاری، بهداشتی، پزشکی و همچنین در صنایع مهندسی مانند کاتالیزگرها، وسایل نوری و کاربردهای الکترونیک به کار میروند. علاوه بر فعالیت ضد میکروبی این نانوذرات، اثر ضدویروس و ضد قارچ این نانوذرات نیز گزارش شده است(19). نانوذرات می تواند در شرایط نامساعد مانند دمای بالای استریلیزاسیون، که تحت آن آنتی بیوتیکهای مرسوم غیرفعال میشوند مقاومت کنند. نانوموادی که در تحویل آنتی بیوتیکها استفاده میشود دارای مزیت چندگانه 1- توزیع شکل یکنواخت در بافت هدف 2- بهبود قابلیت حل شدن 3- رهاسازی کنترل شده و تحمیل شده هستند(17). بر روی فعالیت ضد میکروبی نانوذرات روی باکتریهای بیماریزای انسان مانند اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس مطالعه زیادی شده است (24).
یک مطالعه اثبات مفهوم اثر ضد عفونی کنندگی از اکسید مس در سه سطح انجام شده است. سطوح توسط رسوب اکسید مس با استفاده از سه روش اسپری حرارتی، پلاسما اسپری واسپری سرد تولید شد. سپس سطوح با باکتری استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به methicillin(MRSA) آلوده شدند و بعد از دو ساعت قرارگرفتن این سطوح در برابر MRSA ، بازده کشندگی MRSA در روش رسوب گذاری با اسپری سرد به صورت مؤثری کاهش یافت که ناشی از سرعت بالای ذرات اسپری شده است. اثر سرعت بالاروی ذرات به روش اسپری سرد باعث افزایش ساختار ریز اکسید مس و انتشار یونی می شود و این یونهای اکسید مس مسئول فعالیت آنتی میکروبی هستند(26). نانو ذرات به هنگام استفاده به عنوان ماده ضد باکتریایی بر روی سلولهای یوکاریوتی و سایر ارگانیسمها نیز اثر گذارند. لذا باید برای به دست آوردن غلظتهای مؤثر ضد باکتریایی و تاثیر ژنوتوکسیکی آن به عنوان جایگزینی مناسب برای آنتی بیوتیکها و مواد ضد عفونی کننده بدون ضرر، بیشتر بررسی گردد (20). از آنجایی که تاکنون اثر ضد باکتریایی از طریق اثر نانوذرات مس روی ژنوم بررسی نشده است. این تحقیق به منظور بررسی اثر دزهای مختلف در زمانهای متفاوت تیماری نانو ذرات اکسیدمس روی ژنوم استافیلوکوک اورئوس به عنوان باکتری مدل صورت گرفت که بدین منظور از تکنیک (RAPD-PCR) در این مطالعه استفاده شده است.
مواد و روشها
کشت باکتری و شرایط کشت، پس از انجام کشت افتراقی روی محیط ائوزین متیلن بلو و انجام تست کاتالاز برای اطمینان از نوع باکتری، باکتری در 5 میلی لیترمحیط BHBbroth به مدت یک شبانه روز در انکوباتور شیکردار در دمای 37 درجه سانتی گراد با دور rpm 200 کشت داده شد و میزان رشد باکتریها از طریق اندازه گیری چگالی نوری (OD) محیط کشت در طول موج 600 نانومتر کنترل گردید.(1)
تهیه نانو ذرات اکسید مس: نانوذرات اکسید مس با قطر کمتر از 20 نانومتر که توسط گروه بیوتکنولوژی دانشگاه دولتی مراغه سنتز و در اختیار این تحقیق قرار گرفت. مشخصات آن توسط میکروسکوپ الکترونی آنالیز گردید. برای تهیه محلول استوک از بافر فسفات سالین با PH: 7.4 به عنوان حلال نانوذرات اکسید مس استفاده شد.
بررسی خاصیت ضد میکروبی نانوذرات اکسید مس: جهت بررسی اثر نانوذرات، باکتریها با غلظتهای 30 و 60 میکروگرم بر میلی لیتر نانوذره اکسید مس در انکوباتورشیکر دار در دمای 37 درجه سانتی گراد با دور rpm200 تیمار شدند. چگالی نوری هر کدام از لولههای آزمایش در طول موج 600 نانومتر و در فاصله های زمانی 4،2 و 24 ساعت جهت سنجش رشد جمعیت باکتریها اندازه گیری شد.
استخراج DNA: DNAی ژنومی باکتری شاهد و تیمار شده با استفاده از کیت استخراج دی ان آ (شرکت ژن مارک) مطابق با دستورالعمل کیت مذکور استخراج گردیده و کمیت و کیفیت آن با استفاده از روش اسپکتروفتومتری و الکتروفورزیس روی ژل آگاروز 1 درصد آنالیز گردید.
انجام واکنش زنجیره پلیمراز RAPD-PCR: DNA ژنومی، با استفاده از 15 پرایمر 10 جفت بازی RAPD- PCR که به طور تصادفی انتخاب شده و از دانشگاه دولتی مراغه تهیه شده بودند، تکثیر شد. توالی پرایمر های مورد استفاده در جدول (1 )، ذکر شده است. بدین ترتیب که مقدار1 میکرولیتر پرایمر، 5/2 میکرولیتر (x10) PCRbuffer، 3 میکرولیتر MgCl2 ، 1 میکرولیتر dNTP ، 1 میکرولیتر از نمونه DNA استخراج شده و 3/0 میکرولیتر polymerase TaqDNA که با 2/16 میکرولیتر آب مقطر دیونیزه به حجم 25 میکرو لیتر رسانده شد. واکنش PCR دردستگاه ترموسایکلر (Corbettresearch, Australia) با برنامه زیر انجام گرفت: واسرشت شدن اولیه DNA الگودر دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه و 40 سیکل به ترتیب، دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 35 ثانیه جهت واسرشت شدن رشتههای DNA الگو، دمای 30 درجه سانتی گراد به مدت 45 ثانیه جهت اتصال پرایمرها به رشتههای الگو، دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت 45 ثانیه جهت سنتز رشته جدید از روی رشته الگو و7 دقیقه جهت تکمیل سنتز رشتههای ناقص به کار گرفته شد.
جدول1- توالی نوکلئوتیدی پرایمرهای مورداستفاده
توالی نوکلئوتیدی پرایمر |
نام پرایمر |
GTCGTTCCTG |
OPS13 |
ACAGGTGCGT |
OPR12 |
GGGTAACGCC |
OPA09 |
TCTGGTGAGG |
OPT17 |
TCCTGGTCCC |
OPS09 |
GTGATCGCAG |
OPB08 |
CAATCGCCGT |
OPA11 |
GGTGACGCAG |
OPB07 |
CTCACCGTCC |
OPC09 |
AATGCCGCAG |
OPT14 |
AGTCGGGTGG |
OPS11 |
GTGATCGCAG |
OPA10 |
GGACGCTTCA |
OPQ14 |
GTAGCCGTCT |
OPR11 |
TCTGGTGAGG |
OPS03 |
بررسی نتایج RAPD – PCR: بعد از اتمام واکنش PCR، جهت آشکارسازی باندها، 10 میکرولیتراز محصول PCR روی ژل آگارز 2 درصد با ولتاژ 120 ولت الکتروفورزیس گردید.
آنالیز داده های حاصل از الکتروفورزیس محصولات PCR: باند های مشاهده شده روی ژل آگارز براساس وجود یا عدم وجود آنها برای هر پرایمر، به ترتیب به صورت یک و صفر امتیازدهی گردید که نتایج در جداول 3 تا 5 آمده است. سپس داده ها در نرم افزار NTSYS-PCبرای مقایسه از رسم ماتریکس تشابه به روش Dic و دندروگرام با روش UPGMA مورد استفاده قرار گرفت.
نتایج
به منظور تأیید صحت نانوذرات اکسید مس، میکروسکوپ الکترونی TEM و SEMاستفاده گردید که دراین عکسها نانو ذرات اکسید مس در نقاط سیاه دیده می شود و در منافذ سیلیکا ثبت شده اند. ذرات سیلیکا سبب پایداری نانو ذرات اکسید مس می شود. نانو ذرات اکسید مس در حالب آزاد ناپایدار هستند و بعد از مدتی قرار گرفتن در محیط خاصیت خود را از دست می دهند. نتایج در شکل های 1، 2 و 3 آمده است.
شکل1- عکس میکروسکوپی (TEM)Transmission electron microscopy از نانو ذراتcuo .
نقاط سیاه نشان دهنده نانو ذرات Cuoمی باشد. که در مناقد سیلیکا تثبت شده اند. اندازه نانوذرات اکسید مس کمتر از 20 نانومتر می باشد.
شکل2-عکس میکروسکوپی(Scanning electron microscopy (SEMکه وجود منافذ در نانوذرات سیلیکا را نشان می دهد.
ارزیابی خاصیت ضد میکروبی نانوذرات اکسید مس: نتایج آزمایش فعالیت ضد میکروبی نانوذرات اکسید مس بر علیه باکتری استافیلوکوکوس اورئوس این را ثابت کرد که رشد باکتری بعد از تیمار با نانوذرات با غلظتهای متفاوت 30 و 60 میکروگرم بر میلی لیتر، در فاصله های زمانی 2 و 4 ساعت متوقف شد و پس از 24 ساعت رشد جزیی در آنها دیده شد. جدول شماره 2 گویای این واقعیت میباشد.
شکل3- آنالیز XRD که تأیید کننده حضور نانو ذرات Cuo می باشد.2- Theta های 36، 39 مربوط به ذرات Cuo می باشد که در کریستالو گرافی کاملا" مشخص است.
جدول 2- میزان تغییرات جذب نوری(OD) نمونه ها در طول موج (600 nm)
غلظت |
شماره لوله |
قبل از تیمار |
بعد از 2ساعت |
بعد از 4 ساعت |
بعد از 24 ساعت |
|
شاهد |
1 |
0/86 |
0/86 |
0/88 |
1/39 |
|
30µg/ml |
2 |
0/86 |
0/86 |
0/86 |
1/0 |
|
3 |
0/86 |
0/86 |
0/86 |
½ |
||
60µg/ml |
4 |
0/86 |
0/86 |
0/86 |
½ |
|
5 |
0/82 |
0/82 |
0/82 |
1/0 |
آنالیز محصولات RAPD- PCR: باندهای مربوط به قطعات تکثیر یافته توسط 15 پرایمر به وسیلهRAPD- PCR براساس وجود یا عدم وجود آنها در نمونهها، به ترتیب به صورت یک و صفر امتیازدهی گردید که نتایج در شکلهای 4 ،5 و6 و جداول 3 تا 6 آمده است. اساس نتیجه گیری تفاوت در باندهایی است که هر پرایمر برای نمونههای کنترل و تیمار شده تشکیل میدهد. هر ستون به ترتیب از سمت چپ، ردیف اول محصول PCR حاصل از ژنوم نمونه شاهد، ردیف دوم محصول PCR حاصل از ژنوم تیمار 1 و ردیف سوم محصول PCR حاصل از ژنوم تیمار 2 میباشد. تفسیر شکل به شرح ذیل میباشد: برای پرایمر OPS-13، 3 باند روی ژل تشکیل گردید که 3 باند بین گروه شاهد و تیمارشدهها متفاوت بود. از 5 قطعه تکثیر شده برای پرایمر OPA-11، OPS-11 و OPR-12، 4 قطعه بین گروههای شاهد و تیمار شده متفاوت بودند. در پرایمر OPA-09 ، 8 باند تشکیل شد که تمامی باندها بین گروه شاهد و تیمار شده ها متفاوت بودند. همچنین در پرایمر OPT-17، هر4 قطعه تکثیر شده بین گروههای شاهد و تیمار شدهها متفاوت بودند. در پرایمر OPB-07 وOPS-09، یک قطعه تکثیر شد که هیچ گونه تفاوتی بین گروه شاهد و تیمارشدهها مشاهده نگردید. برای پرایمر OPB-08، 5 باند روی ژل تشکیل شد که تمامی باندها بین گروه شاهد و تیمارشدهها متفاوت بودند. برای پرایمر OPB-07، فقط یک باند روی ژل تشکیل گردید که هیچ گونه تفاوتی بین گروه شاهد و تیمارشدهها مشاهده نگردید. از بین 4 قطعه تکثیر شده توسط پرایمر OPC-09،2 قطعه بین گروههای شاهد و تیمار شده متفاوت بودند. در پرایمر OPT-14 ، 6 باند تشکیل شد که 5 باند بین گروه شاهد و تیمار شدهها متفاوت بودند. از بین 8 قطعه تکثیر شده توسط پرایمر OPA-10،7 قطعه بین گروه شاهد و تیمار شدهها متفاوت بودند. برای پرایمر OPQ-17، 3 قطعه تکثیر شد که یک قطعه بین گروه شاهد و تیمار شدهها متفاوت بود. در پرایمر OPS-03، از 5 قطعه تکثیر شده، 3 قطعه آنها بین گروه شاهد و تیمارشدهها تفاوت داشتند. برای پرایمر OPR-11 فقط یک باند روی ژل تشکیل گردید که این باند بین گروه شاهد و تیمارشدهها متفاوت بود.
ماتریکس تشابه: براساس وجود یا عدم وجود باند، ماتریکس تشابه برای نمونه های کنترل و تیمار شده با روش Dic محاسبه شده که در جدول7 بدست آمده است. فاصله ژنتیکی بین نمونه ها از 0000000/1 تا 4800000/0 متغیر بوده که هر چه اعداد به 1 نزدیک تر، شباهت ژنتیکی بین نمونهها بیشتر شده است.
17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
تصویر4- باندهای مربوط به تکثیر محصول PCRروی ژل آگارز. هر ستون برای یک پرایمر به ترتیب از سمت چپ، ردیف اول محصول PCR حاصل از ژنوم نمونه شاهد، ردیف دوم محصول PCR حاصل از ژنوم تیمار اول و ردیف سوم محصول PCR حاصل از ژنوم تیمار دوم می باشد. ستونهای شماره1-3:پرایمرOPS-13، ستونهای4-6:پرایمرOPR-12، ستون 7: مارکر، ستونهای شماره8-10:پرایمر OPA-09، ستون 11: مارکر، ستونهای شماره12-14:پرایمرOPT-17، ستونهای شماره15-17:پرایمرOPS-09
20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
تصویر5- باندهای مربوط به تکثیر محصول PCR روی ژل آگارز. هر ستون برای یک پرایمر به ترتیب از سمت چپ، ردیف اول محصول PCR حاصل از ژنوم نمونه شاهد، ردیف دوم محصول PCR حاصل از ژنوم تیمار اول و ردیف سوم محصول PCR حاصل از ژنوم تیمار دوم می باشد. ستونهای شماره1-3:پرایمرOPB-08، ستونهای4-6:پرایمرOPA-11، ستون7:مارکر،ستونهای شماره 8-10:پرایمرOPB-07، ستونهای شماره11-13: پرایمرOPC-09، ستون14:مارکر، ستونهای شماره15-17:پرایمرOPT-14، ستونهای شماره 18-20پرایمرOPS-11
14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
تصویر6- باندهای مربوط به تکثیر محصول PCRروی ژل آگارز. هر ستون برای یک پرایمر به ترتیب از سمت چپ، ردیف اول محصول PCR حاصل از ژنومنمونه شاهد، ردیف دوم محصول PCR حاصل از ژنوم تیمار اول و ردیف سوم محصول PCR حاصل از ژنوم تیمار دوم می باشد.ستونهای شماره1-3:پرایمرOPA-10، ستونهای4-6:پرایمرOPQ-17، ستون7:مارکر،ستونهای شماره8-10:پرایمرOPS-03، ستونهای شماره11-13: پرایمرOPR-11، ستون14:مارکر
جدول 3– نتایج باندهی مربوط به پرایمرها
پرایمر |
OPS- 11 |
OPR- 12 |
OPA- 09 |
|||||||||||||
اندازه قطعه (bp) |
3000 |
2000 |
1500 |
3000 |
1600 |
700 |
600 |
300 |
3000 |
1700 |
1500 |
1400 |
950 |
850 |
700 |
250 |
شاهد |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
تیمار 1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
تیمار 2 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
1 |
جدول 4– نتایج باندهی مربوط به پرایمرها
پرایمر |
OPT- 17 |
OPS- 09 |
OPB- 08 |
OPA- 11 |
OPS- 07 |
|||||||||||
اندازه قطعه (bp) |
3000 |
2800 |
1700 |
600 |
1700 |
2500 |
1800 |
1400 |
1000 |
350 |
2000 |
1500 |
1000 |
800 |
450 |
1800 |
شاهد |
0 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
0 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
تیمار 1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
1 |
1 |
0 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
0 |
1 |
تیمار 2 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
جدول 5– نتایج باندهی مربوط به پرایمرها
پرایمر |
OPC- 09 |
OPT-14 |
OPS -11 |
OPR- 11 |
||||||||||||
اندازه قطعه (bp) |
3000 |
1300 |
900 |
700 |
1900 |
1800 |
1400 |
900 |
800 |
700 |
1700 |
1400 |
1300 |
600 |
400 |
1400 |
شاهد |
1 |
1 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
تیمار 1 |
1 |
1 |
1 |
0 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
0 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
تیمار 2 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
1 |
جدول 6– نتایج باندهی مربوط به پرایمرها
پرایمر |
OPA- 10 |
OPQ-17 |
OPS- 03 |
|||||||||||||
اندازه قطعه (bp) |
3000 |
2800 |
1400 |
1000 |
900 |
800 |
700 |
500 |
1800 |
1000 |
700 |
2800 |
1800 |
500 |
400 |
250 |
شاهد |
30 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
تیمار 1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
تیمار 2 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
جدول 7- ماتریکس تشابه
Dice (Czekanowski or Sorenson) Measure |
Case |
||
تیمار2 |
تیمار1 |
کنترل |
|
|
|
0000000/1 |
کنترل |
|
0000000/1 |
6590909/0 |
تیمار1 |
0000000/1 |
56833803/0 |
4800000/0 |
تیمار2 |
در شکل شماره 7، دندروگرام که با روش UPGMA در نرم افزار NTSYS-PC به منظور مقایسه تنوع ژنتیکی ایجاد شده بین نمونه کنترل و تیمار شده با نانوذرات اکسید مس رسم گردید. مشاهده شد که نمونه کنترل و نمونه تیمار1 در یک شاخه و تیمار 2 در شاخه جداگانه قرار گرفته اند که این بیانگر ایجاد تفاوت ژنتیکی بین آنها میباشد.
بحث
در این تحقیق مشاهده شد که رشد باکتری بعد از 2 و4 ساعت تیمار با غلظت 30 و60 میکروگرم بر میلی لیتر نانوذرات اکسید مس به طور کامل متوقف گردید پس با توجه به این تحقیقات می توان نتیجه گرفت که نانوذرات مس با این غلظت بیشترین فعالیت ضدمیکروبی را در کمترین زمان از خود نشان میدهند. همچنین در مقاله تحقیقی دکترنایاک و همکاران در سال (2013) میلادی نیز از غلظتهای 25 و45 میکروگرم بر میلی لیتر نانوذرات اکسید مس استفاده شده است(16).
شکل7- دندروگرام حاصل از تجزیه بر اساس آزمون رپید با روش UPGMAتوسط نرم افزار NTSYS –PC
سلوارانی وهمکارانش در سال (2013) میلادی از نانو ذرات اکسید مس با اندازه های 17.85 و44 استفاده نمودند و در این بررسی بیشترین اثر مهار کنندگی برای باکتری پسودوموناس آئروژینوزا نشان داده شد(15). در این مطالعه غلظت مشخصی از نانوذرات اکسید مس جهت تیمار باکتریها و بررسی خاصیت ضد میکروبی به کار برده شد و با توجه به اینکه براساس مطالعات زیادی اثر نانوذرات اکسید مس به عنوان ماده ضد میکروبی به اثبات رسیده است (18و23). بنابراین هدف اصلی این تحقیق بررسی اثر نانوذرات اکسید مس روی ژنوم باکتری می باشد که تفاوت ژنتیکی بین تیمار 1 با نمونه کنترل در یک شاخه و نمونه تیمار 2 در شاخه جداگانه در دندروگرام حاصل از تجزیه بر اساس آزمون RAPD-PCR مشاهده می گردد، به عبارتی یعنی غلظت 60 میکرو گرم بر میلی لیتربیشترین اثر مهار کنندگی را از طریق تاثیر روی ژنوم دارا می باشد. همان طور که در جدول 6 دیده شد فاصله ژنتیکی بین نمونه ها از 0000000/1 تا 4800000/0 متغییر بوده که هر چه اعداد به 1 نزدیک تر، شباهت ژنتیکی بین نمونهها بیشتر شده است. همچنین این بررسی به منظورتعیین اثرژنوتوکسیک نانوذرات اکسید مس برروی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس به عنوان مدل برای باکتریهای گرم مثبت صورت گرفت. در این راستا از مجموع 15 پرایمر به کار رفته در واکنش RAPD-PCR وجود یا فقدان باند در تصویر ژل حاکی از ایجاد تغییر توالی DNAتوسط نانوذرات اکسید مس میباشد. به طوری که تعداد زیادی ازپرایمرها توالیهای هدف را شناسایی نکرده و لذا قطعه مربوطه تکثیر پیدا نکرده و فقدان باند روی ژل آگاررز گردید. تفاوت بین باندهای مشاهده شده در گروههای تیمار شده و کنترل باکتریها حاکی از آن است که توالیهای هدف پرایمرها دستخوش تغییراتی در باکتریهای تیمار شده، گردیدهاند که باعث تفاوت در اتصال پرایمرها و تکثیر قطعات در PCR به واسطه آنها شده است. دلیل این موضوع میتواند احتمالاً ناشی از ایجاد جهش مستقیم یا غیرمستقیم رویDNA، توسط نانوذرات اکسید مس بوده و یا همانطوری که پال و همکارانش در سال (2007) گزارش کردهاند به خاطر ایجاد اختلال در مکانیسم همانندسازی توسط DNA polymerase میشود. به طوری که احتمالاً صحت همانند سازی را مختل مینماید تا بدین گونه در خلال همانندسازی تغییراتی در توالیهای DNA ایجاد شود که منجر به بروز تفاوت در توالیهای هدف مورد اتصال پرایمرهای RAPD شود(19). بوندارنکوو همکارانش در سال (2012) میلادی، در تحقیق خود بیان نمودند نانوذرات اکسید مس، با آمین و گروههای کربوکسیل روی سطح سلولهای میکروبی واکنش داده و همچنین در طی واکنش اکسیداسیون مس (I)Cu به (II)Cu،Ros تولید می کنند که باعث آزاد شدن رادیکالهای هیدروکسیل میشود که به پروتئینهای ضروری و DNA آسیب رسانده و باعث فعالیت ضد باکتریایی میشود(6 و21). دکتر جوانگ نینگ و همکارانش در سال (2011) میلادی، اثر نانو ذرات اکسید مس در غلظتهای بین 10 و 100 میکروگرم بر میلی لیتر نسبت به طیف گسترده ای از باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی از جمله باسیلوس سوبتیلیس، پسودوموناس آئروژینوزا، اشریشیا کلی و استافیلوکوک اورئوس گزارش کردند(9). تغییرات مشاهده شده در توالی DNA دراین تحقیق همچنین میتوانند عاملی برای بازدارندگی رشد و چرخه سلولی ازطریق بروز جهشها و به دنبال آن تغییر بیان ژنهای مرتبط با رشد و کنترل چرخه سلولی باشند (25). در سال 2004، سوندی و همکارانش نشان دادهاند که نانوذرات در روی آنزیمهای دخیل در همانند سازی اثر میگذارند(22).در تحقیقات صورت گرفته توسط دکتر کینگ درسال 2006 میلادی، مشخص شده است که اتصال قوی نانوذرات به غشای بیرون باکتریها، میتواند مانع از عملکرد آنزیم دهیدروژناز گردد. جلوگیری از فعالیت آنزیمهای پری پلاسمیک باکتری و در نتیجه جلوگیری از فعالیت و عملکرد DNA ، RNA و سنتز پروتئین نیز دیده شده است. در مجموع این مهار فعالیتها منجر به لیز سلولی خواهد شد (13). در بررسیهای صورت گرفته توسط آقای مارتل که مصادف با 2005 میلادی بود، نشان داده شد که نانو مواد، چسبیدن سلولهای باکتری و تشکیل بیوفیلم را به تأخیر میاندازد که این عمل باعث میشود گروهی از باکتریها نتوانند تثبیت شوند و تکثیر یابند (14). بر همین اساس و باتوجه به اینکه در این تحقیق باکتریهای در حال رشد و همانندسازی با نانوذرات اکسید مس تیمار داده شد، می توان چنین استدلال کرد که احتمالاً در حین همانندسازی و همچنین در مکانیسمهای ترمیمی که توسط آنزیمهای مرتبط انجام میگیرد اختلال ایجاد میکند تا موجب جهشهای متعدد در توالی بازی DNA شود. لذا میتوان نتیجه گرفت که با ایجاد جهش در ژنهای درگیر در کنترل چرخه سلولی موجب توقف چرخه سلولی می گردد که نتیجه مشاهده شده در این تحقیق نیز کاهش رشد باکتریها را نشان داده و مطلب فوق را تأیید می نماید.
تقدیر و تشکر
بدینوسیله از گروه بیوتکنولوژی دانشگاه دولتی مراغه به دلیل همکاری صمیمانه در تأمین نانوذرات و پرایمرهای مورد استفاده سپاسگذاری میگردد.