نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری/ دانشگاه گیلان

2 عضو هیات علمی/ دانشگاه گیلان

3 عضو هیات علمی/ دانشگاه تربیت مدرس

4 عضو هیات علمی/دانشگاه شهید مدنی آذربایجان

5 عضو هیات علمی/ دانشگاه تهران

چکیده

ترمولیزین یک پروتئاز گرمادوست با کاربرد در صنعت به ویژه سنتز پپتید بوده و از باکتری باسیلوس ترموپروتئولیتیکوس به دست می آید. مطالعات قبلی نشان داده است که نمک کلرید سدیم باعث فعال سازی آنزیم می شود. ترمولیزین دارای چهار یون کلسیم ساختاری می باشد که در پایداری آن در برابر دما حائز اهمیت اند. در مطالعه حاضر، نقش کلسیم در فعال سازی آنزیم توسط نمک بررسی گردید. فعالیت آنزیم در حضور سوبسترای FAGLA در حضور نمک کلرید سدیم 2 مولار و در حضور و عدم حضور کلرید کلسیم 10 میلی مولار بررسی شد. به علاوه، طیف‌سنجی دورنگ نمایی دورانی و فلورسانس به منظور درک تغییرات ساختاری ترمولیزین در حضور نمک و حضور و عدم حضور کلرید کلسیم مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج نشان داد که میزان فعالیت آنزیم در حضور FAGLA وکلرید کلسیم 10 میلی مولار 5/2 برابر افزایش یافت. نتایج طیف‌سنجی دورنگ نمایی دورانی پیشنهاد نمود که ساختار کلی ترمولیزین طی فعال سازی نمک وابسته به کلسیم تغییر نکرده و مطالعات فلورسانس نشان داد که جایگاه فعال تحت تاثیرکلسیم دستخوش تغییر شده است. بنابر نتایج بدست آمده از مطالعه حاضر، اتصال یون های کلسیم می‌تواند بر میزان فعال سازی ترمولیزین توسط نمک موثر می‌باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The effect of calcium on the activation of thermolysin by salt

نویسنده [English]

  • Abdolali Varasteh 1

چکیده [English]

Thermolysin, obtained from bacillus thermoproteolyticus, is a thermophilic protease having application in peptide synthesis. Previous studies have revealed that salt activates the enzyme. Thermal stability of TLN is critically dependent on four calcium ions bound in N- and C-terminal domains. The aim of present study is unraveling the role of calcium ions in the salt activation of enzyme. On the presence of NaCl 2 M, measurement of the activity of enzyme in the absence and presence of CaCl2 10 mM using FAGLA as substrate showed activation of enzyme using FAGLA and in the presence of CaCl2 10 mM increased 2.5 times. Circular dichroism and fluorescence spectroscopies were used to understand the calcium dependent changes in the enzyme structure. Circular dichroism spectra suggest that the overall structure of thermolysin has not changed during salt and calcium activation. However, fluorescence studies revealed that the active site has changed under calcium-dependent salt activation. According to the results of the present study, the binding of calcium ions might influence the activation of thermolysin by salt.

کلیدواژه‌ها [English]

  • thermolysin
  • activity
  • sodium chloride
  • Calcium

اثر کلسیم بر فعال­سازی ترمولیزین توسط نمک کلرید سدیم

عبدالعلی وارسته1، سید محسن اصغری1*، مجید تقدیر2، محمود رضا آقا معالی1، محمد پاژنگ3 و فرامرز مهرنژاد4

1رشت، دانشگاه گیلان، دانشکده علوم پایه 

2تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی 

3تبریز، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، دانشکده علوم پایه 

4تهران، دانشگاه تهران، دانشکده علوم و فنون نوین

تاریخ دریافت: 18/3/95                تاریخ پذیرش: 31/5/95

چکیده

ترمولیزین یک پروتئاز گرمادوست با کاربرد در سنتز پپتید بوده و از باکتری باسیلوس ترموپروتئولیتیکوس به دست می­آید. مطالعات قبلی نشان داده است که نمک کلرید سدیم باعث فعال­سازی آنزیم می­شود. پایداری حرارتی ترمولیزین به شدت وابسته به 4 یون کلسیم بوده که به دمین­های انتهای آمینو و کربوکسیل متصل شده­اند. در مطالعه حاضر، نقش کلسیم در فعال­سازی آنزیم توسط نمک کلرید سدیم بررسی گردید. فعالیت آنزیم در حضور سوبسترای FAGLA در حضور نمک کلرید سدیم 2 مولار و در حضور و عدم حضور کلرید کلسیم 10 میلی­مولار بررسی شد. به علاوه، طیف­سنجی دورنگ نمایی دورانی در ناحیه دور و فلورسانس به منظور درک تغییرات ساختاری ترمولیزین در حضور نمک کلرید سدیم و حضور و عدم حضور کلرید کلسیم مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج نشان داد که میزان فعالیت آنزیم در حضور FAGLA وکلرید کلسیم 10 میلی­مولار 5/2 برابر افزایش یافت. نتایج طیف­سنجی دورنگ نمایی دورانی در ناحیه دور پیشنهاد نمود که ساختار کلی ترمولیزین طی فعال­سازی نمک وابسته به کلسیم تغییر نکرده و مطالعات فلورسانس نشان داد که جایگاه فعال تحت تأثیرکلسیم دستخوش تغییر شده است. بنابر نتایج به دست آمده از مطالعه حاضر، اتصال یونهای کلسیم می­تواند بر میزان فعال­سازی ترمولیزین توسط نمک کلرید سدیم مؤثر باشد.

واژه های کلیدی: ترمولیزین، فعالیت آنزیمی، کلرید سدیم، کلسیم.

* نویسنده مسئول، تلفن: 01333333647، پست الکترونیکی: sm_asghari@guilan.ac.ir

مقدمه

 

ترمولیزین [EC 3.4.24.27]، حاصل از باکتری باسیلوس ترموپروتئو لیتیکوس، کاربرد فراوانی در زیست فناوری و صنایعی همچون صنایع غذایی، داروسازی و سنتز پپتید داشته و از پایداری حرارتی بالایی برخوردار است (10). ترمولیزین اولین آنزیم ترموفیل بوده که ساختار در حالت بلور آن در سال 1972 تعیین شده (6) و به عنوان یک آنزیم مدل مورد مطالعه قرار گرفته است. این آنزیم در دمین انتهای آمینی غنی از صفحات بتا و در دمین انتهای کربوکسی دارای مارپیچهای آلفا می­باشد (8 و 9). ترمولیزین هیدرولیز پیوند­های پپتیدی را به­ویژه در محل باقی­مانده­های آب­گریز کاتالیز می­کند (8) و به طور گسترده در تشکیل پیوند پپتیدی از طریق واکنش معکوس هیدرولیز مورد استفاده قرار می­گیرد (10). این پروتئین از 316 اسید آمینه تشکیل شده و از یک اتم روی برای فعالیت و چهار اتم کلسیم برای پایداری ساختاری تشکیل شده است (7، 13، 15 و 16). چهار جایگاه اتصال کلسیم در ترمولیزین به ترتیب Ca1 تا Ca4 نام­گذاری شده­اند. کلسیمهای متصل به ترمولیزین برخی دارای اتصال محکم و بعضی دارای اتصال ضعیف می­باشند. از بین چهار یون کلسیم مذکور، Ca1 با تمایل بالا و Ca3 با تمایل کم به آنزیم اتصال یافته­اند اما در مورد تمایل آنزیم به اتصال به دو جایگاه دیگر شامل Ca2 و Ca4 اختلاف نظر وجود دارد.

مطالعاتی که تاکنون بر روی جایگاههای اتصال کلسیم در ترمولیزین صورت گرفته به طور عمده بر نقش آنها بر پایداری حرارتی آنزیم استوار بوده است. در مطالعات قبلی مشخص شده که افزایش کلرید سدیم تا غلظت چهار مولار باعث افزایش فعالیت تا حد 6 الی 7 برابر می­شود (11)، اما تاکنون اطلاعاتی پیرامون نقش یونهای کلسیم در فعال­شدن آنزیم در دسترس نیست. هدف از تحقیق حاضر بررسی نقش یونهای کلسیم بر فعال­سازی ترمولیزین توسط نمک است. بدین منظور فعال­سازی آنزیم توسط نمک در عدم حضور و غلظت 10 میلی­مولار کلرید کلسیم مورد بررسی قرار گرفت. همچنین در حضور و عدم حضور کلسیم تغییرات ساختاری آنزیم با استفاده از روشهای طیف­سنجی دورنگ نمایی دورانی ناحیه دور و فلورسانس ذاتی مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

مواد: آنزیم ترمولیزین از شرکت سیگما ،(St. Louis, MO. USA) و FAGLA از شرکت Bachem خریداری شد. سایر مواد استفاده شده از شرکت مرک آلمان (Darmstadt, Germany) خریداری شد.

سنجش فعالیت با استفاده از سوبسترای FAGLA: فعالیت پروتئازی آنزیم با استفاده از FAGLA، که یک سوبسترای کروموژن برای خانواده ترمولیزین است، مورد بررسی قرار گرفت (12). هیدرولیز FAGLA توسط ترمولیزین از طریق کاهش جذب در 345 نانومتر اندازه­گیری شد. میزان FAGLA هیدرولیز شده با استفاده از اختلاف جذب مولی ناشی از هیدرولیز (Δε345 = -310 M-1 cm-1) در 25 درجه سانتی­گراد به­دست آمد. مخلوط واکنش (400 ماکرولیتر) شامل تریس 50 میلی­مولار، pH 7.5، CaCl2 5 میلی مولار، تریتون X-100 01/0 درصد و 50 میکرولیتر FAGLA 20 میلی­مولار می­باشد که در DMSO حل شده است. غلظت نهایی آنزیم 20 میکروگرم بر میلی لیتر بود. یک یونیت فعالیت آنزیمی برابر با مقدار آنزیم مورد نیاز برای شکستن یک میکرومول FAGLA در یک دقیقه و در دمای اتاق می­باشد.

مطالعات فلورسانس ذاتی: فلورسانس ذاتی ترمولیزین در بافر تریس 50 میلی­مولار 5/7 pH اندازه­گیری شد. غلظت نهایی آنزیم در مطالعات فلورسانس ذاتی 5 میکروگرم بر میلی­لیتر بوده است. طول موج برانگیختگی 295 نانومتر و طول موج نشر 300 تا 400 نانومتر بود. سرعت طیف­گیری 500، Slit برانگیختگی و نشر 10 و دمای طیف­گیری 25 درجه سانتی­گراد بود.

دورنگ نمایی دورانی ناحیه دور: طیف دورنگ نمایی دورانی ناحیه دور جهت بررسی ساختار دوم ترمولیزین در حضور نمک و حضور و عدم حضور کلسیم، پس از انکوبه شدن به مدت 10 دقیقه، توسط دستگاه اسپکترومتر JASCO J-715 ثبت گردید. نتایج به صورت بیضی­واری مولی  [θ] (deg cm2 dmol-1) و بر اساس رابطه [θ] = (θ×100MRW)/(cl) تعیین گردید که در آن C غلظت پروتئین بر حسب میلی­گرم بر میلی­لیتر، l طول مسیر نور و θ بیضی­واری اندازه­گیری شده در دامنه طول موج فرابنفش دور می­باشد (14).

نتایج

دورنگ نمایی دورانی ناحیه دور: به منظور درک اینکه آیا فعالیت در حضور نمک با تغییراتی در ساختار ترمولیزین همراه می­باشد، طیف­سنجی دورنگ نمایی ناحیه دور در حضور و عدم حضور کلرید کلسیم 10 میلی­مولار و در حضور کلرید سدیم 2 مولار انجام شد. همان­گونه که در شکل 1 مشاهده می­شود پیک 197 نانومتر که مربوط به ساختار بتا می­باشد اندکی کاهش پیدا کرده است.

شکل 1- طیف دورنگ نمایی دورانی ناحیه دور آنزیم ترمولیزین در حضور نمک 2 مولار(خط پیوسته) و در حضور نمک 2 مولار و کلسیم10 میلی­مولار (خط چین).

طیف فلورسانس ذاتی: به علاوه، تغییرات ساختاری القاء شده توسط نمک در حضور و عدم حضور کلسیم در آنزیم از طریق فلورسانس ذاتی بررسی شد. با توجه به شکل 2 مشاهده می­شود که اضافه شدن کلسیم موجب شده نشر فلورسانس به مقدار قابل توجهی کاهش یابد، به طوری­که حداکثر شدت فلورسانس در عدم حضور کلسیم 594 و در حضور کلسیم 497 می­باشد.

فعالیت آنزیم: به­منظور درک این نکته که فعال­سازی آنزیم به­وسیله نمک تحت تأثیر اتصال یونهای کلسیم به جایگاههای ضعیف قرار دارد، فعالیت آنزیم در حضور FAGLA و در حضور نمک 2 مولار و عدم حضور و حضور کلسیم 10 میلی­مولار بررسی شد.

 

شکل 2- طیف نشری آنزیم ترمولیزین در حضور نمک 2 مولار (خط پیوسته) و در حضور نمک 2 مولار و کلسیم 10 میلی­مولار (خط چین).

نتایج نشان داد که Km آنزیم از 72/0 میلی­مولار در عدم حضور کلسیم به 22/0 میلی­مولار در حضور کلسیم 10 میلی­مولار کاهش یافته­است. همچنین میزان kcat آنزیم از 79/0 بر ثانیه در عدم حضور کلسیم به 56/0 در ثانیه در حضور 10 میلی­مولار کلسیم کاهش یافت. در مجموع، میزان کارآیی کاتالیتیک (kcat/Km) آنزیم در حضور FAGLA حدوداً به میزان 5/2 برابر در کلسیم 10 میلی­مولار در مقایسه با عدم حضور کلسیم افزایش یافت (جدول 1).

ساختار سه بعدی آنزیم ترمولیزین با کد ورودی 1TLX در پایگاه داده www.rcsb.org در شکل 3 نشان داده شده است.

 

جدول 1- پارامتر­های سنتیکی ترمولیزین در حضور نمک 2 مولار و عدم حضور و حضور کلسیم 10 میلی­مولار.

 

پارامتر­های سنتیکی

[CaCl2], mM

 

Km, (M-1×10-3)

kcat (sec-1)

kcat/Km (M-1sec-1×10-3)

0

0.72 ± 0.04

0.79 ± 0.04

1.10 ± 0.01

10

0.22 ± 0.01

0.56 ± 0.02

2.54 ± 0.03

 

 

شکل 3- ساختار در حالت بلور آنزیم ترمولیزین

دورنگ نمایی دورانی ناحیه دور: مطالعات دورنگ نمایی دورانی ناحیه دور نشان داد که در پیک 197 نانومتر، به دنبال اتصال کلسیم به ساختار، کاهش مشاهده گردید. این پیک مربوط به ساختمان بتا می­باشد. از طرفی همان­گونه که در مقدمه اشاره شد صفحات بتا در دمین انتهای آمینو قرار دارند، بنابراین احتمالاً در حضور کلرید کلسیم 10 میلی­مولار، یون کلسیم به جایگاه Ca3 ،که تمایل کمی به کلسیم دارد، متصل شده و موجب تغییر در انتهای آمینی می­شود.

فلورسانس ذاتی: مطالعات صورت گرفته با کمک فلورسانس تأیید می­نماید که ریز­محیط اطراف آمینو­اسید­های تریپتوفان دست­خوش تغییر شده است. ترمولیزین حاوی سه باقی­مانده تریپتوفان می­باشد که عبارتند از تریپتوفان 55، 115 و 186. از این میان تریپتوفان 55 در نزدیکی Ca3 قرار گرفته است. با توجه به کاهش نشر فلورسانس در حضور کلسیم 10 میلی­مولار، به نظر می­رسد که ریز­محیط تریپتوفان (ها) پس از اتصال به کلسیم قطبی­تر شده، بدین معنی که احتمالاً حلقه ایندول تریپتوفان به دنبال اتصال کلسیم دستخوش جا به جایی شده و در ریز­محیط قطبی­تری قرار گرفته است. البته این احتمال هم دور از ذهن نیست که همین اتفاق در ریز­محیط تریپتوفان 186، که در مجاورت Ca1 قرار دارد، رخ داده باشد.

بحث

بررسی فعالیت آنزیم در حضور نمک 2 مولار و عدم حضور و حضور کلسیم 10 میلی­مولار نشان داد که حضور کلسیم باعث افزایش فعالیت آنزیم می­گردد(1 و 3). در تحقیقات قبلی اشاره کرده­اند که کلسیم تأثیری بر فعالیت نداشته، با این حال، اصغری و همکاران نشان دادند که به دنبال اتصال یون کلسیم به یک جایگاه اتصال کلسیم مهندسی شده در یک Zn- متالوپروتئاز همولوگ، الاستاز حاصل از سودوموناس آئروجینوزا، خصوصیات سنتیکی آنزیم جهش یافته شامل هر دو پارامتر Km و kcat دست­خوش تغییر شده­اند (2). ترمولیزین در حین فرآیند کاتالیز آنزیمی دستخوش فرآیندی موسوم به hinge-bending می‍گردد (15 و 17). در این فرآیند جایگاه فعال آنزیم که بین دو دمین واقع است، به دنبال اتصال سوبسترا به آنزیم، متحمل ساختاری موسوم به "ساختار بسته" می­شود. در مقابل وقتی جایگاه فعال خالی از سوبسترا است "ساختار باز" مشاهده می­شود. تحقیقات اخیر نشان می­دهند که اتصال کلسیم به جایگاه (های) با تمایل اتصال کم موجب تغییر زاویه لولا شده و بر پارامتر­های سنتیکی ترمولیزین مؤثر است (4). داده­های طیف سنجی دورنگ نمایی دورانی ناحیه دور و فلورسانس نیز مؤید تغییرات ساختاری در پروتئین می­باشد. همین توضیح در مورد اثر توأم کلرید کلسیم و کلرید سدیم بر فعالیت آنزیم قابل بیان می­باشد. این زاویه بر تمایل آنزیم جهت اتصال به سوبسترا و همچنین بر دینامیک جایگاه فعال و در نتیجه ثابت سرعت واکنش کاتالیز (kcat) مؤثر است (5). بر این اساس، احتمالاً، تغییرات مشاهده شده در خصوصیات سنتیکی آنزیم، به دنبال اتصال کلسیم، می تواند به تغییر در ناحیه لولا مرتبط باشد.

سپاسگزاری

نویسندگان از معاونت پژوهشی دانشگاه گیلان به خاطر حمایت مالی و فراهم کردن امکانات آزمایشگاهی، بسیار سپاسگزارند.

1- اسماعیل نژاد، م.، زین الدینی، م.، مقصودی، ن. 1394. مطالعه اهمیت و نقش اسیدهای آمینه آسپارژین 28 و لیزین 30 فوتوپروتئین اکورین در جذب کلسیم. مجله پژوهش­های سلولی و مولکولی. دوره 28. شماره 4. ص 468-474.

2- رحمانی، ح.، اصغری، س. م.، ابراهیمی، س.، صدرممتاز، ا.، تقدیر، م. 1391. مطالعه خصوصیات بیوشیمی الاستاز حاصل از باکتری سودوموناس آئروجینوزا سویه ی PTCC1430. مجله تازه های بیوتکنولوژی سلولی. دوره 2. شماره 8. ص 77-73.

3- صدر ممتاز، ا.، اصغری، س. م. 1394. مطالعات مقایسه‌ای مقاومت پروتئازحاصل ازسودوموناس آئروجینوزا در مقایسه با ترمولیزین حاصل از باسیلوس ترموپروتئولیتیکوس در حلال‌های آلی. مجله پژوهش­های سلولی و مولکولی. دوره 28. شماره 4. ص 560-567.

 

4- Asghari, S. M., Isazadeh, M., Taghdir, M. 2016. The relevance of low-affinity Ca-binding sites to the structure, stability and kinetic properties of thermolysin. Journal of the Iranian Chemical Society. 1-8.

5- Asghari, S. M., Pazhang, M., Ehtesham, S., Karbalaei-Heidari, H. R., Taghdir, M., Sadeghizadeh, M., Khajeh, K. 2010. Remarkable improvements of a neutral protease activity and stability share the same structural origins. Protein Engineering Designand Selection,23(8), 599-606.

6- Colman, P., Jansonius, J., & Matthews, B. 1972. The structure of thermolysin: an electron density map at 2.3 Å resolution. Journal of molecular biology, 70(3), 701-724.

7- Feder, J., Garrett, L. R., & Wildi, B. S. 1971. Role of calcium in thermolysin. Biochemistry,10(24), 4552-4556.

8- Hangauer, D. G., Monzingo, A. F., & Matthews, B. W. 1984. An interactive computer graphics study of thermolysin-catalyzed peptide cleavage and inhibition by N-carboxymethyl dipeptides. Biochemistry,23(24), 5730-5741.

9- Holmes, M., & Matthews, B. W. 1982. Structure of thermolysin refined at 1.6 Å resolution. Journal of molecular biology,160(4), 623-639.

10- Inouye, K. 2003. Handbook of food enzymology. eds. Whitaker JR, Voragen AGJ, andWong DWS, Marcel Dekker, New York, 1019-1028.

11- Inouye, K. I. 1992. Effects of salts on thermolysin: activation of hydrolysis and synthesis of N-carbobenzoxy-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester, and a unique change in the absorption spectrum of thermolysin. Journal of biochemistry,112(3), 335-340.

12- Kawasaki, Y., Yasukawa, K., & Inouye, K. 2013. Effects of site-directed mutagenesis in the N-terminal domain of thermolysin on its stabilization. Journal of biochemistry,153(1), 85-92.

13- Latt, S. Holmquist. B., and Vallee, BL 1969. Thermolysin: A zinc metalloenzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun,37, 333-339.

14- Ranjbar, B., & Gill, P. 2009. Circular Dichroism Techniques: Biomolecular and Nanostructural Analyses‐A Review. Chemical biology & drug design,74(2), 101-120.

15- Tajima, M., Urabe, I., Yutani, K., & Okada, H. Role of calcium ions in the thermostability of thermolysin and Bacillus subtilis var. amylosaccharolyticus neutral protease. 1976. Eur. J. Biochem,64, 243-247.

16- Titani, K., Hermodson, M., Ericsson, L., Walsh, K., & Neurath, H. 1972. Amino-acid sequence of thermolysin. Nature,238(80), 35-37.

17- Veltman, O. R., Eijsink, V. G., Vriend, G., de Kreij, A., Venema, G., & Van den Burg, B. 1998. Probing catalytic hinge bending motions in thermolysin-like proteases by glycine→ alanine mutations. Biochemistry,37(15), 5305-5311.